HY5通過PIF4基因控制高溫誘導的擬南芥下胚軸伸長反應

鄭蘭蘭　李琛　張璟璇

摘要：考察了擬南芥野生型、hy5、pif4及hy5pif4雙突變體在22 ℃和30 ℃培養下的下胚軸伸長表型；利用qRT-PCR監測PIF4基因在野生型和hy5突變體30 ℃處理后持續多個時間點的動態表達。結果表明，HY5通過抑制下游基因PIF4調控高溫誘導的下胚軸伸長。PIF4：：GUS啟動子融合報告基因株系的染色結果表明，高溫對PIF4轉錄水平的誘導主要發生在子葉而不是下胚軸。通過qRT-PCR檢測PIF4同源基因PIF5，生長素合成基因YUC2、YUC3、YUC8和生長素反應基因IAA29在野生型和hy5突變體的動態表達，HY5通過調控PIF4介導的生長素通路來控制擬南芥下胚軸的伸長反應。

關鍵詞：擬南芥（Arabidopsis thaliana）；HY5；PIF4；生長素；高溫；下胚軸

中圖分類號：Q943.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）18-3554-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.18.041

Abstract： Hypocotyl phenotype of wild type，hy5，pif4 and hy5pif4 were examined under 22 ℃ and 30 ℃. qRT-PCR was performed to compare PIF4 expression dynamics during the time course after heat treatment in wild type and hy5 mutant. The expression level of PIF4 was increased in hy5 mutant，suggesting that HY5 repress PIF4 to regulate hypocotyl elongation. Tissue level analysis of PIF4：：GUS promoter reporter indicates that high temperature induced expression of PIF4 occurred in cotyledon but not hypocotyl. Moreover，PIF4 homolog gene PIF5，auxin synthesis genes YUC2，YUC3，YUC8，and auxin response gene IAA29 were upregulated in hy5 mutant when compare to wild type during the time course after high temperature treatment. These suggest HY5 regulate PIF4 mediated auxin pathway to control hypocotyl elongation under high temperature condition.

Key words： Arabidopsis； HY5； PIF4； auxin； high temperature； hypocotyl

隨著全球環境溫度的升高，有必要了解和研究植物反應和適應環境變化的機制。光和溫度是植物生長和發育中不可或缺的兩類重要的環境因子。為了應對光和溫度環境的變化，植物表現出高度的可塑性。下胚軸的伸長反應是植物細胞伸長和可塑性的關鍵表型[1-3]。幼苗的下胚軸在暗培養下顯著伸長，在光照下伸長被抑制。基于光、暗兩種生長條件下幼苗形態的差異，通過篩選在暗下保留光形態建成特征的擬南芥突變體，克隆CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC/DE-ETIOLATED/FUSCA（COP/DET

/FUS）的位點[4，5]。相關突變體如cop/det/fus突變體在暗培養下都呈現去黃化的表型。這些位點編碼的蛋白大多數屬于一個大分子復合體COP9 signalosome（CSN）的某個組分[3，6-8]。CSN復合體調控光反應激活子（通常是轉錄因子）的26S蛋白酶介導的降解路徑[7]。通過篩選在光下保留暗形態建成特征（主要是下胚軸伸長）的突變體，鑒定了多個Long hypocotyls（HY1 to HY8）的遺傳位點。它們中有光信號受體（HY1、HY3/PHYB、HY8/PHYA、HY4/CRY1）以及下游信號因子（比如HY5）等[8-13]。hy5編碼bZIP轉錄因子，是第一個被克隆的光形態建成激活子[14]。hy5突變體在光照下有較長的下胚軸[14]，是研究下胚軸伸長反應的重要遺傳材料。

高溫（30 ℃）可以誘導下胚軸的伸長[1]，但是生長素反應和極性運輸途徑缺失的突變體對高溫誘導不敏感，而赤霉素（GA）、乙烯等合成缺失的突變體對高溫誘導效應影響不大[1]。外源施加GA合成抑制劑（Paclobutrazol，PAC）和生長素極性運輸劑（1-naphthylphthalamic acid，NPA）都可以抑制高溫誘導的下胚軸伸長[15]，這表明生長素參與高溫誘導的下胚軸伸長。PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR 4（PIF4）是Phytochrome B信號通路的負調控因子并受高溫迅速誘導[16]。pif4缺失突變體對高溫不敏感[17]，PIF4介導的依賴于YUCCA8（YUC8）的生長素合成途徑被發現是高溫誘導下胚軸伸長的主要機制[18-20]，高溫誘導下胚軸伸長的分子機制仍有待更深入的研究[21]。針對轉錄因子HY5的全基因組水平的染色質免疫共沉淀芯片（CHIP-chip）鑒定出超過3 000個可能的HY5轉錄結合的下游基因[22]，這其中包括PIF4[22，23]，暗示HY5與PIF4之間存在遺傳互作。endprint

研究突變體在高溫下的表型，發現hy5突變體下胚軸比野生型伸長更顯著，而hy5pif4雙突變體的下胚軸伸長比hy5突變體短。通過qRT-PCR檢測PIF4基因的表達水平，PIF4受高溫誘導表達的程度在hy5突變體中比野生型高。通過對PIF4：：GUS報告基因株系組織特異性表達的研究，發現溫度誘導的PIF4轉錄水平上調主要發生在子葉。PIF4的同源基因PIF5，生長素合成基因YUC2、YUC3、YUC8以及生長素反應基因IAA29的表達量在hy5突變體中都比野生型高，表明HY5調控PIF4介導的生長素合成和信號通路。

