2型糖尿病下肢血管病變與DNA氧化損傷的關系

2型糖尿病下肢血管病變與DNA氧化損傷的關系

陳吉海歐陽曉俊婁青林卞茸文

目的探討2型糖尿病合并下肢血管病變與機體DNA氧化損傷的關系。方法納入門診85例糖化血紅蛋白<9%的2型糖尿病病人作為研究組,按照踝肱比(ABI)水平將上述病人分為糖尿病合并下肢血管病變組(n=35)及無并發(fā)癥組(n=50);同時取60例正常人群作為正常對照組。使用ELISA方法測定血液單核細胞DNA氧化損傷指標8羥基脫氧鳥嘌呤(8-OHdG)水平,并在3組間進行比較,同時采用Logistic回歸分析糖尿病合并下肢血管病變的危險因素。結果糖尿病合并下肢血管病變組與無并發(fā)癥組間年齡、病程、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、糖化血紅蛋白等指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。糖尿病合并下肢血管病變組血液8-OHdG水平為(4.03±1.89)ng/ml,無并發(fā)癥組血液8-OHdG水平為(2.74±1.64) ng/ml,均較正常對照組[(0.53±0.53) ng/ml]升高(P<0.05),且糖尿病合并下肢血管病變組較無并發(fā)癥組亦升高(P<0.05)。Logistic回歸分析顯示,8-OHdG以及LDL-C是糖尿病合并下肢血管病變的危險因素。結論2型糖尿病合并下肢血管病變病人體內(nèi)DNA氧化損傷較正常人及無并發(fā)癥糖尿病病人嚴重,提示DNA氧化損傷在糖尿病下肢血管病變中發(fā)揮了一定程度的致病作用。

2型糖尿病; 下肢血管病變; 8羥基脫氧鳥嘌呤; DNA氧化損傷

糖尿病下肢血管病變是糖尿病常見的并發(fā)癥之一,也是糖尿病足的致病因素和高危因素。前期研究提示氧化應激損傷在糖尿病發(fā)病中起著重要作用,并可能與糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展密切相關。但關于氧化應激與糖尿病下肢血管病變的研究,目前較少。且前期研究大多集中在觀察血清中炎癥因子的變化,來間接反映氧化應激與糖尿病的關系。8羥基脫氧鳥嘌呤(8-OHdG)是DNA的氧化核苷,是DNA氧化損傷最直接、最敏感的生物指標,可直接反映DNA氧化損傷程度及機體氧化應激水平。我們對比觀察了不同組間病人的8-OhdG水平,分析DNA氧化損傷與糖尿病下肢血管病變的關系。

1 對象與方法

1.1 對象 選取我院門診及住院的2型糖尿病病人85例作為糖尿病組,年齡51～78歲,平均(58.63±14.69)歲,其中男42例,女43例。按照踝肱比(ABI)是否<0.9的標準,將糖尿病病人分為糖尿病合并下肢血管病變組及無并發(fā)癥組;其中合并下肢血管病變的糖尿病病人共30例,無并發(fā)癥組55例。同時選取50例正常人群為正常對照組。

2型糖尿病診斷標準參考1999年WHO糖尿病診斷標準;糖尿病下肢血管病變診斷標準為有糖尿病病史,且ABI<0.9。入選標準:(1)不吸煙的2型糖尿病病人;(2)合并高血壓病人入選前平臥位血壓<180/110 mmHg。排除標準:(1)吸煙;(2)長期使用維生素C及維生素E等抗氧化劑;(3)長期使用他汀等降血脂類藥物;(4)長期使用其他影響機體氧化應激狀態(tài)的藥物;(5)長期使用非甾體抗炎藥、激素或免疫抑制劑治療;(6)嚴重肝功能障礙(丙氨酸氨基轉移酶/天冬氨酸氨基轉移酶高于正常上限2倍);(7)合并糖尿病急性并發(fā)癥;(8)合并急性感染、急性心腦血管疾病等。本研究得到江蘇省老年醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2 方法

