基于核酸適配體的肉制品中污染物檢測技術(shù)研究進展

李永波++張巍++張翠俠++張濤++張雅倫++周巍++張巖

摘 要：核酸適配體是經(jīng)體外篩選技術(shù)得到的能夠特異性結(jié)合靶物質(zhì)的由十幾個或幾十個核苷酸組成的寡聚核苷酸片段。適配體分子質(zhì)量較小、易于體外合成和修飾、化學穩(wěn)定性好，且不依賴于生物體或細胞環(huán)境，具有空間結(jié)構(gòu)多樣和靶標分子廣泛的特點，對包括金屬離子、有機小分子、生物分子，甚至細胞和微生物在內(nèi)的各類靶物質(zhì)具有特異性識別作用，被譽為“化學抗體”。本文綜述了核酸適配體的特點及其篩選方法，列舉了核酸適配體在肉制品非法添加物、金屬離子、病原微生物以及生物毒素檢測中的應(yīng)用，并對其應(yīng)用前景進行了展望。

關(guān)鍵詞：肉制品；核酸適配體；配體指數(shù)富集系統(tǒng)進化技術(shù)；制備；分析；應(yīng)用

Progress in Aptamer-Based Detection of Contaminants in Meat Products

LI Yongbo， ZHANG Wei， ZHANG Cuixia， ZHANG Tao， ZHANG Yalun， ZHOU Wei， ZHANG Yan*

（Hebei Food Inspection and Research Institute， Hebei Key Laboratory of Food Safety， Shijiazhuang 050071， China）

Abstract： Nucleic acid aptamers are oligonucleotide fragments consisting of more than a dozen or dozens of nucleotides that are capable of specifically binding to a target substance obtained by in vitro screening techniques. Aptamers are small molecules and are easily synthesized and modified in vitro. The chemical stability of aptamers is good and does not depend on the biological or cellular environment. Aptamers， also known as “chemical antibodies”， have the characteristics of diverse spatial structure and a wide range of target molecules and specifically recognize metal ions， organic small molecules， biological molecules， and even cells and microorganisms. This paper summarizes the recent literature regarding the binding characteristics of aptamers ligand and the existing methods for screening aptamers， and outlines the applications of aptamers in the detection of illegal additives， metal ions， pathogenic microorganisms and biological toxins in meat products. The prospects for future applications of aptamers are discussed as well.

Key words： meat products； nucleic acid aptamers； systematic evolution of ligands by exponential enrichment （SELEX）； preparation； analysis； application

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201709013

中圖分類號：TS251.5 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2017）09-0078-05

引文格式：

李永波， 張巍， 張翠俠， 等. 基于核酸適配體的肉制品中污染物檢測技術(shù)研究進展[J]. 肉類研究， 2017， 31（9）： 78-82. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201709013. http：//www.rlyj.pub

LI Yongbo， ZHANG Wei， ZHANG Cuixia， et al. Progress in aptamer-based detection of contaminants in meat products[J]. Meat Research， 2017， 31（9）： 78-82. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201709013. http：//www.rlyj.pub

20世紀以來，生物學飛速發(fā)展，成就層出不窮，不斷幫助人類認識自我、解密生命。近幾十年來，核酸一直作為遺傳物質(zhì)被大眾所熟知。隨著對脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）和蛋白質(zhì)相互作用的深入研究，Tuerk等[1]在1990年率先從帶有8 個隨機序列的RNA文庫中篩選到了T4 DNA聚合酶（gp43）的RNA序列，它能特異性結(jié)合噬菌體，該技術(shù)被命名為配體指數(shù)富集系統(tǒng)進化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術(shù)。同年，Ellington等[2]成功運用該技術(shù)從含有150 bp隨機序列的RNA文庫中篩選到6 種針對有機小分子染料的RNA寡核苷酸，并命名為“aptamer”，一般將其翻譯為“核酸適（識）體”、“核酸適配子（體）”或“適體”。1992年，Ellington等[3]又成功地從含有157 bp的隨機序列單鏈DNA（singlestranded DNA，ssDNA）庫中篩選出cibacron blue、reactive green 19和reactive blue 4的aptamer。從此，核酸適配體進入人們的視野，并不斷在新的領(lǐng)域得到應(yīng)用。endprint

