多粘類芽孢桿菌研究進展

田宇曦　閔勇　楊自文

摘要：多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）是重要的根際有益生物，也被用于生物醫藥、流程制造、生物修復等方面，具有較大利用價值。綜述了多粘類芽孢桿菌的菌株新特性和基因組特點、諸多功能領域的研究和產業化應用、分子操作系統、菌株的選育以及發酵技術的優化。

關鍵詞：多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）；功能；產業化應用；分子操作系統；菌株選育；發酵條件優化

中圖分類號：S917.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）18-3401-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.18.001

Abstract： Paenibacillus polymyxa is an important beneficial rhizosphere organism， which may also be applied in biomedical industry， process manufacturing， bioremediation and so on， with great value of utilization. The new characteristics of bacterial strain and genome， study and industrial application in many functional areas，molecular operating system，breeding of strain and optimization of fermentation technology of Paenibacillus polymyxa were summarized.

Key words： Paenibacillus polymyxa； function； industrial application； molecular operating system； breeding of strain； optimization of fermentation condition

類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）是廣泛存在于自然界的一類好氧-兼性厭氧、可產生內生孢子的桿狀細菌。多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）是類芽孢桿菌的模式菌種，是一類重要的根際有益細菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）[1]，兼具促進植物生長和生物防治的作用，在生物醫藥、流程制造、生物修復等方面有重要利用[2]。多粘類芽孢桿菌可產生多種生物活性物質，如酶、抗菌物質、植物生長調節劑及絮凝劑等，多是蛋白質、多糖、多肽[3]。為了從多粘類芽孢桿菌獲得更多的活性物質，一般采用誘變和篩選技術選育優良菌株[4]，進行發酵條件優化，菌株的制劑化、復合使用方案等也皆有研究。隨著生物技術的不斷發展，多粘類芽孢桿菌分子操作也在進一步完善，為多粘類芽孢桿菌功能和分子機理的研究、改造菌株打開了新的天地。

1 菌株新特性及基因組特點

研究發現，多粘類芽孢桿菌細菌細胞可以從玉米、黃瓜等植物的根部轉移到莖部和葉部，和革蘭氏陰性固氮菌巴西固氮螺菌Yu62、革蘭氏陽性菌巨大芽孢桿菌的定植模式相似，可成為一種聯合固氮菌[5]。多粘類芽孢桿菌的菌落會發生分化，研究表明，多粘類芽孢桿菌GBR-1在不同的接種濃度下分離的菌落形態有較大的差異，多粘類芽孢桿菌SC2在實驗室培養條件下菌落形態也表現出不穩定性。SC2的頻繁分化影響了它的應用，分化的突變株不再產生芽孢且抗病能力下降很多。目前，對多粘類芽孢桿菌的分化現象還少有全面的研究，研究其分化機制很有必要。侯曉陽[6]發現SC2分化后的突變株表型變化與基因組變化有關。

到2011年4月30日，完成全基因組測序的微生物共有1 545株，正在進行的微生物基因組測序項目有4 856個，已經完成測序的真細菌全基因組共有893個。其中已測序的模式微生物有大腸桿菌K12[7]、枯草芽孢桿菌[8]等，迄今為止已完成及正在進行測序的類芽孢桿菌菌株有14株，目前已經公布序列的多粘類芽孢桿菌菌株有多粘類芽孢桿菌E681和SC2。多粘類芽孢桿菌SC2注釋的抗生素合成和促生相關基因有Fusaricidin、Lantibiotic、 Microcystin、Bacillorin、Inturin、Bacitracin、Polyketide、Gramicidin S、Polymyxin等，其大多與非核糖體肽和聚酮類化合物合成相關。多粘類芽孢桿菌SC2產生的非核糖體肽作為次級代謝產物，具有多樣性和統一性，使得該桿菌具有廣譜抗菌能力。隨著20世紀70年代開始研究肽生物合成非核糖體機制，以及全基因組測序的開展，越來越多的次級代謝產物合成的相關基因被克隆和分析，產生了大量關于次級代謝產物合成和調控的信息[6]。李舒清[9]確定多粘類芽孢桿菌SQR-21的Fusaricidin啟動子的最小功能區域，發現宿主存在不同的轉錄調控因子，導致不同的啟動子片段在不同宿主存在不同的轉錄水平。