1.2.1 提取DNA:對于符合條件的糖尿病病人及正常對照組人群各抽取5～10 ml空腹靜脈血,使用鹽析法提取DNA。

1.2.2 DNA的酶消化:溶解200 μg DNA至135μl水中;加入乙酸鈉及核酸酶P1至DNA溶解液中,37 ℃下孵育后,加入1 mmol Tris-HCl緩沖液及2 U 堿性磷酸酶。水解產(chǎn)物過純化柱,離心并收集離心的液體,取50 μl DNA消化產(chǎn)物用于ELISA試劑盒檢測。

1.2.3 ELISA試劑盒檢測:使用ELISA試劑盒(IMKOGNW 050915E,Catalog No. KOG200S/E)檢測提取的DNA中8-OHdG的含量。

1.3 統(tǒng)計學處理 統(tǒng)計學分析均采用SPSS 18.0軟件。統(tǒng)計分析前,使用Kolmogorov-Smirnov檢測數(shù)據(jù)是否呈正態(tài)分布,非正態(tài)分布數(shù)據(jù)將進行對數(shù)轉換。正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示,2組間均數(shù)比較采用獨立樣本間t檢驗,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析;轉換后仍為偏移數(shù)據(jù)的將采用Mann-Whitney U檢驗。危險因素分析采用Logistic回歸分析,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 基線對比 將入選對象按照正常對照組、糖尿病無并發(fā)癥組及糖尿病合并下肢血管病變組進行基線資料比較。結果提示,3組間資料除年齡外,糖化血紅蛋白、病程、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平差異均無統(tǒng)計學意義。正常對照組年齡較糖尿病組偏低,但糖尿病組內(nèi)2組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.099)。

表1 3組間基線資料比較()

2.2 正常對照組與糖尿病組8-OHdG水平的比較 正常對照組血8-OHdG水平為(0.62±1.04) ng/ml,糖尿病無并發(fā)癥組為(2.84±1.59) ng/ml,糖尿病合并下肢血管病變組為(4.08±2.05) ng/ml,3組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

2.3 下肢血管病變與8-OHdG的關系 將是否合并下肢血管病變作為因變量,以血清8-OHdG水平、年齡、性別、糖尿病病程、糖化血紅蛋白水平、LDL-C為自變量進行Logistic回歸分析,結果提示,8-OHdG水平、LDL-C水平與糖尿病下肢血管病變有關。見表2。

表2 下肢病變與8-OHdG關系的Logistic回歸分析

3 討論

氧化應激被認為是糖尿病并發(fā)癥的重要發(fā)病機制之一[1-3]。在糖尿病病人中,DNA的斷裂、嘧啶環(huán)的氧化及嘌呤位點的改變較正常對照組均明顯升高,而這些改變均提示糖尿病與氧化應激有著重要聯(lián)系[4-5]。在高血糖環(huán)境中,一方面,體內(nèi)抗氧化酶表達受到抑制[6];另一方面,線粒體電子傳遞鏈生成的電力學梯度產(chǎn)生的活性氧(ROS)和超氧自由基增多[7]。過多的ROS可以直接導致DNA的損傷[8],同時還可激活與糖尿病并發(fā)癥有關的己糖胺途徑、多元醇通路等的激活;此外還可導致氧化性更強的過氧化硝酸鹽合成增加,從而使硝化酪氨酸水平增高,造成DNA的損傷和組織細胞的凋亡,進一步促使糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[9]。

8-OHdG是DNA中鳥嘌呤氧化損傷的特異產(chǎn)物,被認為是內(nèi)源性氧自由基引起DNA損傷的一種標志[10]。Leinonen等[11]發(fā)現(xiàn)在2型糖尿病中,尿中的8-OHdG較正常對照組水平明顯升高。本文作者既往研究也發(fā)現(xiàn)糖尿病微血管并發(fā)癥與血清8-OHdG水平密切相關,但對于糖尿病大血管病變與DNA氧化損傷水平的關系,目前尚不明確,且研究較少,尤其是在糖尿病合并下肢血管病變的病人中。