1 核酸適配體簡介

核酸適配體是經(jīng)體外篩選技術(shù)得到的由十幾個或幾十個核苷酸組成的寡聚核苷酸片段（即ssDNA或RNA）。盡管ssDNA和RNA不同，但是經(jīng)核磁共振及X射線晶體衍射等方法發(fā)現(xiàn)，SELEX技術(shù)篩選得到的2 種適配體都能夠折疊形成諸如假結(jié)（pseudoknot）、發(fā)夾（hairpin）、莖環(huán)（stem-loop）和G-四聚體（G-tetramer）等熱力學穩(wěn)定的特殊三維空間結(jié)構(gòu)；基于其單鏈核酸結(jié)構(gòu)及空間結(jié)構(gòu)的多樣性，適配體可以通過結(jié)構(gòu)互補、范德華力、堿基堆積力、靜電和氫鍵等作用與靶分子特異性結(jié)合[4-7]。

SELEX技術(shù)通過靶分子與大容量化學合成的隨機寡核苷酸（主要是ssDNA和RNA）文庫作用，形成靶分子-寡核苷酸復(fù)合物，通過各種技術(shù)將其與游離寡核苷酸分離，再利用聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）體外擴增技術(shù)對形成的復(fù)合物中的寡核苷酸進行擴增。對可與靶分子特異性結(jié)合的寡核苷酸進行反復(fù)體外篩選及擴增，達到指數(shù)級富集的效果，最終獲得可以與靶分子特異性結(jié)合的核酸適配體[6]。通過這種方法篩選出的核酸適配體不依賴于生物體或細胞環(huán)境，對各類靶物質(zhì)都具有特異性識別作用，如金屬離子、有機小分子、生物分子，甚至細胞和微生物[8-9]，被喻為“化學抗體”[10]。

1.1 核酸適配體的優(yōu)點

相較于抗體和酶，核酸適配體的優(yōu)勢在于[11-15]：

1）篩選方便。核酸適配體通過化學合成的方法得到，不依賴于生物體，避免了動物實驗，因此具有篩選出無免疫源性或低免疫源性，甚至有毒靶分子的核酸適配體的潛能；通常制備免疫抗體至少需要3～6 個月，而核酸適配體的篩選周期一般為2～3 個月，有的甚至只需幾周。2）易于修飾和標記。核酸適配體的末端易于連接一些活性基團，有利于將其固定在材料基質(zhì)上，可以在末端修飾一些熒光基團等指示基團，便于檢測；而常規(guī)抗體的修飾要復(fù)雜得多，且成功率不高。3）特異性強、靶分子范圍廣。核酸適配體對體外篩選靶分子有很高的親和力，特異性強、目標廣泛，包括有機染料、維生素、藥物、氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、抗生素，甚至整個細胞、組織等；理論上任何靶物質(zhì)都可以通過SELEX技術(shù)篩選得到相應(yīng)的核酸適配體。4）親和力高。核酸適配體與靶分子形成的復(fù)合物的解離常數(shù)（dissociation constant，Kd）一般都在mmol/L級別，甚至可達pmol/L水平。5）穩(wěn)定性好。相較于抗體的容易變性，較高的熱穩(wěn)定性使得核酸適配體備受青睞，甚至變性的適配體也可以再生；且相對于蛋白質(zhì)抗體，核酸適配體的化學性質(zhì)更穩(wěn)定，保存時間更長，制成干粉可室溫保存，便于常溫運輸。6）分子質(zhì)量小。核酸適配體的分子質(zhì)量小，對于細胞的滲透性好，結(jié)合靶分子時的空間位阻小，具有進行高通量篩選的潛力。

1.2 核酸適配體的缺點

核酸適配體的篩選對儀器和設(shè)備有很高的精度要求，制備成本較高；目前研究中的核酸適配體制備方法繁雜，缺乏通用的SELEX篩選方法，且制備周期較長；在體內(nèi)，核酸適配體極易被胞內(nèi)的核酸酶降解[16]；核酸適配體應(yīng)用在醫(yī)學上時，常常由于其較低的分子質(zhì)量而被腎臟過濾出體外，造成藥物在體內(nèi)的利用率降低[17]。

