生物防腐劑的保鮮機(jī)理及應(yīng)用

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(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,江蘇南京 210014;2.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院食品科學(xué)系,江蘇南京 210097;3.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇南京 210095)

生物防腐劑的保鮮機(jī)理及應(yīng)用

王筱夢(mèng)1,2,江蕓2,孫芝蘭1,*,劉芳1,王道營(yíng)1,張新笑1,諸永志1,徐為民1,3

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,江蘇南京 210014;2.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院食品科學(xué)系,江蘇南京 210097;3.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇南京 210095)

食品加工、貯運(yùn)過(guò)程中由微生物引起的腐敗變質(zhì)一直是食品保鮮領(lǐng)域所面臨的世界性難題。因化學(xué)防腐劑的使用所帶來(lái)的安全隱患越來(lái)越不容忽視,安全、高效的生物防腐劑的開發(fā)逐漸成為食品保鮮領(lǐng)域的重點(diǎn)。但生物防腐劑作用靶點(diǎn)相對(duì)單一、成本較高一直制約其發(fā)展。如何合理組合不同的生物防腐劑,在降低單因素強(qiáng)度的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)協(xié)同攻擊腐敗菌越來(lái)越受重視。本文系統(tǒng)梳理以細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、胞內(nèi)遺傳物質(zhì)及以革蘭氏陰性菌細(xì)胞外膜層為損傷目標(biāo)的生物防腐劑,歸納它們的作用方式和在食品保鮮中的應(yīng)用效果,并對(duì)未來(lái)的研究重點(diǎn)進(jìn)行展望,以期能為生物防腐保鮮劑的精準(zhǔn)復(fù)配提供理論依據(jù)。

生物防腐劑,保鮮機(jī)理,保鮮應(yīng)用

食品加工、貯運(yùn)過(guò)程中極易受到微生物污染而腐敗變質(zhì),不僅造成資源浪費(fèi),而且嚴(yán)重危害消費(fèi)者的身體健康。如何有效控制微生物腐敗是肉品工業(yè)需面對(duì)的世界性難題。

目前國(guó)內(nèi)外實(shí)踐中最常用的殺菌方式是高溫高壓方法[1],殺菌效果穩(wěn)定,但由于熱變性劇烈,導(dǎo)致肉制品肌纖維的斷裂而喪失彈性、保水性,破壞乳制品營(yíng)養(yǎng)成分等。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者在食品保藏方面做了大量的工作。一方面,發(fā)現(xiàn)物理、化學(xué)、生物方法如高壓脈沖電場(chǎng)、化學(xué)防腐劑、細(xì)菌素和植物提取物等殺菌或抑菌方法[2],但不同的手段可能僅對(duì)某些特定的菌種有效,即使特定的菌種,因某一個(gè)單一因素通常只針對(duì)一個(gè)特定的靶點(diǎn),強(qiáng)度也勢(shì)必會(huì)增加,因此存在強(qiáng)度與品質(zhì)、成本的矛盾[3]。另一方面,目前的殺菌手段多數(shù)以損傷細(xì)胞膜為主,其次細(xì)胞壁和胞內(nèi)物質(zhì),細(xì)胞壁為多孔的網(wǎng)格結(jié)構(gòu),小分子物質(zhì)可以自由出入,較少影響殺菌效果,因而多數(shù)殺菌手段對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌(G+)有效。而革蘭氏陰性菌(G-)細(xì)胞壁外包裹著一層厚厚的外膜層,成分主要為脂多糖,從而形成天然屏障,多數(shù)殺菌手段無(wú)法通過(guò)外膜層屏障,因而很難起到殺菌作用[4]。這也是多數(shù)殺菌劑對(duì)G-作用效果不顯著的主要原因,但是食品中主要的腐敗菌腸桿菌或假單胞菌都是G-[5],這成為目前防腐劑開發(fā)領(lǐng)域普遍遇到的難題。再者,食品中微生物菌相復(fù)雜,即使同一廠家不同的生產(chǎn)批次,也會(huì)導(dǎo)致微生物菌相差異[6],目前生產(chǎn)廠家多憑經(jīng)驗(yàn)隨機(jī)組合各種手段,需多次嘗試防腐效果,耗時(shí)耗力,也浪費(fèi)大量的資源。本文希望通過(guò)梳理不同生物防腐劑的殺菌機(jī)理,為科學(xué)合理地由外至內(nèi),多靶點(diǎn)精準(zhǔn)調(diào)控微生物的損傷奠定理論基礎(chǔ)。