本研究著重探討上述病人間血清8-OHdG水平的差異,并同時對病程、糖化血紅蛋白、LDL-C、血8-OHdG與糖尿病合并下肢血管病變的關系進行分析。并且,本次試驗是通過ELISA方法測定血單核細胞DNA提取液中8-OHdG的含量,分析方法較目前的高效液相色譜法電化學檢測法特異度、靈敏度更高;而且與以往以尿液作樣本相比,本實驗所采用的靜脈抽血的提取樣本的方式更為方便,利于現(xiàn)場及大型人群分析,同時也能排除尿液中多種代謝產(chǎn)物及雜質(zhì)對結果的干擾。

本研究結果顯示,糖尿病組與正常對照組相比,血8-OHdG水平顯著升高(P<0.001),與既往研究結果一致[12]。這也證實了在糖尿病病人中,由于血糖的升高,超氧化物、糖基化產(chǎn)物等高糖代謝產(chǎn)物的蓄積,以及多元醇等氧化通路的激活,使糖尿病病人機體DNA氧化損傷較正常對照組明顯增多。此外,糖尿病合并下肢血管病變組與無并發(fā)癥糖尿病組相比,除LDL-C水平外,兩者間2組年齡、病程、糖化血紅蛋白均無顯著性差異(P>0.05),但其血清8-OHdG水平較無并發(fā)癥組顯著升高,提示DNA的氧化應激損傷在糖尿病下肢血管病變的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。此外,為進一步排除其他因素對結果的影響,我們將下肢血管病變與血清8-OHdG水平、糖化血紅蛋白、LDL-C等因素進行Logistic回歸分析,結果提示血清8-OHdG水平與下肢血管病變間有獨立的相關關系,提示當DNA氧化損傷逐步加重時,會促進糖尿病病人下肢血管病變的發(fā)生和發(fā)展。此外,結果也提示,LDL-C水平與下肢血管病變也密切相關,這也提示在糖尿病下肢血管病變的發(fā)病中,血脂紊亂也發(fā)揮了很大的作用。

總之,糖尿病合并下肢血管病變的病人體內(nèi)8-OHdG較正常人及無并發(fā)癥的糖尿病病人明顯升高,提示在糖尿病合并下肢血管病變的病人中,DNA氧化損傷較正常人及無并發(fā)癥糖尿病病人嚴重。這也為抗氧化應激治療在糖尿病下肢血管病變病人中的應用提供了依據(jù),并可通過監(jiān)測8-OHdG水平評估治療效果。

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RelationshipbetweendiabeticperipheralvasculardiseaseandoxidativedamagetoDNA

CHENJi-hai,OUYANGXiao-jun.

DepartmentofGeriatrics;LOUQing-lin.DepartmentofEndocrinology;BIANRong-wen.DepartmentofChronicDiseaseandHealthManagementCenter,JiangsuGeriatricHospital,Nanjing210024,China

ObjectiveTo investigate the relationship between diabetic peripheral vascular disease and oxidative damage to DNA in patients with type 2 diabetes mellitus (T2DM).MethodsPatients with diabetes mellitus were divided into peripheral vascular disease group (n=35) and non-complication group (n=50). At the same time, 60 healthy subjects were enrolled as normal control group. DNA was extracted from mononuclear cells from whole blood, and the level of serum 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine (8-OHdG) was detected and compared between the three groups. Logistic regression analysis was used to identify the relationship between 8-OHdG and diabetic peripheral vascular disease.ResultsT2DM patients had significantly higher level of 8-OHdG than control group. In addition, the level of 8-OHdG in peripheral vascular disease group was significantly higher than that of the patients without complication(P<0.05)). Logistic regression showed that 8-OHdG and low density lipoprotein cholesterol were risk factors of diabetic peripheral vascular disease.ConclusionsT2DM patients with diabetic peripheral vascular disease showed greater oxidative damage to DNA, which is a risk factor of diabetic peripheral vascular disease.

type 2 diabetes mellitus; diabetic peripheral vascular disease; 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine; oxidative damage

國家自然科學基金面上項目(71373132)

210024 江蘇省南京市，江蘇省老年醫(yī)院干部保健科一區(qū)(陳吉海，歐陽曉俊)；內(nèi)分泌科(婁青林)；慢病及健康管理中心(卞茸文)

卞茸文，Email：bianrw@126.com

R 587.2

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2017.10.012

2016-11-08)