反相高效液相色譜法測定30%二氯吡啶酸水劑的方法研究

劉騫　程運斌　張杰

摘要：建立了一種反相高效液相色譜法測定30%二氯吡啶酸水劑含量的方法。試樣用流動相溶解，采用等度洗脫的方法，以甲醇-醋酸銨-氨水為流動相，普通C18為色譜分析柱，對二氯吡啶酸進行分離，外標法定量。結果表明，該方法的線性相關系數為0.999 6，變異系數為0.522%，平均回收率為100.3%。色譜圖峰形好，出峰時間短，對色譜柱要求低，滿足農藥產品含量分析的要求。

關鍵詞：二氯吡啶酸；等度洗脫；反相高效液相色譜

中圖分類號：O657.7+2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）18-3534-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.18.036

Abstract： A RP-HPLC method was established for detection of clopyralid 30% AS. The sample was dissolved with mobile phase and analyzed by RP-HPLC using the mixture of methanol and ammonium acetate and ammonia as the mobile phase and ordinary C18 as chromatographic column in isocratic elution method. In addition， the quantificaation was calculated by external standard method. The linear correlation coefficient for clopyralid was 0.999 6，the variation coefficent was 0.552%， and the average recovery was 100.3%. Under the chromatographic conditions in this paper， the peak shape of dicloxypyridine acid is good， the retained time is short and low requires on the column. The method has met the requirements of analysis of pesticide products.

Key words： clopyralid； isocratic elution； RP-HPLC

二氯吡啶酸（Clopyralid）是一種化學合成的激素類除草劑，化學名稱為3，6-二氯吡啶-2-羧酸，商品名龍拳、畢草克等，由美國陶氏公司研制。殺死雜草途徑有兩種，一種是由植物莖葉吸收，破壞植物體內激素平衡，導致雜草死亡，另一種是由韌皮部傳導至根，殺死深根類雜草。主要用于防治油菜、玉米、小麥田、草坪等田間的一年生闊葉雜草和深根多年生闊葉雜草（菊科和豆科雜草），其中對大刺兒菜、苦苣菜、藏薊等闊葉難防雜草效果較好[1-6]。

目前，有關這種農藥分析的液相色譜法報道很多，但都采用酸性流動相體系作為檢測條件，在該條件下分離檢測二氯吡啶酸對分析所用的色譜柱要求高，需要高水平的硅醇基封尾的色譜柱才能獲得保留時間合適且對稱性好的窄峰[7-10]。建立一種簡便的高效液相色譜法，僅使用普通的C18色譜柱就可以在合適的分析時間內得到對稱性好的窄峰的分析方法是非常有必要。因此，本研究采用甲醇-醋酸銨-氨水作為流動相，建立了反相高效液相色譜法測定30%二氯吡啶酸水劑中二氯吡啶酸的含量。該方法僅使用普通的C18色譜柱就可在5 min內完成分離工作，而且精密度高、準確度好、線性關系良好，可為企業產品質量控制和檢測機構質量檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-10AD型高效液相色譜儀，配備SPD-10AVP型紫外檢測器（日本SHIMADZU公司）；色譜柱為Inertsil？誖ODS-3 250 mm×4.6 mm，5 μm（日本SHIMADZU-GL公司）；XP504R型電子天平（瑞士Mettle Toledo公司）；SONOREX型超聲波清洗器（德國Bandelin公司）；Milli-Q型超純水儀器（美國 Millipore公司）；有機系尼龍過濾頭，濾膜孔徑約為0.22 μm（天津津騰公司）。甲醇、醋酸銨（色譜純，美國J.T.Baker公司）；氨水（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

試驗用水為超純水，二氯吡啶酸（98.1%，上海市農藥研究所有限公司）；30%二氯吡啶酸水劑（由某企業提供）。

1.2 方法

1.2.1 液相色譜條件 流動相為甲醇-醋酸銨-氨水溶液（體積比30∶70，醋酸銨溶液用氨水調pH至8.0），流速為1.0 mL/min，柱溫為40 ℃，檢測波長為280 nm，進樣體積為20 μL，二氯吡啶酸的保留時間約為4.3 min。二氯吡啶酸的標樣液相色譜見圖1，典型質量分數為30%二氯吡啶酸水劑樣品液相色譜見圖2。

1.2.2 標樣的制備 稱取0.05 g（精確至0.000 1 g）二氯吡啶酸標樣于50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻作為母液備用。取2 mL母液于25 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻作為檢測樣品的標樣溶液使用。

