Ibrutinib抑制彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞生存的作用研究*

吳東維 夏冰 吳凌 許雯 寧喬楊 袁田 王超雨 晉鑫 于泳 張翼鷟

·基礎(chǔ)研究·

Ibrutinib抑制彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞生存的作用研究*

吳東維 夏冰 吳凌 許雯 寧喬楊 袁田 王超雨 晉鑫 于泳 張翼鷟

目的：探討B(tài)ruton酪氨酸激酶（Bruton's tyrosine kinase，BTK）抑制劑ibrutinib抑制彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）細(xì)胞生存的作用及其相關(guān)機(jī)制。方法：用不同濃度的ibrutinib處理DLBCL細(xì)胞系SUDHL-10、HBL-1和患者原代細(xì)胞，以MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖抑制情況；以Annexin V/PI流式細(xì)胞術(shù)和DAPI染色法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況；應(yīng)用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)磷酸化BTK、AKT、ERK的變化。DLBCL細(xì)胞與MSC共培養(yǎng)后，體外克隆形成實(shí)驗(yàn)和NOD/SCID腫瘤模型小鼠檢測(cè)ibrutinib在腫瘤微環(huán)境里對(duì)DLBCL細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果2.5μmol/L及更高濃度的ibrutinib對(duì)DLBCL細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴(lài)性。1.0、2.5μmol/L ibrutinib作用于SUDHL-10細(xì)胞24 h，細(xì)胞凋亡率分別為（21.73±3.64）%和（34.71±2.36）%，高于對(duì)照組（3.55±1.89）%（P＜0.05）。5、10μmol/L ibrutinib處理24 h后，DLBCL細(xì)胞系均出現(xiàn)核皺縮（5μmol/L）、碎裂（10μmol/L）。ibrutinib處理細(xì)胞后磷酸化BTK、AKT、ERK的表達(dá)均明顯降低。ibrutinib抑制共培養(yǎng)時(shí)DLBCL細(xì)胞的體外克隆形成（P＜0.01）及DLBCL細(xì)胞在體內(nèi)的增殖生長(zhǎng)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：ibrutinib可抑制細(xì)胞系SUDHL-10和HBL-1的增殖，誘導(dǎo)凋亡，其機(jī)制可能通過(guò)阻斷AKT、ERK信號(hào)途徑而實(shí)現(xiàn)；在腫瘤微環(huán)境中ibrutinib同樣對(duì)DLBCL細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制生存的作用，該藥物有望為DLBCL的治療帶來(lái)希望。

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤 ibrutinib 增殖 凋亡

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）是成人非霍奇金淋巴瘤中最常見(jiàn)的一種病理類(lèi)型［1］。近年來(lái)很多新藥的出現(xiàn)使該病的生存期明顯延長(zhǎng)，但DLBCL目前仍然是不可治愈的一類(lèi)疾病［2］。因此，深入探索DLBCL更有效的治療藥物是目前淋巴瘤研究領(lǐng)域的重要課題。近年來(lái)，針對(duì)B細(xì)胞受體（B-cell receptor，BCR）信號(hào)通路重要靶點(diǎn)Bruton酪氨酸激酶（Bruton's tyrosine kinase，BTK）的靶向抑制劑ibrutinib因其較好的療效已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)應(yīng)用于慢性淋巴細(xì)胞白血病的一線治療和套細(xì)胞淋巴瘤的二線治療中［3-4］；同時(shí)，ibrutinib治療復(fù)發(fā)/難治性DLBCL的多個(gè)臨床試驗(yàn)也在進(jìn)行中，初步結(jié)果令人鼓舞［5］。但該藥對(duì)DLBCL的作用機(jī)制研究的報(bào)道目前尚少。本研究旨在探討ibrutinib抑制DLBCL細(xì)胞的生存并抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）介導(dǎo)的DLBCL細(xì)胞增殖的作用。

作者單位：天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院血液科，國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心（天津市300060）

