不同年齡哈薩克羊卵巢卵泡分布及組織學特征

彭宏剛

摘要：哈薩克羊作為中國三大粗毛羊品種之一，是我國寶貴的畜禽遺傳資源之一，研究不同年齡哈薩克羊卵巢中卵泡的分布及各級卵泡形態學特征，可為進一步開展其卵巢基礎生理研究和品種遺傳資源的開發與利用提供參考依據。試驗采用組織學方法，分別對胎兒、羔羊、青年母羊、老齡母羊卵巢切片進行分析，結果表明不同年齡哈薩克羊卵泡分布區域相異，胎兒卵巢組織中以原始卵泡為主，主要分布于皮質最外層，內含較大的卵母細胞核。羔羊卵巢組織中發育卵泡較少；青年母羊發育卵泡則較多，主要分布于與髓質交界的區域。發育卵泡外周常環繞單層或多層立方狀顆粒細胞。隨著年齡增長，老齡母羊中逐漸以閉鎖卵泡為主，哈薩克羊閉鎖卵泡卵母細胞皺褶，核固縮或顆粒細胞分布雜亂與基底膜分離。

關鍵詞：哈薩克羊；卵巢；卵泡；分布；組織學特征

中圖分類號：S813；S826 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2017）010-0005-02

哺乳動物卵巢內含有數量龐大的腔前卵泡，然而在生理條件下，這些卵泡只有不到1%能發育到成熟排卵階段，其余都由于閉鎖而退化，這是對雌性繁殖潛力的極大浪費。哈薩克羊是新疆原產的中國三大粗毛羊品種之一，肉脂兼用，具有較高的肉脂生產性能。哈薩克羊是我國寶貴的畜禽遺傳資源之一，作為母系品種參與了新疆細毛羊和中國卡拉庫爾羊品種的培育。研究表明，卵巢所處的年齡、發情周期等的不同會影響卵泡對外界激素的敏感性，卵巢內各級卵泡的構成也會隨著年齡的變化而發生改變。本研究旨在對比不同年齡哈薩克羊個體卵巢中卵泡的分布與各級卵泡組織學特征，為進一步開展卵巢基礎生理研究和品種遺傳資源的開發與利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 卵巢組織的采集與處理 不同年齡階段雌性哈薩克羊卵巢包括三月齡胎兒、3～6月齡羔羊、1～3歲青年母羊以及老齡母羊（5歲以上）從當地屠宰場采集，保存于27～32 ℃添加有100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的生理鹽水或PBS緩沖液中，1 h內運回實驗室。在體視顯微鏡下，去除卵巢附屬物，十字剖分成1～2 mm3大小的組織塊用4%多聚甲醛PBS液固定，進行組織學觀察。

1.1.2 主要儀器和設備 組織切片機、超凈工作臺、光學顯微鏡、眼科手術刀、手術剪和35 cm培養皿。

1.1.3 主要試劑 生理鹽水，PBS液，蘇木素-依紅染液， 4%多聚甲醛-PBS液。

1.1.4 主要溶液的配置

（1）蘇木素-依紅染液。蘇木精染液配方（20×）：蘇木精0.5 g，銨汞24 g，水50 mL，NaIO3 0.5 g，甘油30 mL，冰醋酸2 mL（細胞核染色，堿性），用時20倍稀釋。1%伊紅染液配方：1 g伊紅溶于100 mL蒸餾水中。

（2）無鈣鎂PBS溶液。KCl 0.2 g，KH2PO4 0.2 g，NaCl 8.0 g，Na2HPO4·12H2O 2.88 g，Mill-Q超純水定容到1 L，pH 7.0～7.4，用0.22 μm濾膜過濾滅菌后4 ℃保存。

（3）4%多聚甲醛-PBS溶液。4 g多聚甲醛，溶于100 mL PBS液中4 ℃保存。

1.2 試驗設計

本研究旨在分析不同年齡哈薩克羊卵巢中卵泡的分布與組織學特征。樣本采集時左右卵巢分別對應編號，固定后用常規組織學方法對比不同年齡階段哈薩克羊卵巢組織中卵泡的分布，以及不同發育階段卵泡的組織學特征。

1.3 組織切片與染色

卵巢組織塊固定后經梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后，10 μm連續切片，HE染色后光鏡下觀察。卵泡分類標準參考相關文獻，分為原始卵泡和發育卵泡（過渡卵泡，初級卵泡和次級卵泡）。形態正常卵泡具有完整的卵母細胞，顆粒細胞排列規則，無固縮細胞核，異常卵泡卵母細胞皺褶或顆粒細胞分布雜亂與基底膜分離，核固縮。