圖1 革蘭氏陰性菌與陽(yáng)性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)肽聚糖水解酶水解位點(diǎn)[10]Fig.1 Cell wall structure peptidoglycan hydrolase targets of gram negative bacteria and positive bacterial[10]注:1:酰胺酶(N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶)作用位點(diǎn);2、3、4:肽鏈內(nèi)切酶作用位點(diǎn);5、6:糖苷酶(5:N-乙酰胞壁酸酶;6:N-乙酰葡萄糖胺酶)作用位點(diǎn)。

1 以細(xì)胞壁為損傷目標(biāo)的生物防腐劑

細(xì)胞壁(cell wall)位于細(xì)胞的最外層,在維持細(xì)胞固有形態(tài)、防止細(xì)胞在低滲溶液中脹裂、維持細(xì)胞完整性等方面起著重要的作用,為微生物抵抗外界環(huán)境的第一道屏障[7]。肽聚糖為細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分,如圖1a,在G+中,其占細(xì)胞壁干重的50%～80%。肽聚糖是由N-乙酰胞壁酸(MurNAc)和N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)交替連接的雙糖單位、肽尾和肽橋組成的多層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[8]。肽聚糖水解酶因?yàn)槟懿鹕㈦木厶菍?造成細(xì)胞壁的瓦解成為攻擊細(xì)胞壁進(jìn)而殺死微生物的有力武器,在食品防腐保鮮中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[9]。肽聚糖水解酶依據(jù)其作用底物的特異性分為四大類型:N-乙酰葡萄糖胺酶、N-乙酰胞壁酸酶、N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸酰胺酶以及內(nèi)肽酶(圖1b)。N-乙酰葡萄糖胺酶和N-乙酰胞壁酸酶統(tǒng)稱為糖苷酶,可特異性催化水解雙糖單位的β-1,4糖苷鍵;而N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸酰胺酶催化水解N-乙酰胞壁質(zhì)酸和肽尾第一個(gè)氨基酸之間的酰胺鍵;內(nèi)肽酶催化水解肽尾兩個(gè)氨基酸之間的肽鍵或者肽橋之間的肽鍵[10]。肽聚糖水解酶來(lái)源廣泛,目前研究較深入的為溶菌酶、來(lái)源于噬菌體的裂解酶及存在于微生物細(xì)胞壁中,在細(xì)胞分裂生長(zhǎng)過(guò)程中水解肽聚糖的酶類等。