2 核酸適配體的篩選

采用SELEX技術(shù)篩選核酸適配體包括5 個主要步驟：結(jié)合、分離、洗脫、擴增和調(diào)節(jié)[18]。其基本過程[19]如圖1所示：首先建立一個隨機寡核苷酸文庫，庫容約1015～1016 個，將靶分子加入到該文庫中，在特定的緩沖體系和適宜的溫度下孵育，待靶分子與文庫中的隨機核苷酸充分結(jié)合后，再利用過濾、親和層析、磁珠分離和毛細管電泳等物理方法分離與靶分子結(jié)合的核苷酸序列。洗脫和收集同靶分子結(jié)合的核苷酸序列，經(jīng)PCR擴增洗脫和收集得到的序列集成富集的次級文庫，再與原靶分子進行下一輪的篩選循環(huán)。每個靶分子一般要進行6～20 個連續(xù)循環(huán)，每輪篩選的同時可以設(shè)置親和力檢測實驗，當檢測到核酸文庫對靶分子的親和力不再增高時即可停止篩選。最后富集的文庫要通過克隆和測序來獲得最終能夠特異識別靶分子的適配體[18]。需要注意的是，大多數(shù)適配體與靶分子間的作用力為氫鍵，RNA文庫比DNA文庫更具有多樣性，但是所得適配體高度傾向被核酸酶結(jié)合。因此需要建立動態(tài)組合文庫，用新的方法來克服適配體化學穩(wěn)定性的問題[20-21]。

SELEX技術(shù)近年來獲得了快速發(fā)展，開發(fā)出了多種新型的篩選方法，大大降低了適配體的篩選周期、提高了篩選效率。例如以提高核酸適配體普適性為目的的篩選方法包括切換篩選（toggling SELEX）、混合篩選（blended SELEX）、表達盒篩選（expression SELEX）和復(fù)合靶篩選（complex targets SELEX）；以提高核酸適配體選擇性為目的的篩選方法包括光交聯(lián)篩選（photo SELEX）、消減篩選（subtractive SELEX）、反向篩選（counter SELEX）和負篩選（negative SELEX）；以縮短篩選周期為目的的篩選方法包括不放大篩選（non-SELEX）、自動化篩選（automated SELEX）和熒光磁珠篩選（fluMag SELEX）；將不同結(jié)合庫相結(jié)合以增加目標核酸適配體篩選機率的方法包括加尾篩選（tailored SELEX）和基因篩選（genomic SELEX）[13，22-24]。

圖 1 SELEX技術(shù)基本流程

Fig. 1 Scheme of SELEX technology

3 核酸適配體在肉制品檢測中的應(yīng)用

由于核酸適配體對靶分子具有高度的特異性和親和性，目前已將此技術(shù)應(yīng)用于醫(yī)療診斷、藥物研發(fā)、生物影像、色譜分析、生物傳感和食品檢測等領(lǐng)域，核酸適配體在這些領(lǐng)域正在扮演越來越重要的角色。肉制品與生鮮肉屬于快消產(chǎn)品，傳統(tǒng)的檢測方法耗時較長，不利于監(jiān)管，因此建立快速、準確、有效的檢測方法，甚至是現(xiàn)場檢測方法有非常大的現(xiàn)實需求。本文總結(jié)了近年來核酸適配體技術(shù)在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用，尤其是在肉品檢測中的應(yīng)用。endprint

3.1 非法添加物檢測

畜牧養(yǎng)殖中的非法添加物一直是影響肉制品質(zhì)量安全的重要因素，瘦肉精位列我國動物藥品禁用目錄之首，主要包括鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺3 種。鞏文慧[25]采用文庫固定化SELEX技術(shù)同時篩選制備鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺3 種瘦肉精的適配體，經(jīng)過16 輪正篩和7 次反篩及驗證后，獲得1 條可以同時識別鹽酸克倫特羅和沙丁胺醇的Apt-3序列，結(jié)合Kd分別為（38.45±7.01）、（47.00±6.42） nmol/L，表明此序列對2 種靶分子均有較高的結(jié)合能力；同時獲得了能分別特異性識別鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺的適配子，且Kd值都很高；實驗進一步構(gòu)建了熒光分析法，得到各個適配體的檢出限，并用于實際豬肉樣品的檢測，回收率為84.50%～110.50%，表明該實驗思路有進一步研究的空間。王勇[26]建立了采用毛細管電泳法和熒光實時定量PCR技術(shù)對篩選過程中的PCR結(jié)果進行表征的方法，利用毛細管電泳技術(shù)進行了4 輪SELEX篩選，得到13 條ssDNA，大大縮短了篩選次數(shù)。