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系、患者標(biāo)本 DLBCL細(xì)胞系SUDHL-10（GCB亞型）和HBL-1（ABC亞型）由Dr.Jianguo Tao（美國(guó)Moffitt癌癥中心血液病理科）提供。細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中，飽和濕度下培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。患者骨髓穿刺液和淋巴組織均取自天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院血液科8例原發(fā)DLBCL患者，其中ABC亞型6例，GCB亞型2例。本研究已獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及供者的知情同意。收集患者骨髓穿刺液和淋巴組織后，以Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離單核細(xì)胞，再通過(guò)CD19標(biāo)記的磁珠分選法（MiltenyiBiotec，德國(guó)）分選淋巴細(xì)胞群備用。

1.1.2 主要試劑 ibrutinib購(gòu)自美國(guó)Selleck公司；MTT試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；AnnexinV-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；DAPI核酸染色試劑盒購(gòu)自美國(guó)Intitrogen公司；兔抗人BTK、p-BTK（Tyr223）、AKT、p-AKT（Ser473/Thr308）、ERK1/2、p-ERK1/2（Thr202/Tyr204）單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測(cè)淋巴瘤細(xì)胞增殖的抑制率 調(diào)整SUDHL-10、HBL-1細(xì)胞和DLBCL患者原代細(xì)胞濃度為4×104/mL，接種于96孔板中培養(yǎng)6 h。分組如下：對(duì)照組（不加ibrutinib）、調(diào)零組（僅含有等量RPMI 1640培養(yǎng)液）、試驗(yàn)組（ibrutinib藥物終濃度分別為2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0μmoL/L），各組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72h。于預(yù)定時(shí)間取出培養(yǎng)板，每孔加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液后加入DMSO，選擇570 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度A值計(jì)算細(xì)胞活力，細(xì)胞活力=（試驗(yàn)組OD-調(diào)零組OD）/（對(duì)照組OD-調(diào)零組OD）×100%。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)和DAPI核酸染色法檢測(cè)淋巴瘤細(xì)胞的凋亡情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SUDHL-10、HBL-1細(xì)胞和DLBCL患者原代細(xì)胞加入ibrutinib溶液，使藥物終濃度分別為1、2.5μmol/L，于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h。收集各組細(xì)胞行AnnexinV-PI雙染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。調(diào)整ibrutinib終藥濃度分別為5、10μmol/L，于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)48 h，DAPI核酸染色按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，檢測(cè)凋亡細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3 Western blot法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期DLBCL細(xì)胞加入ibrutinib溶液，使藥物終濃度分別為2.5、5.0和7.5μmol/L，于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)6 h。收集上述各組細(xì)胞，用蛋白裂解液充分裂解細(xì)胞，離心后收集上清提取總蛋白。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，均取30μg蛋白行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉后分別加入各蛋白一抗（BTK、p-BTK、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK），洗膜后分別加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，反應(yīng)90min，洗膜后ECL發(fā)光法顯色。

1.2.4 MSC分離培養(yǎng)和共培養(yǎng)體系的建立 骨髓取自2015年1月至2015年5月天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院血液科6例造血干細(xì)胞移植供者，其中男性4例，女性2例，年齡20～40歲，各取骨髓3mL，從中提取單個(gè)核細(xì)胞，再分離和培養(yǎng)MSC，方法參見(jiàn)參考文獻(xiàn)［6］，該研究已獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及供者的知情同意。在6孔板中每孔加入1×105/mL的骨髓MSC，至細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿(mǎn)后棄去低糖DMEM培養(yǎng)液（購(gòu)自美國(guó)Themo Fisher Scientific公司），加入不含胎牛血清的RPMI 1640饑餓培養(yǎng)24h后的1.5×105/mL的DLBCL細(xì)胞與已貼壁的MSC共培養(yǎng)。

1.2.5 克隆形成試驗(yàn) 在6孔板上加入MethoCult甲基纖維素培養(yǎng)基（購(gòu)自加拿大Stem Cell Technologies公司），每孔1.0mL，DLBCL細(xì)胞系SUDHL-10（每孔2.5×103）與MSC（每孔1.0×103）共培養(yǎng)或單獨(dú)培養(yǎng)，以5μmol/L ibrutinib進(jìn)行藥物處理，非藥物處理者為對(duì)照組；2周后，以形成40個(gè)細(xì)胞以上的克隆為1個(gè)集落，以倒置顯微鏡觀測(cè)計(jì)算試驗(yàn)組與對(duì)照組的集落形成情況。

