Survivin基因調節人腦膠質瘤細胞侵襲與遷移機制的探討

●劉翠芳

Survivin基因調節人腦膠質瘤細胞侵襲與遷移機制的探討

●劉翠芳

目的：檢測并研究Survivin基因對U251及U87神經膠質瘤細胞侵襲及遷移的影響，為膠質瘤的基因治療提供理論和實驗依據。方法：（1）通過劃痕實驗及Transwell遷移實驗檢測細胞在干擾及過表達Survivin膠質瘤細胞遷移的變化；（2）通過Transwell侵襲實驗檢測細胞在干擾及過表達Survivin膠質瘤細胞侵襲能力的變化；（3）通過Westernblot和免疫熒光實驗檢測細胞在干擾Survivin 48h后N-cadherin表達及定位的變化；（4）通過明膠酶譜實驗檢測在干擾及過表達Survivin 48h后細胞分泌MMP的變化。結果：（1）針對Survivin特異性的三條siRNAoligo，干擾效率達70%-80%；過表達后轉染率在80%左右；（2）劃痕實驗Transwell實驗（不鋪膠）證實轉染siRNAoligo和過表達Survivin后細胞遷移數目明顯低于對照組(P＜0.01)，Transwell遷移實驗證實轉染siRNAoligo和過表達Survivin后穿過濾膜的細胞數目明顯低于對照組(P＜0.01)；（3）Transwell侵襲實驗證實轉染siRNAoligo和過表達Survivin后細胞侵襲數目明顯低于對照組(P＜0.01)；（4）明膠酶譜證實轉染siRNAoligo后細胞分泌基質金屬酶低于對照組，而過表達Survivin后高于對照組；明膠酶譜實驗顯示：與對照組相比，siRNAoligo組MMP2的活性明顯降低（P＜0.05）。結論：（1）Survivin基因調節神經膠質瘤細胞的遷移能力；（2）Survivin基因通過調節MMP2的分泌來影響神經膠質瘤細胞的侵襲能力；

神經膠質瘤；Survivin；細胞遷移；細胞侵襲；基質金屬酶

腦膠質瘤是臨床最為常見的原發性顱內腫瘤，約占顱內腫瘤的46%，占成年人全身腫瘤的2%；惡性膠質瘤的發病率為5～8/100萬。在世界范圍內膠質瘤是中樞神經系統最常見、死亡率最高的原發性腦腫瘤之一[1]，是威脅人類生命健康最主要的疾病之一，約占全部原發性神經系統腫瘤40～60%，年發病率5～10/10萬[2]。

1 資料與方法

1.1 一般資料

引物：質粒PG-survivin、PG由武漢晶賽生物公司合成并測序。

Survivin干擾序列為∶GGA CCA CCG CAT CTC TAC A。

β-actin：上游引物：5’-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3’

下游引物：5’-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3’

針對人Survivin基因特異性的三條siRNAoligo：

1.2 方法

1.2.1 細胞轉染(按Lipofectamine?2000說明書操作)

1.2.2 細胞劃痕試驗

1.2.3 細胞體外侵襲試驗

1.2.4 細胞體外遷移試驗

Transwell細胞培養小室的上室不鋪設Matrigel膠，其余方法步驟同4。

1.2.5 明膠酶譜試驗

1.3 統計學意義及作圖軟件

用于分析統計及作圖軟件為Image J、SPSS19.0、Adobe Illustrator CS4等，數據以均數±標準誤（±s )表示，統計分析方法采用選用兩樣本 t檢驗和單因素方差分析(One-way ANOVA)， ?P＜0.05差異有統計學意義，?? P＜0.01，有顯著性差異。

2 結果

2.1 在U251細胞中Survivin干擾、過表達效果的檢測

針對Survivin基因設計三條高特異性siRNA oligo，并請Genema公司合成，分別為Survivin-siRNA1、Survivin-siRNA2和Survivin-siRNA3。如圖1

圖1

2.2 轉染小干擾及過表達Survivin基因對膠質瘤細胞系U251遷移能力的影響

為研究Survivin對細胞遷移的影響，首先采用劃痕實驗，如圖1C所示，劃痕48h后陰性對照組劃痕已明顯縮小，并且有融合的趨勢，而轉染小干擾組的劃痕無明顯愈合，也無融合趨勢。如表1

表1 轉染siRNA后不同時間段劃痕實驗細胞數與對照組的比值

2.3 Survivin基因對膠質瘤細胞系U251侵襲能力的影響

以上結果表明Survivin基因可增加膠質瘤細胞的遷移能力，那么FRK是否對膠質瘤細胞的侵襲能力產生影響？為此利用Transwell侵襲實驗來進一步的探討。結果示：與陰性對照相比，干擾組細胞侵襲數目明顯減少；而與空載體組相比，過表達Survivin組細胞侵襲能力明顯增加。如表2

表2 染siRNAoligo及過表達不同時間段后Transwell侵襲實驗細胞數與對照組的比值

3 討論

細胞遷移和侵襲是一個動態的過程，這個過程需要很多蛋白的調節。惡性腫瘤的發生和惡性進展是一個逐步積累、多基因改變的多步驟過程，惡性腫瘤常表現出細胞無限增殖、凋亡減少、細胞周期調控異常、大量新生血管形成、遠處轉移等特征，膠質瘤也表現出惡性腫瘤的常見特征。

結果顯示：與陰性對照組相比，干擾組MMP2活性在轉染48h時明顯降低，而MMP9活性未檢測出。提示在U251細胞中干擾Survivin基因，可以降低MMP2蛋白的活性，下調MMP2的分泌，進而抑制了其遷移與侵襲的能力。

（作者單位：濱州醫學院免疫學教研室、東營市人民醫院）

[1]Kleihues P, Louis DN, Scheithauer BW, et al.The WHO classification of tumors of the nervous system [J] .Neuropathol Exp Neurol, 2001.61∶215-225