1.1溶菌酶

溶菌酶為研究最多并被批準(zhǔn)應(yīng)用于食品防腐的一類肽聚糖水解酶[11]。該酶將細(xì)胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽,導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂,細(xì)菌裂解。溶菌酶在室溫下可長(zhǎng)期保存,在酸性環(huán)境中,耐熱性好,化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,而在堿性環(huán)境中該酶的熱穩(wěn)定性較差。溶菌酶可以分為動(dòng)物源、植物源和微生物源溶菌酶,其來(lái)源不同,作用機(jī)制也有所不同。動(dòng)物源溶菌酶包括雞蛋清溶菌酶及人和哺乳動(dòng)物溶菌酶。雞蛋清中溶菌酶含量最高,目前研究和應(yīng)用也最多。該酶由129個(gè)氨基酸組成,相對(duì)分子量在14000～18000 Da。其等電點(diǎn)可達(dá)10.7,存在4個(gè)二硫鍵,主要為糖苷酶。植物源溶菌酶分子量較大,其溶菌活性小于雞蛋清溶菌酶,但其對(duì)膠體狀甲殼質(zhì)的分解活性遠(yuǎn)大于蛋清溶菌酶。微生物源溶菌酶除了水解糖苷鍵、酰胺鍵和肽鍵之外,還包括β-1,3、β-1,6-葡聚糖酶、甘露糖酶(主要用于分解酵母細(xì)胞的細(xì)胞壁)、殼聚糖酶(分解霉菌的細(xì)胞壁)。溶菌酶作為一種天然的安全性能很好的防腐劑,已廣泛應(yīng)用于食品防腐、醫(yī)藥制劑、日用化工等行業(yè)。Iaconelli等[12]將雞蛋清溶菌酶應(yīng)用于奶酪生產(chǎn)中防止由腐敗菌造成的后期產(chǎn)氣現(xiàn)象。Silvetti[13]將溶菌酶添加到生啤中以延長(zhǎng)保質(zhì)期。Enrique[14]等研究發(fā)現(xiàn)溶菌酶保鮮液對(duì)南美白對(duì)蝦致病菌(如溶藻弧菌、溶血性弧菌以及霍亂弧菌)具有明顯的抗菌作用,能夠有效延長(zhǎng)南美白對(duì)蝦的貨架期。G+中細(xì)胞壁組分90%為肽聚糖,因而溶菌酶對(duì)G+的細(xì)胞壁破壞性較強(qiáng),該酶可水解G+中的枯草桿菌、葡萄球菌、乳酸菌等。G-中肽聚糖含量較少,僅內(nèi)壁層為肽聚糖,因此溶菌酶對(duì)它的細(xì)胞壁的破壞力較弱,但部分溶菌酶仍對(duì)大腸桿菌、普通變球菌和副溶血性弧菌等G-有一定的溶解作用。除此之外溶菌酶還可與帶負(fù)電荷的病毒蛋白直接結(jié)合,與DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復(fù)鹽,使病毒失活。

1.2噬菌體裂解酶

噬菌體裂解酶是由噬菌體自身基因編碼的,在噬菌體釋放過(guò)程中,水解其宿主菌細(xì)胞壁的一類肽聚糖水解酶。一般來(lái)說(shuō),G+噬菌體裂解酶的結(jié)構(gòu)域相似,由N-端催化結(jié)域和C-端結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成,二者之間由小片段連接。序列分析表明,同一類裂解酶的催化域高度保守,而細(xì)胞結(jié)合域同源性較低。研究表明,無(wú)論在體外還是體內(nèi),單獨(dú)的N-端催化結(jié)構(gòu)域是沒(méi)有裂解活性的,只有當(dāng)N端與C端同時(shí)存在時(shí)才具有催化活性。根據(jù)催化結(jié)構(gòu)域的作用位點(diǎn),裂解酶分為糖苷酶、酰胺酶和內(nèi)肽酶三類。噬菌體裂解酶一般具有單一的催化位點(diǎn),但某些噬菌體裂解酶可同時(shí)擁有兩個(gè)甚至三個(gè)不同的催化域,如葡萄球菌噬菌體φ11和無(wú)乳鏈球菌噬菌體B30的裂解酶等[15-16]。與G+噬菌體裂解酶不同,G-噬菌體(T4、T7和P22等)所編碼的裂解酶通常為球形蛋白,僅有N-端結(jié)構(gòu)域,但其親和力仍保持較高水平,且具有更廣的結(jié)合譜,如銅綠假單胞菌噬菌體裂解酶KZ144等。

噬菌體裂解酶作為新型抗菌劑具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。具有較高的特異性,僅攻擊其宿主菌或近緣物種,因此該酶不影響寄生在人體中的正常菌群,也不影響其他細(xì)胞,不會(huì)對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生毒副作用;與宿主特異性底物結(jié)合,細(xì)菌幾乎不會(huì)產(chǎn)生耐藥性;其作為一種酶類制劑,不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生致病性。鑒于此,噬菌體裂解酶已經(jīng)成為一種頗具潛力的殺菌劑。目前利用噬菌體裂解酶治療病原菌感染,尤其抵御耐藥性致病菌方面已取得重大進(jìn)展,而在食品安全控制方面仍處于起步階段。Zimmer[17]等發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氣莢膜桿菌噬菌體裂解酶Ply3626對(duì)多株測(cè)試的產(chǎn)氣莢膜桿菌具有裂解活性,可作為新型食品防腐劑,用于食品的生物防治。葡萄球菌為引起奶牛乳房炎的致病菌,可引起產(chǎn)奶量下降,嚴(yán)重可使奶牛發(fā)病致死。Obeso[18]等構(gòu)建了重組裂解酶LysH5,該酶在pH7.0,37 ℃條件下,能夠快速殺死金黃葡萄球菌,因此可用于乳制品的生物防治。雖然噬菌體裂解酶作為新型抑菌劑有安全、無(wú)抗藥性產(chǎn)生等優(yōu)勢(shì)。但是仍存在殺菌譜窄和殺菌活性低的問(wèn)題,因此將裂解酶不同結(jié)構(gòu)域組合重排,構(gòu)建裂解活性提高、裂解譜拓寬的嵌合型殺菌劑,是生物防腐領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)。