1.2.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 將DLBCL細(xì)胞系HBL-1和MSC以4∶1的比例皮下共同接種于NOD/SCID小鼠（購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，每組5只）或HBL-1單獨(dú)接種，當(dāng)有明顯的腫瘤團(tuán)塊（直徑≥5mm）形成后，以ibrutinib 2.5mg/kg/d對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔內(nèi)注射，連續(xù)治療14d，以未治療者為對(duì)照組，每3 d用卡尺測(cè)量1次腫瘤團(tuán)塊大小。各組小鼠的生存情況均以Kaplan-Meier生存曲線分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。上述試驗(yàn)至少重復(fù)3次，結(jié)果以±s表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ibrutinib抑制DLBCL淋巴瘤細(xì)胞的增殖

MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ibrutinib對(duì)SUDHL-10、HBL-1細(xì)胞和DLBCL患者原代細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，且在一定范圍內(nèi)其抑制作用呈劑量依賴(lài)性，但無(wú)明顯的時(shí)間依賴(lài)性。ibrutinib從2.5μmol/L開(kāi)始，以2.5μmol/L的藥物濃度梯度遞增，到20μmol/L分別作用于SUDHL-10和HBL-1細(xì)胞24、48、72 h，對(duì)照組的細(xì)胞活力為100%，藥物組細(xì)胞活力隨著藥物濃度增加而明顯減低，但3個(gè)時(shí)間點(diǎn)間無(wú)明顯差異（圖1A、B），DLBCL患者原代細(xì)胞組也得到相似結(jié)果（圖1C）。

2.2 Ibrutinib促進(jìn)DLBCL淋巴瘤細(xì)胞的凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示ibrutinib可誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞的凋亡，1.0、2.5μmol/L ibrutinib作用于SUDHL-10細(xì)胞24 h，AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)法顯示其凋亡率分別為（21.73±3.64）%和（34.71±2.36）%，高于對(duì)照組（3.55±1.89）%（P＜0.05，圖2A）；作用于HBL-1細(xì)胞24 h，凋亡率分別為（22.17±1.16）%和（40.40±2.52）%，高于對(duì)照組（5.07±0.57）%（P＜0.05，圖2B）；作用于DLBCL患者原代細(xì)胞24 h，凋亡率分別為（16.02±2.68）%和（30.29±1.35）%，高于對(duì)照組（5.25±0.97）%（P＜0.05，圖2C）；用DAPI染料染細(xì)胞核，熒光顯微鏡下可見(jiàn)經(jīng)ibrutinib處理的細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、溶解等現(xiàn)象，且隨著藥物濃度的增加愈加明顯（圖3）。

2.3 Ibrutinib抑制淋巴瘤細(xì)胞磷酸化BTK、AKT、ERK蛋白的表達(dá)

應(yīng)用Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SUDHL-10、HBL-1細(xì)胞和DLBCL患者原代細(xì)胞均存在磷酸化BTK、AKT和ERK的表達(dá)，經(jīng)ibrutinib處理后，磷酸化BTK、AKT和ERK的表達(dá)明顯下降，且隨藥物劑量的增加而減低（圖4）。

圖1 ibrutinib降低SUDHL10、HBL-1和患者原代細(xì)胞的活力，并呈劑量依賴(lài)性Figure 1 Ibrutinib decreased the viability of SUDHL-10,HBL-1 cell lines,and primary DLBCL cells in a dose-dependent manner

圖2 Annexin-V染色檢測(cè)不同濃度ibrutinib誘導(dǎo)SUDHL10、HBL-1、患者原代細(xì)胞凋亡，呈劑量依賴(lài)性Figure 2 Different concentrations of ibrutinib induced apoptosis of SUDHL-10,HBL-1,and primary DLBCL cells in a dose-dependent manner within Annevin-V binding assay