2 功能領域的研究和產業化應用

多粘類芽孢桿菌具有促生長和生物防治兩方面作用，通過固氮、溶解磷、獲取鐵和產生植物生長調節劑促進植物生長；通過誘導植物產生系統抗性、產生殺蟲或殺菌物質，如抗菌肽、細菌素、非核糖體合成的脂肽、環狀陽離子脂肽或非環狀陽離子脂肽等，實現生物防治[2]。它產生的微生物多糖，如黃原膠、結冷膠等，也頗具產業價值，廣泛應用于工、農業。蹇華麗等[10]研究多粘類芽孢桿菌PS04多糖結構，從一級結構鑒定其為果聚糖。多粘類芽孢桿菌在醫藥、加工、生物修復等方面也有一定研究[2]。尹艷[11]發現多粘類芽孢桿菌可以降解轉化褐煤，并采用正交試驗研究褐煤微生物的影響因素，優化了降解方案。宿燕明等[12]發現，施氮肥時添加多粘類芽孢桿菌發酵液，能明顯降低油菜中硝酸鹽含量。徐匆等[13]將多粘類芽孢桿菌用于桂味荔枝果實采后保鮮，輔以0.3 g/L納他霉素、1%乳酸鈉復配成生物保鮮劑，能顯著提高果實的商品率，延長貨架期，證實多粘類芽孢桿菌dgnkzx004對荔枝炭疽病菌及霜疫霉菌生長有抑制作用。endprint

多粘類芽孢桿菌在生產實踐中的應用方面，學者做了探索。Hu等[14]發現井岡霉素和多粘類芽孢桿菌防治水稻紋枯病有明顯的協同效應，以3%井岡霉素A加多粘類芽孢桿菌水劑（2億芽孢/mL），對水稻紋枯病發病的初期預防效果良好。尹薇等[15]將腐殖酸與多粘類芽孢桿菌配合施用，提高肥料的效果，減輕了土傳病害，提高了黃瓜產量。在動物保健方面，多粘類芽孢桿菌被應用于微生態制劑。微生態制劑是調整并穩定腸道微生態平衡，提高宿主健康水平的有益菌群及其代謝產物和選擇性促進宿主正常菌群生長制劑的總稱，以多功能、綠色無害、無殘留的特性成為飼用抗生素的完美替代品。張宏福[16]將多粘類芽孢桿菌A11和枯草芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌混合成新型微生態制劑，該制劑各菌株具有一定的耐受性且對動物的生產性能具有顯著的改善作用，對細胞因子和抗氧化因子也有一定的促進作用。劉振華[17]發現，多粘類芽孢桿菌的田間應用適宜采用高芽孢含量發酵液制成的可濕性粉劑，可作為一種廣譜性微生物農藥，有效防治多種植物土傳病害和葉部病害。多粘類芽孢桿菌多糖在農藥制備方面，有助懸浮、熱保護和紫外保護功能，研究此多糖作為微生物農藥專用助劑，可優化可濕性粉劑配方和加工工藝，降低生產成本，具有較大的經濟效益和社會效益。

3 分子操作系統

多粘類芽孢桿菌是一種相對研究較少的實驗菌，分子遺傳學工具相對缺乏，尚處在探索階段，其分子機制的研究進展尚未深入。近幾年其工具和理論方法的研究速度明顯地加快。

3.1 常規克隆和表達

在基因克隆、鑒定、表達和應用分析方面，多粘芽孢桿菌諸多功能基因被克隆和延伸研究，比如多糖水解酶基因、β-葡聚糖酶基因、吲哚-3-丙酮酸脫羧酶基因、Fusaricidins基因簇、多粘菌素合成酶基因簇等[18]。陳雪麗等[19]采用硫酸銨分級沉淀、Sephadex G-50柱層析，采用抑菌活性和SDS-PAGE跟蹤檢測，從多粘類芽孢桿菌代謝產物中分離純化到一種對大豆立枯絲核菌具有拮抗活性的大小為35.4 kD的抗菌蛋白。多粘類芽孢桿菌產β-1，3-1，4-葡聚糖酶是一類有著廣泛應用前景的飼料添加劑，還有抗稻瘟病菌的活性作用，文鳳云等[20]從多粘類芽孢桿菌CP7克隆、表達和應用β-1，3-1，4-葡聚糖酶，從基因工程角度證明了β-1，3-1，4-葡聚糖酶是多粘類芽孢桿菌CP7抗真菌的活性組分，為飼用酶制劑的發開研究提供了新思路。