1.3其它肽聚糖水解酶

除上述兩種主要的肽聚糖水解酶,某些微生物合成的細(xì)胞壁蛋白也具有肽聚糖水解活性,在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂、分離、分化、自溶和細(xì)胞壁的翻轉(zhuǎn)等生理功能中發(fā)揮重要作用,S層蛋白即為其中之一。S層蛋白(Surface layer)是存在于細(xì)菌及古細(xì)菌細(xì)胞外由蛋白質(zhì)或糖蛋白質(zhì)亞單位組成的單分子層晶格狀結(jié)構(gòu)。2006年,Ahn[19]等對(duì)胞壁質(zhì)水解酶調(diào)節(jié)系統(tǒng)cid/lrg調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究時(shí),偶然發(fā)現(xiàn)炭疽芽孢桿菌的S層蛋白Sap和EA1具有肽聚糖水解酶活性。Acosta[20]等研究發(fā)現(xiàn),嗜酸乳桿菌的S層蛋白能損傷細(xì)胞壁,抑制大腸桿菌和芽孢桿菌的生長(zhǎng)。作者所在研究室也發(fā)現(xiàn)卷曲乳桿菌K313的S層蛋白SlpB可水解腐生葡萄球菌的細(xì)胞壁,抑制其生長(zhǎng)繁殖,將其應(yīng)用于肉品保鮮中,可延長(zhǎng)貨架期,因而具有作為添加劑應(yīng)用于食品保鮮的潛力。Acosta等通過(guò)測(cè)定嗜酸乳桿菌的S層蛋白SA的水解產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)氨基酸含量增加,推測(cè)SA可能為內(nèi)肽酶。但是S層蛋白對(duì)肽聚糖的水解機(jī)制及在食品保鮮中的應(yīng)用潛力還有待進(jìn)一步研究。

2 以細(xì)胞膜為損傷目標(biāo)的生物防腐劑

細(xì)胞膜可防止細(xì)胞外物質(zhì)自由進(jìn)入胞內(nèi),保證細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定,使各種生化反應(yīng)能夠有序運(yùn)行,為保護(hù)細(xì)胞的第二道屏障。細(xì)胞膜由磷脂雙分子層和蛋白質(zhì)及外表面的糖被(糖蛋白)組成。作為第二道保護(hù)屏障,一旦細(xì)胞膜受到損傷,胞內(nèi)物質(zhì)泄露,細(xì)胞無(wú)法維持正常的生理代謝,即造成死亡。生物殺菌劑多以損傷細(xì)胞膜為目標(biāo),其中最具代表性的為細(xì)菌素、聚賴氨酸和植物精油。

2.1細(xì)菌素

細(xì)菌素是細(xì)菌代謝過(guò)程中合成的具有抑菌性質(zhì)的多肽類物質(zhì)。它可以廣泛地抑制G+,尤其是抑制單增李斯特菌等腐敗菌和病原菌,并可在人體內(nèi)進(jìn)行生物降解和消化,對(duì)人體健康無(wú)害,因而可作為食品添加劑運(yùn)用到食品保藏過(guò)程中。細(xì)菌素根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和相對(duì)分子質(zhì)量可以分成4大類[21],第一類細(xì)菌素(class I)稱為羊毛硫細(xì)菌素,是一類小分子的修飾肽,含有羊毛硫氨酸,β-甲基羊毛硫氨酸等非編碼氨基酸,可在細(xì)胞膜上形成孔道,從而導(dǎo)致細(xì)胞膜內(nèi)外的離子失衡。第二類細(xì)菌素(class Ⅱ)是不經(jīng)修飾的小分子的熱穩(wěn)定肽,相對(duì)分子質(zhì)量小于10 kDa,其抗菌機(jī)理同樣為使細(xì)胞膜形成孔洞,造成胞內(nèi)物質(zhì)泄露。第三類細(xì)菌素(class Ⅲ)是熱不穩(wěn)定的大分子蛋白,相對(duì)分子質(zhì)量一般大于10 kDa,目前研究并不深入。第四類細(xì)菌素(class Ⅳ)能與其他大分子組成復(fù)合型的蛋白復(fù)合體,需與特定的碳水化合物或類脂結(jié)合才能發(fā)揮作用。其中第一、二類細(xì)菌素由于高活性和專一性已被開發(fā)作為食品防腐保鮮劑,應(yīng)用最廣的是第一類中的Nisin。