圖3 DAPI染色后熒光顯微鏡下觀察不同濃度ibrutinib誘導(dǎo)SUDHL10、HBL-1、患者原代細(xì)胞細(xì)胞核的形態(tài)改變（箭頭示對(duì)照組正常細(xì)胞核形態(tài)、ibrutinib 5μM實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞核皺縮、ibrutinib 10μM實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞核碎裂的形態(tài)改變）Figure 3 DAPI staining and verification of the deformation of cell nucleus under a fluorescence microscope after treatment with different ibrutinib concentrations in SUDHL-10,HBL-1,and primary DLBCL cells(Arrows show the morphological changes of the normal nucleus morphology of the control group,nuclear shrinkage of ibrutinib 5μM experimental group and nuclear fragmentation of ibrutinib 10μM experimental group)

圖4 Western blot檢測(cè)不同濃度ibrutinib對(duì)SUDHL10、HBL-1細(xì)胞及患者原代細(xì)胞表達(dá)Btk、p-Btk、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK的抑制Figure 4 Western blot detected the effects of different concentrations of ibrutinib on inhibiting the expression of BTK，p-BTK，Akt，p-Akt，ERK，and p-ERK in SUDHL-10，HBL-1，and primary DLBCL cells

2.4 Ibrutinib抑制MSC促淋巴瘤細(xì)胞克隆形成

體外克隆形成試驗(yàn)結(jié)果顯示：共培養(yǎng)時(shí)DLBCL細(xì)胞克隆形成集落大小、數(shù)量明顯高于單獨(dú)培養(yǎng)；ibrutinib處理后，共培養(yǎng)和單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)的克隆形成均降低（P＜0.01，圖5）。表明在體外，MSC促進(jìn)DLBCL細(xì)胞克隆形成，ibrutinib抑制MSC促淋巴瘤細(xì)胞克隆形成的作用。

2.5 Ibrutinib體內(nèi)抑制MSC促淋巴瘤細(xì)胞生長(zhǎng)

在體內(nèi)皮下成瘤NOD/SCID小鼠模型中，MSC和DLBCL細(xì)胞共同接種時(shí)小鼠腫瘤團(tuán)塊生長(zhǎng)速度高于DLBCL細(xì)胞單獨(dú)接種；ibrutinib治療后，共同接種和單獨(dú)接種小鼠腫瘤團(tuán)塊均減小（P＜0.05，圖6）。說(shuō)明在體內(nèi)，MSC促進(jìn)DLBCL細(xì)胞生長(zhǎng)，ibrutinib抑制MSC促淋巴瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

圖5 倒置顯微鏡觀測(cè)ibrutinib對(duì)共培養(yǎng)和單獨(dú)培養(yǎng)的SUDHL10體外克隆形成的抑制Figure 5 Ibrutinib inhibited the clonogenicity of SUDHL-10 cells in vitro in co-culture and culture alone system under an inverted microscope

圖6 腹腔注射ibrutinib對(duì)NOD/SCID小鼠模型HBL-1體內(nèi)成瘤腫瘤團(tuán)塊生長(zhǎng)的抑制Figure 6 Intraperitoneal-injected ibrutinib inhibited cell growth of HBL-1 cells in a non-obese diabetic/severe combined immunodeficient mouse xenograft model.IBN:ibrutinib

3 討論

DLBCL是我國(guó)非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma，NHL）中最常見(jiàn)的類(lèi)型，約占成人NHL的1/3［7］；在西方國(guó)家DLBCL亦是淋巴瘤中最多發(fā)的病理類(lèi)型［8］。盡管在治療方面，利妥昔單抗及造血干細(xì)胞移植的應(yīng)用極大地改善了DLBCL的治療效果和預(yù)后［9-10］，但目前該病仍不可治愈。因此，深入探索DLBCL發(fā)病的分子機(jī)制及相關(guān)的靶向藥物對(duì)于提高DLBCL的治療效果、改善預(yù)后具有重要的意義。