1 材料與方法

1.1 植物材料與生長條件

擬南芥野生型Columbia （Col）、hy5 （SALK_05

6405）、pif4（N66043_SAIL_1288_E07）及通過雜交獲得的hy5pif4雙突變體。

擬南芥的種植條件和方法：①種子消毒，用15%漂白水稀釋液浸泡種子15～20 min，而后用無菌水漂洗3～4次。②消毒后的種子放置于4 ℃冰箱避光處理1～3 d，以實現低溫誘導種子整齊萌發。③將種子種在1/2 MS固體培養基，置于光照件下培養。培養溫度為22或30 ℃。

1.2 下胚軸長度測量和分析

用相機拍下對應天數的幼苗生長照片，利用ImageJ（http：//rsb.info.nih.gov/ij/）進行數據測量。

1.3 qRT-PCR基因表達分析

樣品取自生長6 d的幼苗地上部分，包括子葉和下胚軸。RNA的抽提使用的是Tranzol（Transgene，北京全式金生物技術有限公司），試驗步驟按照說明書進行。qRT-PCR反應體系按照SYBR Premix Ex Taq kit（TaKaRa）提供的說明書配制。PCR反應在公司的ABI 7500 Real-time PCR system（Applied Biosystems）上進行。Elongation Factor 1α（EF1α）作為內參。引物序列見表1。

1.4 質粒克隆和植物轉化

PIF4：：GUS是PIF4啟動子驅動的報告基因為GUS的轉基因植株。啟動子選擇的區段為起始密碼子ATG往上選取至上游基因為止的3.8 kb序列，然后克隆到融合GUS報告基因的pGreenII-0229雙元載體上。引物序列見表1。擬南芥的轉化采用花序浸染法[24，25]。

1.5 GUS染色和強度分析

染色分析參考文獻[26]。將待測試材料浸泡在GUS染液里，37 ℃培養，直到充分染色即可。利用ImageJ（http：//rsb.info.nih.gov/ij/）進行GUS染色強度的定量分析。

2 結果與分析

2.1 突變體在20 ℃和30 ℃的下胚軸表型

在20 ℃光照培養條件下，hy5突變體下胚軸比野生型長[14]，而pif4下胚軸比野生型稍短[17]（圖1）。hy5pif4雙突變體表型分析發現雙突變體的下胚軸長度介于兩個親本之間，即雙突下胚軸比hy5短，表明PIF4基因有可能位于hy5的下游。

在30 ℃光照培養條件下，所有材料的下胚軸都比20 ℃時長，但是hy5相比野生型伸長更為顯著，而hy5pif4雙突變體對高溫誘導反應的敏感度降低（圖1）。表明HY5是高溫誘導下胚軸伸長的抑制因子，而它的抑制作用一定程度上是通過PIF4作用的。

2.2 PIF4和YUC8基因表達水平的檢測

突變體表型分析表明PIF4位于hy5的下游。檢測PIF4基因在野生型和hy5突變體受高溫誘導后不同時間點的動態表達情況。結果表明，在野生型里PIF4的表達量被高溫持續誘導，但在hy5突變體里PIF4在每個時間點的表達量都比野生型高（圖2），表明HY5是PIF4的轉錄抑制因子。

PIF4依賴的YUC8表達水平升高和生長素合成的增加是高溫誘導下胚軸伸長的一個重要分子機制[19]，檢測YUC8在高溫誘導中的動態表達情況。與PIF4一致，YUC8在hy5突變體里的表達持續高于同時間點處理的野生型（圖2）。結果表明，HY5通過影響PIF4基因依賴的YUC8表達和生長素合成調控下胚軸的高溫誘導伸長反應。

2.3 PIF4：：GUS啟動子融合株系在高溫誘導中的表達模式分析

PIF4是關鍵的高溫誘導促進因子[17，19，20]，但是其在高溫誘導過程中的表達模式并不清楚。因此，構建了PIF4：：GUS啟動子融合報告基因株系，并觀察了在高溫誘導過程中GUS表達的強度變化（圖3）。高溫誘導4 h后，子葉的GUS染色強度開始顯著增強，并保持持續增強的趨勢，而下胚軸的GUS染色強度沒有顯著改變（圖3）。結果表明，高溫誘導的PIF4轉錄水平累積主要集中在下胚軸。

2.4 生長素合成及響應基因的表達變化

根據已發表的CHIP-chip結果[22]，PIF4及同源基因PIF5是可能的hy5下游基因。同時，下胚軸的伸長與PIF4調控的生長素合成途徑如YUC8及其同源基因YUC2和YUC3相關[27]。生長素反應因子如IAA29的表達水平反映體內生長素的分布情況。IAA29的表達也被高溫誘導[17]。基于此，檢測了這些基因在高溫誘導過程中的表達變化，發現它們的表達在hy5突變體里持續升高（圖4）。

3 討論

PIF4調控高溫對下胚軸伸長的誘導反應主要是通過影響生長素的合成和響應反應來實現的[19]。HY5是光形態建成的重要促進因子，但其在高溫誘導下胚軸伸長過程中的調控機理研究并不多。PIF4是假定的hy5下游靶基因[22]。

結果表明，HY5是擬南芥響應光和溫度的共同調控因子。HY5位于PIF4介導的生長素調控網絡的上游。有研究通過正向遺傳學的方法篩選對高溫誘導不敏感的突變體鑒定了DE-ETIOLATED 1（DET1）的等位突變體okapi1，通過同樣的遺傳雜交分析等手段證明光和高溫都通過DET1-COP1-HY5途徑調控PIF4[28]。endprint