Nisin由乳酸鏈球菌產(chǎn)生的由34個(gè)氨基酸組成的抑菌肽,為I類細(xì)菌素。它是唯一一個(gè)被批準(zhǔn)應(yīng)用在食品和飲料中的細(xì)菌素。Nisin具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性,對(duì)胰凝乳蛋白酶敏感,對(duì)胰蛋白酶和鏈霉蛋白酶不敏感。目前已報(bào)道的有六種類型,分別為Nisin A[22]、Nisin Z[23]、Nisin Q[24]、Nisin F、Nisin U和NisinU2[25]。Nisin的抑菌機(jī)理已研究的較為深入,首先Nisin通過(guò)疏水或靜電作用與敏感菌株細(xì)胞壁中的陰離子組分(磷壁酸、酸性多糖或磷脂)結(jié)合穿過(guò)細(xì)胞壁,到達(dá)細(xì)胞膜。隨后與細(xì)胞膜中的脂II結(jié)合。脂II為細(xì)胞壁合成過(guò)程中肽聚糖單體的運(yùn)輸載體,一旦Nisin與脂II結(jié)合,肽聚糖單體供應(yīng)不足,導(dǎo)致細(xì)胞壁合成受阻,細(xì)胞死亡。除此之外2個(gè)或4個(gè)Nisin-脂質(zhì)Ⅱ復(fù)合物可在靶細(xì)胞膜上形成穩(wěn)定的孔洞(圖2),導(dǎo)致膜通透性增加,膜電位消散,內(nèi)容物泄露最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[26-28]。羅欣等[29]將Nisin應(yīng)用到牛肉保鮮中,顯著延長(zhǎng)了保鮮期。江蕓[30]等也將Nisin運(yùn)用于鮮豬肉的保鮮,發(fā)現(xiàn)Nisin對(duì)肉中的G+有明顯的抑菌作用。片球菌素是由片球菌分泌到胞外的一類熱穩(wěn)定小分子多肽,為Ⅱ類細(xì)菌素。片球菌素同樣使敏感菌的細(xì)胞膜上形成孔洞,而導(dǎo)致胞內(nèi)鉀、無(wú)機(jī)磷酸鹽等離子的流失,最終導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)子驅(qū)動(dòng)勢(shì)(PMF)的喪失。PMF包括膜電位ΔΨ和氫濃度差ΔpH,與Nisin不同,片球菌素可導(dǎo)致ΔpH的完全喪失以及ΔΨ的部分喪失,而Nisin會(huì)導(dǎo)致ΔΨ和ΔpH的完全喪失[31]。片球菌素在肉制品中的應(yīng)用較多,研究表明涂有片球菌素的火腿片,李斯特菌和沙門氏菌顯著降低,貨架期延長(zhǎng)。Buyong等[32]將片球菌素應(yīng)用于奶酪發(fā)酵中,其抑制李斯特菌的效果顯著[33]。

圖2 nisin對(duì)細(xì)胞膜的作用圖[26]Fig.2 The action of nisin on cell membrane

細(xì)菌素的作用機(jī)制主要為在細(xì)胞膜產(chǎn)生孔洞,造成胞內(nèi)物質(zhì)泄露,細(xì)胞死亡。Ⅰ類和Ⅱ類細(xì)菌素,分子量較小,易穿過(guò)肽聚糖層到達(dá)細(xì)胞膜,對(duì)G+有較好的殺菌效果,然而它們無(wú)法穿過(guò)G-的外膜層,因而對(duì)G-的抑菌效果較差。只有極少數(shù)細(xì)菌素如microcin E492[34],能識(shí)別G-外膜層的受體TonB,然后穿過(guò)外膜層進(jìn)入內(nèi)膜,因而能殺死G-。另外Ⅲ類細(xì)菌素分子量一般較大,不易穿過(guò)肽聚糖層,因而其抑菌譜較窄且抑菌效果較差。