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)BCR信號(hào)通路為導(dǎo)致B細(xì)胞腫瘤發(fā)生的重要信號(hào)通路［11］。BCR復(fù)合體是膜免疫球蛋白（mIg）、CD79A（Igα）與CD79B（Igβ）組成的寡聚復(fù)合體，前者識(shí)別抗原，后者傳導(dǎo)信號(hào)。抗原與BCR結(jié)合后，CD79A和CD79B的ITAMs區(qū)被酪氨酸激酶LYN及FYN磷酸化，磷酸化的ITAMs募集SYK激酶，SYK被SRC磷酸化、自身磷酸化后活化，SYK進(jìn)一步通過(guò)磷酸化酶?jìng)鬟f信號(hào)通路并募集信號(hào)因子，如BLNK、BCAP、VAV、SHC和PI3K。募集的PI3K致磷酸磷脂酰肌醇-3、4、5（PIP3）的形成并進(jìn)一步活化BTK和AKT。SYK和BTK活化PLCδ2，并促使第二信使三磷酸肌醇-1、4、5（IP3）和二脂酰甘油（DAG）的產(chǎn)生。這些第二信使誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的釋放和PKC的活化，并活化轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB［12-13］。PKC 也誘導(dǎo)PTPN22磷酸酶的表達(dá)，使其去磷酸化并抑制LYN活性，進(jìn)而抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的關(guān)鍵負(fù)性調(diào)節(jié)因子SHIP活化，在缺少SHIP活化的情況下，PIP3繼續(xù)活化AKT，導(dǎo)致BCR存活信號(hào)的大量活化［14］。BCR信號(hào)通路也可通過(guò)一系列信號(hào)分子磷酸化ERK進(jìn)而促使ERK信號(hào)通路的活化，大量BCR信號(hào)通路分子作為B細(xì)胞淋巴瘤治療靶點(diǎn)引起高度關(guān)注［15-16］。

通過(guò)上述信號(hào)通路的活化，導(dǎo)致部分轉(zhuǎn)錄因子的激活，進(jìn)而促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞的生存、增殖并分化為具有抗體的漿細(xì)胞或記憶性B細(xì)胞［17］。近年來(lái)，抑制BCR信號(hào)通路已經(jīng)成為B細(xì)胞腫瘤臨床研究中的熱點(diǎn)，而B(niǎo)TK是BCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵點(diǎn)［18］。ibrutinib作為BTK的小分子靶向抑制劑以其口服方便，不良反應(yīng)較少的優(yōu)勢(shì)在B細(xì)胞淋巴瘤臨床治療中表現(xiàn)卓越，是未來(lái)淋巴瘤治療的新方向［19］。2016年美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）指南（V3）已將該藥用于慢性淋巴細(xì)胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）的一線治療和套細(xì)胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）的二線治療中。ibrutinib在有關(guān)DLBCL的臨床試驗(yàn)中也取得了一定的療效，如2015年美國(guó)發(fā)表的1項(xiàng)Ⅰ期臨床試驗(yàn)中，以ibrutinib聯(lián)合利妥昔單抗和苯達(dá)莫司汀治療包括復(fù)發(fā)/難治性DLBCL患者在內(nèi)的B細(xì)胞淋巴瘤，結(jié)果在DLBCL患者中獲得37%的完全緩解率（complete response，CR）［20］；Dasmahapatra等［21］報(bào)道在體外實(shí)驗(yàn)中聯(lián)合應(yīng)用ibrutinib和NF-κB的抑制劑硼替佐米可通過(guò)協(xié)同抑制AKT通路，下調(diào)Mcl-1，XIAP等促進(jìn)DLBCL細(xì)胞的凋亡；有研究提示，ibrutinib可通過(guò)下調(diào)IRF4與免疫調(diào)節(jié)劑來(lái)那度胺協(xié)同殺傷ABC型（活化的B細(xì)胞來(lái)源）的DLBCL細(xì)胞［22］。但ibrutinib對(duì)DLBCL細(xì)胞作用機(jī)制的研究尚少。

本研究初步探討了ibrutinib對(duì)DLBCL細(xì)胞的生存的影響，發(fā)現(xiàn)如同對(duì)CLL、MCL細(xì)胞的抑制，該藥也同樣抑制DLBCL細(xì)胞系SUDHL-10、HBL-1細(xì)胞及DLBCL患者原代細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，在腫瘤微環(huán)境中（骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)）的條件下，ibrutinib同樣在體內(nèi)外抑制DLBCL細(xì)胞的生長(zhǎng)。且該研究提示對(duì)AKT和ERK通路的共同抑制作用是上述作用產(chǎn)生的關(guān)鍵機(jī)制之一。

綜上所述，ibrutinib這一口服的BTK選擇性小分子抑制劑有望為DLBCL的治療帶來(lái)一線曙光，進(jìn)一步的機(jī)制探討與臨床效果的驗(yàn)證還亟需開(kāi)展更多、更深入的基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)。

[1]Armitage JO,Gascoyne RD,Lunning MA,et al.Non-Hodgkinlymphoma[J].Lancet,2017,(16):32407-32412.