1.2.3 試樣溶液的制備 稱取0.200 0 g質量分數為30%二氯吡啶酸水劑樣品于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解超聲15 min后再稀釋至刻度，取上述樣品溶液2 mL于25 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻后用0.22 μm微孔濾膜過濾后檢測其二氯吡啶酸的含量。endprint

1.2.4 二氯吡啶酸質量分數的測定 待儀器穩定后，連續注入數針標樣溶液，直至相鄰2針二氯吡啶酸的峰面積相對變化小于1.5%后，按照標樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標樣溶液的順序進行測定。將測得的2針試樣溶液以及試樣前后2針標樣溶液中二氯吡啶酸的峰面積分別進行平均。試樣中二氯吡啶酸的質量分數按式（1）計算。

式中，A1為標樣溶液中二氯吡啶酸面積的平均值，A2為試樣溶液中二氯吡啶酸峰面積的平均值，m1為二氯吡啶酸標樣的稱樣量（g），m2為試樣的稱樣量（g），V1為標樣的定容體積（mL），V2為試樣的定容體積（mL），P為標樣中二氯吡啶酸的質量分數（%）。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測波長的選擇 通過LC-10AD型高效液相色譜儀的光譜掃描功能，獲得二氯吡啶酸的紫外波長光譜圖（圖3）。從圖3可以看到，二氯吡啶酸在277.73 nm處有最大吸收波長，故選擇280 nm為檢測波長。

2.1.2 流動相的選擇 二氯吡啶酸的檢測多采用反向液相色譜法，其檢測條件為酸性流動相體系，本研究也利用了該方法檢測了二氯吡啶酸，但二氯吡啶酸的峰形不佳，存在峰拖尾、峰展寬以及峰不對稱的問題，且分析時間較長，不便用于實際的檢測工作中（圖4a、4b、4c）。可能是因為二氯吡啶酸的分子結構中的吡啶環與色譜柱填料中的硅羥基的相互作用，導致峰拖尾和保留時間增大。因此，本研究采用甲醇-醋酸銨-氨水（甲醇∶醋酸銨=30∶70，醋酸銨溶液濃度為87.5 mmol/L，pH 8.0）流動相體系，得到對稱的窄峰（圖4d），且分析時間短，可用于實際的檢測分析。

進一步驗證是否是二氯吡啶酸的分子結構中的吡啶環與色譜柱填料中的硅羥基的相互作用而導致峰拖尾，選用了資生堂的C18 MGⅡ的色譜柱為分析柱，該柱子的硅醇基被高水平封尾適用于困難的堿性化合物的分析，在酸性流動相體系下分離檢測二氯吡啶酸，得到的峰形尚可，保留時間較短（圖4e），也可用于實際的檢測分析。說明之前峰拖尾的原因是因為二氯吡啶酸的分子結構中的吡啶環與色譜柱填料中的硅羥基的相互作用。

綜上所述，在酸性流動相體系下分離檢測二氯吡啶酸，要獲得好的峰形和合適的保留時間，需要使用特殊的色譜柱，而在本研究建立的色譜方法中不需要特殊的色譜柱，僅需改變流動相的組成就可以獲得優于使用特殊的色譜柱時的峰形和合適的保留時間，在實際應用中更為便捷。

2.2 線性相關性試驗

將標樣溶液在上述色譜條件下進行分析，進樣量分別為12、14、16、18、20、22、24 μL，以質量為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，二氯吡啶酸的線性相關曲線為y=45 931.4x+5 569.60，R2=0.999 6，可滿足定量分析的要求。

2.3 精密度試驗

從同一產品中準確稱取5份試樣，在上述色譜條件下進行分析，測得二氯吡啶酸的平均含量為28.3%，變異系數為0.522%（表1），表明該方法具有較高的精密度。

2.4 回收率試驗

稱取5個已知含量的質量分數為30%二氯吡啶酸水劑樣品，分別加入一定量的二氯吡啶酸標樣（質量分數為98.2%），在上述色譜條件下分析測定二氯吡啶酸的加標回收率，測得二氯吡啶酸的回收率在99.6%～101.1%，平均回收率為100.3%（表2），表明該方法具有較好的準確度。

3 小結

利用反相高效液相色譜法測定農藥產品中的二氯吡啶酸的含量。該方法操作簡便，分析時間短，對色譜柱的要求不高，而且具有良好的線性相關性、高精密度和準確度，實用性高，可為農藥產品企業制定企業標準提供參考。

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