3.2 生物轉化

生防菌功能基因研究需簡捷高效的基因組改造工具，基因組操作基礎是將外源DNA轉入細胞并使其與目的DNA發生同源重組。早期是利用Spizizen自然感受態轉化法將外源DNA以線性單鏈的形式導入細胞內，與基因組具有同源性的外源DNA在RecA重組酶的作用下通過重組載體以單交換或雙交換方式整合到染色體上。隨著研究的深入，電擊轉化、接合轉移、原生質體轉化和堿金屬離子轉化等方法逐漸被建立并用于DNA轉化研究[21]。電擊轉化法廣泛應用于革蘭氏陰性和陽性細菌中。原生質體轉化法應用較多，但也存在缺陷，比如大質粒的轉化效率較低，再生培養基要求高。堿金屬離子轉化法是新發展起來的一種適合芽孢桿菌的轉化方法，在枯草芽孢桿菌和短短芽孢桿菌研究中已有使用。采用接合轉移法，已有含前毒素基因的質粒從蘇云金芽孢桿菌轉移到蘇云金芽孢桿菌或者蠟狀芽孢桿菌、含有內毒素基因的重組質粒從枯草芽孢桿菌或糞鏈球菌轉移到蘇云金芽孢桿菌的報道。

3.3 基因敲除

基因敲除是后基因組時代研究生防基因功能的手段，也可以用于去除細菌基因組上的冗余片段。

3.3.1 基因敲除載體的構建方法 基因敲除載體的構建有4種方法：①傳統酶切連接。傳統酶切連接方法是將待敲除基因的上游和下游DNA片段和抗生素抗性基因片段分別通過酶切和連接的方法克隆到基因敲除載體的多克隆位點。該方法的操作屬于分子生物學常規操作，缺陷是工作步驟繁瑣，不利于提高工作效率，且受內切酶選擇的限制。②使用Sfi I內切酶的酶切連接。Kamper[22]利用特殊的限制性內切酶Sfi I建立了一套相對快速、適用范圍廣的基因敲除載體構建方法。內切酶Sfi I識別相隔5個任意核苷酸的2組GGCC序列，設計擴增靶標基因的上下游片段和抗生素抗性基因片段引物時，在5′端加入該接頭，用Sfi I酶切這些片段并連接后就可得到待敲除基因DNA和抗生素抗性基因片段連接體。③高通量轉座子隊列法構建基因敲除載體。構建Cosmid或Fosmid基因組文庫，通過轉座酶促反應將攜帶篩選標記的轉座子隨機插入Cosmid或Fosmid破壞其中的基因，帶有被轉座子破壞基因的Cosmid或Fosmid可作為基因敲除載體。④融合PCR體系構建基因敲除載體。融合PCR技術簡便快捷，不需要內切酶消化和連接酶處理就可以實現不同來源DNA片段的體外連接。可將基因的上游片段、抗生素的抗性基因和基因的下游片段的末端設計成反向互補的末端，通過融合PCR方法構建基因敲除載體[23]。

3.3.2 基因敲除的方式 大體可分為定點敲除和隨機敲除兩類。定點敲除可采用基于自殺性質粒的同源重組、采用λ-Red系統的線性DNA介導的同源重組和位點特異性重組對目的敲除片段進行精確敲除；隨機敲除則利用轉座子能夠隨機插入或切離的特性，引起染色體內部同源重組，可以切除兩段重復序列之間的染色體DNA序列。在多粘類芽孢桿菌研究中，基因組基因敲除采用較多的是溫敏型自殺性質粒[24]及Cre/loxP位點特異性重組系統[21]。

3.4 其他分子操作手段

Han等[25]采用iTRAQ （Isobaric tag for relative and absolute quantitation）技術，在蛋白質組層面研究多粘類芽孢桿菌JSa-9廣譜抗革蘭氏陽性細菌、絲狀真菌的環狀脂酯肽抗生素LI-F型肽段AMP-jsa9拮抗蠟狀芽孢桿菌的作用模式。endprint