[2]Caimi PF,Hill BT,Hsi ED,et al.Clinical approach to diffuse large B cell lymphoma[J].Blood Rev,2016,30(6):477-491.

[3]Burger JA,Tedeschi A,Barr PM,et al.Ibrutinib as initial therapy for patients with chronic lymphocytic leukemia[J].N Engl J Med,2015,373(25):2425-2437.

[4]Alinari L,Quinion C,Blum KA.Bruton's tyrosine kinase inhibitors in B-cell non-Hodgkin's lymphomas[J].Clin Pharmacol Ther,2015,97(5):469-477.

[5]Christian BA,Kuruvilla JG,Smith SM,et al.Updated results of a phaseⅠstudy of ibrutinib and lenalidomide in patients with relapsed and refractory B-cell non-Hodgkin's lymphoma[J].Blood,2015,126(23):3983.

[6]Tondreau T,Meuleman N,Delforge A,et al.Mesenchymal stem cells derived from CD133-positive cells in mobilized peripheral blood and cord blood:proliferation,Oct4 expression,and plasticity[J].Stem cells,2005,23(8):1105-1112.

[7]Batlle-López A,González de Villambrosía S,Francisco M,et al.Stratifying diffuse large B-cell lymphoma patients treated with chemoimmunotherapy:GCB/non-GCB by immunohistochemistry is still a robust and feasible marker[J].Oncotarget,2016,7(14):18036-18049.

[8]Grulich AE,Vajdic CM.The epidemiology of non-Hodgkin's lymphoma[J].Pathology,2005,37(6):409-419.

[9]Bi XW,Chen TC,Jiang WQ.Advances in lymphoma maintenance therapy with rituximab[J].Chin J Clin Oncol,2014,41(24):1612-1615[畢錫文,陳廷超,姜文奇.利妥昔單抗在淋巴瘤維持治療中的新進(jìn)展[J].中國(guó)腫瘤臨床,2014,41(24):1612-1615.]

[10]Sarkozy C,Coiffier B.Diffuse large B cell lymphoma(DLBCL),2 versus 3:end of a debate[J]?Ann Oncol,2017.[Epub ahead of print].

[11]Shain KH,Dalton WS,Tao J.The tumor microenvironment shapes hallmarks of mature B-cell malignancies[J].Oncogene,2015,34(36):4673-4682.

[12]Young RM,Shaffer AL,Phelan JD,et al.B-cell receptor signaling in diffuse large B-cell lymphoma[J].Semin Hematol,2015,52(2):77-85.

[13]Koehrer S,Burger JA.B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia and other B-cell malignancies[J].Clin Adv Hematol Oncol,2016,14(1):55-65.

[14]Mayer IA,Arteaga CL.The PI3K/AKT pathway as a target for cancer treatment[J].Annu Rev Med,2016,67(1):11-28.

[15]Tiacci E,Park JH,De Carolis L,et al.Targeting mutant BRAF in relapsed or refractory hairy-cell leukemia[J].N Engl J Med,2015,373(18):1733-1747.

[16]Rickert RC.New insights into pre-BCR and BCR signalling with relevance to B cell malignancies[J].Nat Rev Immunol,2013,13(8):578-591.

[17]Ackermann JA,Nys J,Schweighoffer E,et al.Syk tyrosine kinase is critical for B cell antibody responses and memory B cell survival[J].J Immunol,2015,194(10):4650-4656.

[18]Hendriks RW,Yuvaraj S,Kil LP.Targeting bruton's tyrosine kinase in B cell malignancies[J].Nat Rev Cancer,2014,14(4):219-232.