2.2聚賴氨酸

ε-聚賴氨酸ε-Poly-L-Lysine(ε-PL)是由微生物分泌的一種由賴氨酸單體通過(guò)α-羧基和ε-氨基形成酰胺鍵連接而成的均聚氨基酸[35]。ε-PL對(duì)細(xì)菌、真菌及病原體均有抑制作用,具有抑菌譜廣、活性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、安全性高等優(yōu)點(diǎn)[36],可以作為一種天然、安全、高效的食品添加劑。ε-PL的抑菌活性與其聚合度密切相關(guān),研究發(fā)現(xiàn)25～35個(gè)氨基酸殘基的ε-PL具有更強(qiáng)的抗微生物活性,通常作為食品防腐劑[37]。SHIMA[38]等發(fā)現(xiàn)ε-PL通過(guò)靜電作用吸附到細(xì)胞膜表面,使細(xì)胞膜物理裂解,內(nèi)容物流出而菌體死亡。Yamanaka等[39]也發(fā)現(xiàn)經(jīng)ε-PL處理過(guò)的細(xì)胞會(huì)滲漏出一種參與三羧酸循環(huán)的酶(NADH依賴的蘋果酸脫氫酶MDH),并且隨著細(xì)胞存活率的降低,MDH釋放量增加,說(shuō)明細(xì)胞膜受到損傷。另外,ε-PL可抑制微生物的呼吸作用,使ATP和NADH虧損,合成代謝受阻最終導(dǎo)致動(dòng)態(tài)膜結(jié)構(gòu)不能維持,細(xì)胞自溶[40]。馮建嶺[41]研究了ε-PL對(duì)大腸桿菌的抑菌機(jī)理:ε-PL能改變大腸桿菌細(xì)胞外膜和細(xì)胞內(nèi)膜的通透性,使細(xì)胞正常形態(tài)遭到破壞,膜內(nèi)外離子失衡,細(xì)胞正常生理活動(dòng)遭到干擾,最終細(xì)胞崩潰死亡,這也就支持了上述觀點(diǎn):ε-PL的抑菌方式是作用于細(xì)胞膜上的一種物理活動(dòng)[42]。莫樹平等[43]將ε-PL應(yīng)用在廣式臘腸的防腐中,菌落總數(shù)及揮發(fā)性鹽基氮均顯著降低。Hyldgaard[44]將ε-PL應(yīng)用在新鮮的火雞肉中,能顯著抑制惡臭假單胞菌的繁殖。除了對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生物理?yè)p傷之外,ε-PL也能通過(guò)靜電作用吸附到G-的外膜層,釋放脂多糖,改變外膜層的通透性,同時(shí)能干擾胞內(nèi)蛋白和核酸類物質(zhì)的合成,因而具有較廣的抑菌譜,成為具有較大應(yīng)用潛力的食品防腐劑。