抗生素作為獸藥過量使用會造成食源性動物食品中抗生素的殘留，損害人類健康，從而成為食品安全領(lǐng)域的重要議題。游元丁[27]構(gòu)建了一種基于石墨烯（Gr）及適配體的卡那霉素傳感檢測方法，對卡那霉素進行電化學檢測的結(jié)果表明，在優(yōu)化條件下用差分脈沖伏安法（differential pulse voltammetry，DPV）檢測卡那霉素，在1×10-6～1×10-5 mol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢出限為5×10-7 mol/L。高慧菊等[28]基于核酸適配體的高選擇性和氧化鈀納米顆粒標記聚合酶螯合物的雙重信號放大效應(yīng)，建立了快速檢測魚肉和鵝肉中痕量氯霉素的方法，在最佳實驗條件下，該方法具有較高的檢測靈敏度，且在0.02～150.00 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，檢測下限為0.01 ng/mL。

動物激素常被用作生長促進劑，被非法用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)，引發(fā)了諸如兒童性早熟等問題。白文薈[29]以適配體技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合納米金，并基于片段化適配體熒光猝滅機理建立了特異性良好的19-去甲基睪酮快速檢測方法，優(yōu)化后方法的檢測限為5 μmol/L，并在尿液樣品中成功應(yīng)用，3 個加標濃度下所得加標回收率為57.94%～118.76%，平均相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）小于7%，表明方法具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

3.2 重金屬檢測

廢氣、廢水排放以及污水灌溉、養(yǎng)殖等因素造成了重金屬在肉制品安全領(lǐng)域越來越受重視。相較于原子吸收昂貴、龐大的儀器設(shè)備以及檢驗成本，研究人員在核酸適配體領(lǐng)域已經(jīng)研發(fā)出了多種現(xiàn)場快速檢測重金屬的定性和半定量方法。

王法澤[30]根據(jù)顯色比色法的原理建立了檢測As3+的方法，其基本原理是氯化血紅素對3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺（3，3，5，5-tetramethylbenzidine，TMB）的催化作用；當溶液中不含As3+時，核酸適配體通過堆積作用使得氯化血紅素的催化活性受到抑制，對底物TMB的催化能力減弱，溶液呈現(xiàn)藍色；當溶液中含有As3+時，As3+可以與適配體ssDNA特異性結(jié)合形成復(fù)合結(jié)構(gòu)，這種復(fù)合結(jié)構(gòu)會阻礙堆積作用，因此氯化血紅素可以催化TMB，溶液由藍色變?yōu)辄S色。Chung等[31]建立了一種基于微流體傳感器，利用表面增強拉曼散射光譜分析樣品中微量Hg2+的方法，方法準確、快速，且靈敏度高。

3.3 病原微生物檢測

食源性病原微生物是世界各國食品安全面臨的普遍問題，其中又以沙門氏菌的危害最為普遍。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的相關(guān)報告[32]，1985年以來，全世界已確診的由沙門氏菌引起的患病人數(shù)顯著增加，一些歐洲國家的增幅甚至已達5 倍以上；在我國，由沙門氏菌引起的食品安全事件數(shù)量屢居首位。吳斌等[32]的研究表明，在我國的細菌性食物中毒事件中，70%～80%是由沙門氏菌引起的，而在由沙門氏菌引起中毒的食品中，肉類等動物性產(chǎn)品占90%以上。寧毅[33]在對碳納米管性質(zhì)研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合分子探針構(gòu)建了基于生物功能化的碳納米管生物傳感器對沙門氏菌進行檢測，所構(gòu)建的傳感器具有靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好等優(yōu)勢；對于適配體控制細菌菌膜形成的研究不僅拓展了適配體的應(yīng)用范圍，而且在減少抗生素的使用、降低耐藥性菌株的產(chǎn)生等方面也具有重要意義。Ko等[34]將鼠傷寒沙門氏菌的G蛋白標記上熒光猝滅分子，用標記了熒光分子的抗體去捕捉豬肉樣品中的菌體，根據(jù)熒光變化定量檢測豬肉中的鼠傷寒沙門氏菌，檢測下限達105 CFU/g。

徐李舟[35]提出了對4 種食源性致病菌同時分離和檢測的熒光適配體傳感器法的原理，并應(yīng)用到牛肉樣本中同時檢測大腸桿菌O157：H7、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和鼠傷寒沙門氏菌，是文獻報道中可同時檢測細菌種類最多的一種方法。付夢玉等[36]利用腸毒素大腸桿菌K88（E.coli K88）特異的適配體結(jié)合納米金和銀增強技術(shù)建立了一種約2 h檢測E.coli K88的可視化技術(shù)，檢測靈敏度達10 CFU/g，并通過人工模擬E.coli K88污染豬肉等食品原料對方法進行了驗證。Bruno等[37]針對空腸彎曲菌表面蛋白的MgCl2開發(fā)適配體，選擇了2 種親和性最高的適配體用于磁珠（magnetic beads，MB）和基于紅色量子點（quantum dots，QD）的夾心測定方案，并證實該熒光法可用于牛肉中空腸彎曲菌的檢測。Ohk等[38]開發(fā)了用于特異性檢測食品中單核細胞增生李斯特氏菌的抗體和適配體功能化的光纖生物傳感器，該方法成功檢測到了牛肉、雞肉和火雞肉中初始接種量為100 CFU/25 g的單核細胞增生李斯特氏菌。