[19]Xia B,Qu F,Yuan T,et al.Targeting bruton's tyrosine kinase signaling as an emerging therapeutic agent of B-cell malignancies[J].Oncology letters,2015,10(6):3339-3344.

[20]Maddocks K,Christian B,Jaglowski S,et al.A phaseⅠ/Ⅰb study of rituximab,bendamustine,and ibrutinib in patients with untreated and relapsed/refractory non-Hodgkin lymphoma[J].Blood,2015,125(2):242-248.

[21]Dasmahapatra G,Patel H,Dent P,et al.The bruton tyrosine kinase(BTK)inhibitor PCI-32765 synergistically increases proteasome inhibitor activity in diffuse large-B cell lymphoma(DLBCL)and mantle cell lymphoma(MCL)cells sensitive or resistant to bortezomib[J].Bri J Haemat,2013,(161):43-56.

[22]Yang Y,Shaffer AL,Emre NCT,et al.Exploiting synthetic lethality for the therapy of ABC diffuse large B cell lymphoma[J].Cancer Cell,2012,21(6):723-737.

Ibrutinib inhibits diffuse large B-cell lymphoma cell survival

Dongwei WU,Bing XIA,Ling WU,Wen XU,Qiaoyang NING,Tian YUAN,Chaoyu WANG,Xin JIN,Yong YU,Yizhuo ZHANG

Department of Hematology Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital;National Clinical Research Center for Cancer;Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin;Tianjin's Clinical Research Center for Cancer,Tianjin 300060,China
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81600163 and 81570201)

Objective:To illustrate the effect and mechanism of ibrutinib,a Bruton's tyrosine kinase(BTK)inhibitor that inhibits diffuse large B-cell lymphoma(DLBCL)cell survival.Methods:DLBCL cell lines SUDHL-10 and HBL-1 were treated with ibrutinib at different concentrations.A MTT assay was used to detect the inhibition of cell proliferation.Cell apoptosis was analyzed by Annexin V-binding assay,as well as flow cytometry and DAPI staining.The expression of phosphorylated BTK,AKT and ERK was detected by Western blot.DLBCL cells were co-cultured with MSC.The inhibitory effect of ibrutinib on DLBCL cells in tumor microenvironment was assessed in clonogenicityin vitroand in a tumor-bearing non-obese diabetic/severe combined immunodeficient micein vivo.Results:Up to 2.5μmol/L and high concentrations of ibrutinib significantly inhibited the proliferation of DLBCL cells in a dose-dependent manner.Approximately 1 and 2.5μmol/L ibrutinib was added on SUDHL-10 cells for 24 h,and the cell apoptotic rates were(21.73±3.64)%and(34.71±2.36)%,respectively.Both were superior to that of the control group(3.55±1.89)%(P＜0.05).Both two DLBCL cell lines pretreated with 5 and 10μmol/L ibrutinib for 24 h and exhibited nuclear shrinkage at 5μmol/L and nuclear fragmentation at 10μmol/L.The expression of phosphorylated BTK,AKT,and ERK decreased significantly after ibrutinib treatment.Ibrutinib inhibited clonogenicityin vitro(P＜0.01)and cell proliferation and growth in vivo of DLBCL cells in co-culture system.The differences were statistically significant.Conclusion:Ibrutinib can inhibit the proliferation and induce apoptosis of SUDHL-10 and HBL-1 cell lines through a mechanism of blocking the AKT and ERK signaling pathways,as well as the proliferation of DLBCL cells in tumor microenvironment.This finding can significantly benefit DLBCL treatment.

diffuse large B-cell lymphoma,ibrutinib,proliferation,apoptosis

Yizhuo ZHANG;E-mail:yizhuozhang111@163.com

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.18.676

*本文課題受?chē)?guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：81600163、81570201）資助

張翼鷟 yizhuozhang111@163.com

（2017-06-16收稿）

（2017-07-25修回）

（編輯：孫喜佳 校對(duì)：楊紅欣）

吳東維 專(zhuān)業(yè)方向?yàn)閻盒匝耗[瘤的診斷及治療。

E-mail：tjmuwudongwei@163.com