4 菌株選育

菌種選育是發酵產量提高的前提和基礎，一般是將菌株經過物理或化學誘變，從中篩選出正突變菌株。紫外線等射線等化學物理方法是常見的誘變手段，等離子體近年也作為誘變方法。這些方法可單獨使用，也可組合使用[4]。閆冬等[26]采用亞硝基胍（NTG）、60Co-λ射線和低能N+離子注入3種方法誘變多粘類芽孢桿菌JSa-9，從300株突變株中發現了2株LI-F類抗菌脂肽產量均提高的營養缺陷型菌株，2菌株遺傳穩定性良好。有研究者基于代謝工程選育高產菌，如Okonkwo等[27]研究產2，3-丁二醇多粘類芽孢桿菌對高濃度2，3-丁二醇的反應，發現多粘類芽孢桿菌產生2，3-丁二醇的最高濃度為47 g/L，2，3-丁二醇濃度超過極限值60 g/L后多粘類芽孢桿菌會將2，3-丁二醇轉化成乙偶姻。因此得出，設計多粘類芽孢桿菌2，3-丁二醇高產菌要克服2，3-丁二醇毒性和消除2，3-丁二醇的降解。還有研究者采用定向進化技術、組合生物合成和合成生物學等改造菌株。左佃光等[28]綜述了微生物非核糖體肽組合生物合成的研究策略，如NRPS基因簇的定點突變、NRPS模塊的替換、NRPS模塊的插入、NRPS模塊的刪除、NRPS組成模塊的“洗牌”以及NRPS基因簇的異源表達。多粘類芽孢桿菌EJS-3是從中藥植物組織中篩選分離到，其體外溶栓效果良好，但此菌株纖溶酶活性較低，錢輝等[29]克隆了纖溶酶基因整合到有AOX強效啟動子的畢赤酵母中分泌表達，獲得了纖溶酶產量是野生菌株2.6倍的重組酵母。

5 發酵技術優化

發酵技術優化一般考慮培養基優化、發酵條件優化和發酵過程優化3個角度。培養基優化主要是選擇適宜菌株生長、有利于目的產物大量表達、成本低、后處理工藝簡單的培養基，工業生產還要注重培養基原料的穩定性[4]。正交試驗（Orthogonal experiment）和響應面分析方法（Response surface methodology）常用于發酵技術優化[30-33]。

多粘類芽孢桿菌是目前發現惟一能高效生產光學純（R，R）-2，3-丁二醇的天然微生物，李億等[34]利用玉米粉高效發酵多粘類芽孢桿菌生產（R，R）-2，3-丁二醇。杜敬河等[35]采用單因素試驗探索多粘類芽孢桿菌生產甲殼素酶的最佳條件。程愛芳等[36]采用單因素試驗和正交試驗優化多粘類芽孢桿菌產β-甘露聚糖酶的培養基組分和培養條件。程愛芳等[37]采用單因素試驗和正交試驗優化多粘類芽孢桿菌HD-1產纖維素酶的培養基組分和培養條件。孫仲奇等[38]為了提高多粘菌素E產量，研究了5種碳源，發現可溶性淀粉有助于延長多粘菌素E的產素期和提高其合成速率。韓俊華等[39]采用響應曲面法優化多粘類芽孢桿菌HT16產生抗菌蛋白的培養基。趙國群等[40]采用新鮮鴨梨渣為主要原料，固態發酵多粘類芽孢桿菌，采用單因素試驗法研究培養條件對生長和產芽孢的影響，發現鴨梨渣是多粘類芽孢桿菌良好的固態發酵原料。

6 結語

學者們對多粘類芽孢桿菌功能和應用領域已有比較全面的了解，在其分子生物學作用機制以及菌株的分子生物學改造技術等方面還有較大的研究空間，進一步完善其分子操作系統、相關基礎研究，能為其深入利用提供前提條件。目前，多粘類芽孢桿菌的田間應用等領域的產業化推廣還存在一些限制條件，需要通過研究加以突破，比如田間應用中多粘類芽孢桿菌易受環境的影響，需深入研究其在復雜土壤環境中的表現。

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