3.4 生物毒素檢測

赭曲霉素A（ochratoxin A，OTA）是很多食品中普遍存在的毒枝菌素，在肉類產(chǎn)品中經(jīng)常檢出。研究人員已經(jīng)基于OTA適配體開發(fā)出了一系列快速原位檢測方法[39]。Yang等[40]以未修飾的納米金（gold nanoparticles，AuNPs）作為比色指示劑，在經(jīng)OTA適配體修飾的AuNPs穩(wěn)定溶液中加入OTA，當適配體特異性結(jié)合OTA時會改變構(gòu)象，變?yōu)镚-四分體結(jié)構(gòu)，從AuNPs表面脫離，溶液中繼續(xù)加入NaCl后，AuNPs會因靜電斥力而聚集，溶液顏色由紅變藍，經(jīng)驗證該方法檢出限可達20 nmol/L，靈敏度較高。Wang Libing等[41]研發(fā)了基于適配體修飾的AuNPs的比色層析側(cè)向流動裝置來檢測OTA，其原理是靶標物質(zhì)OTA和與適配體堿基互補的DNA探針共同存在于溶液中時會競爭結(jié)合吸附在AuNPs粒子表面的適配體，AuNPs粒子在溶液中由于毛細作用而在試紙上進行遷移，當檢測互補DNA探針結(jié)合AuNPs粒子表面的適配體時會發(fā)生顏色變化，根據(jù)顏色深淺可判斷樣品中OTA的濃度。endprint

玉米赤霉烯酮（zearalnenoe，ZEN）是鐮刀菌屬真菌在生長過程中所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，可以直接污染多種谷物、飼料以及肉、蛋、乳等諸多動物源性食品，是一種非常普遍的污染物。鄒綺[42]以ZEN毒素的單克隆抗體為靶標，成功篩選得到具有抗原內(nèi)影像關(guān)系的DNA適配子，在建立檢測方法時用它替代毒素本身，研發(fā)出低毒、環(huán)保的檢測試劑盒，確保毒素檢測過程中實驗人員的安全，同時能夠保護環(huán)境；實驗采用SELEX技術(shù)，以ZEN單克隆抗體為靶分子，經(jīng)過15 輪篩選，測得ssDNA富集文庫與ZEN單克隆抗體的親和力得到有效提升，接著又以46號克隆適配子建立酶聯(lián)寡核苷酸實驗檢測方法，批內(nèi)（7.6%）和批間差異（9.3%）均小于10%，表明該方法可靠性較好。

4 結(jié) 語

總體上講，將核酸適配體技術(shù)應(yīng)用到肉制品乃至食品中危害因子檢測的研究尚處于起步階段，將其應(yīng)用到實際檢測領(lǐng)域仍面臨很多問題：第一，食品種類繁多，成分復(fù)雜，造成了很強的背景干擾，需要利用固相萃取技術(shù)對肉制品樣品進行預(yù)處理；第二，目前已經(jīng)篩選得到的適配體數(shù)量有限，針對肉制品檢測的適配體更為稀少，大范圍篩選更多肉制品危害因子的適配體成為當務(wù)之急；第三，當前適配體篩選方法種類繁多，但大多周期較長、效率偏低、通量較小，開發(fā)高通量、低成本的篩選方法成為亟待解決的問題。

核酸適配體強大的功能及其快速發(fā)展為肉類中非法添加物、病原微生物、生物毒素和重金屬等危害因子的痕量快速檢測及分析提供了途徑，近年來材料技術(shù)的飛速發(fā)展為適配體提供了更加廣闊的檢測應(yīng)用前景。盡管核酸適配體檢測技術(shù)與傳統(tǒng)的檢測技術(shù)相比尚不成熟，但是我們有理由相信經(jīng)過不斷發(fā)展和完善，適配體技術(shù)必將在肉制品快速檢測領(lǐng)域占有一席之地。

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