卵泡密度的衡量：本研究采用平均每張切片上的卵泡數量作為卵泡密度。

各級卵泡構成：對計數切片上隨機5個高倍視野下（×200）具有明顯卵母細胞核的健康卵泡和閉鎖卵泡分別進行計數，對健康的各級卵泡數量分別記錄，計算卵泡比例。

2 結果與分析

2.1 不同年齡階段個體卵巢中卵泡的分布

卵巢組織學切片觀察發現，卵巢中腔前卵泡主要分布在皮質部，且分布不均勻。原始卵泡處于皮質最外層，在致密的白膜結構下，密度較大，常聚集成團，這種現象在胎兒卵巢組織中尤為明顯（圖1a）；初級和次級卵泡則分布于卵巢內部與髓質交界的區域，且密度較低。羔羊卵巢中發育卵泡較少（圖1b），青年母羊發育卵泡較多（圖1c），老齡母羊中閉鎖卵泡增多（圖1d）。

2.2 各級卵泡組織學特征

試驗結果表明，原始卵泡有較大的卵母細胞核，外面包裹單層的扁平顆粒細胞，數量從0～13不等。胎兒卵巢中原始卵泡與出生后原始卵泡有很大的差異，胎兒組織中原始卵泡顆粒細胞較少，且大多沒有形成卵泡樣結構。胎兒卵泡中有時會發現合胞體現象，且基底膜不明顯，完整的基底膜原始卵泡主要發現于青年和老齡母羊卵巢中（圖1e）。

初級卵泡外周環繞單層立方狀或柱狀顆粒細胞，數量增多，有明顯的基底膜隔離卵泡與間質細胞，顆粒細胞數量增多，在羔羊卵巢中常發現由扁平和立方狀顆粒細胞混雜的過渡性初級卵泡（圖1f）。

次級卵泡外周環繞2～7層立方狀顆粒細胞，基底膜明顯，具有完整的卵泡結構和透明帶。顆粒細胞數量急劇增加，數量從幾十到數百不等（圖1c）。

閉鎖卵泡通常表現為兩種特征（圖1g，圖1h），卵母細胞皺褶，核固縮或顆粒細胞分布雜亂與基底膜分離。但是因為胎兒卵巢組織中多為原始卵泡階段，且含有較多的卵原細胞，因此閉鎖的卵泡在組織學下較難辨認。endprint

3 小結與討論

從試驗結果可知，綿羊卵巢中從胎兒時期開始就含有大量的原始卵泡，隨著年齡的增長，卵泡數量不斷減少。而伴隨著這一數量減少的過程，卵泡發育不斷啟動，原始卵泡顆粒細胞層增殖，形狀由扁平轉變為柱狀或立方狀，變為單層或多層的發育卵泡，直至竇腔排卵階段。但實際上最終發育到成熟階段的卵泡相對卵泡總數而言數量是很小的，這一現象說明卵泡發育過程中大部分的卵泡發生閉鎖，這應該與優勢卵泡的形成機制有關[1]。

原始卵泡多位于皮質淺層，緊靠白膜，且密度較大，通常沒有血管存在。而發育卵泡主要位于皮質的中層和內層，且發育程度越高，位置越靠近卵巢內部。多層顆粒細胞的次級卵泡位于皮質與髓質交界的區域，這些區域血管較多，結構相對松散。上述觀察結果與其他關于家羊的報道基本一致[2]。哈薩克羊卵泡的這種分布規律表明卵泡的發育需要血管體系提供必要的激素和生長因子的刺激以及能量支持。卵巢中大部分原始卵泡都處于相對靜止的休眠狀態，可能與能量供給較少有關。陳大元[3]的研究結果表明發育卵泡需求的能量供給除供卵泡自身生長所需外，還可能累積和儲存在卵子中，為將來的胚胎早期發育提供必需的能量和DNA蛋白質的合成底物。

總之，本試驗結果表明，哈薩克羊卵巢中原始卵泡位于皮質的最外層，緊靠白膜下方，密度較大，而發育卵泡位于皮質里層。青年母羊卵巢內發育程度較高，卵泡可能對外界因子敏感，同時材料易于從屠宰場獲得，可以作為卵巢生理基礎研究試驗的材料來源。而胎兒和羔羊卵巢中原始卵泡數量較多，且構成相對單一，是研究原始卵泡發育進程的理想材料。

參考文獻：

[1] NANDI S，GIRISH KUMAR V，RAMESH H S，et al. Isolation and culture of ovine and bubaline small and large pre-antral follicles：effect of cyclicity and presence of a dominant follicle[J].Reprod Domest Anim，2009，44：74-79.

[2] ISLAM M R，KHANDOKER M A，AFROZ S，et al. Qualitative and quantitative analysis of goat ovaries，follicles and oocytes in view of in vitro production of embryos[J].J Zhejiang Univ Sci B，2007，8（7）：465-469.

[3] 陳大元.受精生物學：受精機制與生殖工程[M].北京：科學出版社，2003.endprint