2.3植物精油或提取物

植物精油或提取物是一類植物次生代謝物質(zhì),分子量較小[45]。國(guó)外對(duì)植物精油或提取物的抑菌機(jī)理研究較多,現(xiàn)已逐步深入到細(xì)胞、分子水平等研究層面。植物精油對(duì)革蘭氏陰性和陽(yáng)性菌均有抑制作用,抑菌譜較廣[46],其對(duì)細(xì)胞膜的作用方式可造成細(xì)胞不可逆的損傷。有學(xué)者[47]認(rèn)為植物精油抗菌成分為一些天然酚類和萜類物質(zhì),因此植物精油抗菌作用方式與其他酚類物質(zhì)相似[48];酚類物質(zhì)不僅作用于細(xì)胞膜從而改變細(xì)胞滲透性并釋放出胞內(nèi)物質(zhì)如核糖、谷氨酸鈉等,而且還能干擾膜的正常生理功能如電子轉(zhuǎn)移、營(yíng)養(yǎng)吸收、蛋白質(zhì)及核酸合成和酶活性等;植物精油抗菌作用機(jī)理可能是這些作用中的一種或多種。植物精油和其組成部分有一個(gè)重要特征是它們的疏水性。所以有學(xué)者[49]認(rèn)為精油的疏水性結(jié)構(gòu)能夠分離細(xì)胞膜與線粒體上的脂類,使細(xì)胞通透性增加。導(dǎo)致一些離子物質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)容物的滲漏[50-52]。盡管細(xì)菌細(xì)胞某種程度的泄漏不會(huì)使細(xì)胞活力喪失,但是內(nèi)容物的大量損失和離子等物質(zhì)的滲漏會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。研究表明香芹酚作用于蠟狀芽孢桿菌的細(xì)胞膜上,溶解在磷脂雙分子層之中,在脂肪酸鏈中排成一列[53],這種扭曲的物理結(jié)構(gòu)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜的膨脹和不穩(wěn)定,增加膜的流動(dòng)性,反過(guò)來(lái)會(huì)影響膜的滲透性。K Pandima Devi[54]等研究發(fā)現(xiàn)丁香酚與傷寒沙門氏菌細(xì)胞膜相互作用,破壞細(xì)胞膜,從而起到抑菌活性。也有研究表明[55]丁香酚的疏水性使它能夠穿透革蘭陰性菌膜的脂多糖并改變細(xì)胞結(jié)構(gòu),隨后導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)成分泄漏使其死亡。

目前已有學(xué)者將植物精油應(yīng)用在新鮮肉類的保鮮中。Khanjari等[56]將牛至精油添加羧甲基殼聚糖中,結(jié)合真空包裝可將新鮮雞肉的貨架期延長(zhǎng)到14 d。張慧蕓[57]等制備了丁香精油-殼聚糖復(fù)合可食包裝膜用于生肉糜中抑菌保鮮,發(fā)現(xiàn)在4 ℃冷藏的條件下生肉糜的貨架期可達(dá)10～12d,保鮮效果良好。植物精油或提取物來(lái)源豐富,已作為天然防腐保鮮劑投放市場(chǎng),但仍存在以下問(wèn)題應(yīng)深入研究:植物精油是一類天然混合物,其成分眾多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜,有效成分分離困難。因此不清楚具體是哪種或哪幾種成分發(fā)揮作用,影響其作用效果。部分植物精油具有刺激性氣味,限制了其在食品保鮮中的應(yīng)用。

3 以胞內(nèi)酶或遺傳物質(zhì)(DNA)為損傷目標(biāo)的生物防腐劑

除了損傷細(xì)胞壁和細(xì)胞膜,某些小分子也可通過(guò)自由擴(kuò)散或細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入胞內(nèi),干擾胞內(nèi)核酸物質(zhì)和蛋白質(zhì)代謝殺死靶細(xì)胞。如來(lái)源于大腸桿菌的細(xì)菌素Mccb17,可通過(guò)孔蛋白OmpF和內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Sbma相繼穿過(guò)外膜和內(nèi)膜到達(dá)胞內(nèi)。隨后Mccb17通過(guò)抑制DNA促旋酶活性從而干擾DNA的復(fù)制[58]。細(xì)菌素MccJ25可識(shí)別外膜層的鐵載體受體FhuA,隨后經(jīng)TonB-SbmA轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)進(jìn)入胞內(nèi)。進(jìn)入細(xì)胞后 MccJ25通過(guò)抑制mRNA轉(zhuǎn)錄而抑制菌體生長(zhǎng)[59]。細(xì)菌素MccC7-C51可通過(guò)位于內(nèi)膜層的YejABEF轉(zhuǎn)運(yùn)入胞內(nèi),隨后經(jīng)胞質(zhì)氨肽酶催化生成天冬氨酰-腺苷酸,其可抑制天冬氨酰-tRNA合成酶活性,從而阻斷mRNA的合成[60]。

諾卡噻唑菌素、硫鏈絲菌肽和其他的一些抑菌肽也可結(jié)合敏感菌株的核糖體rRNA,抑制蛋白質(zhì)的合成[61]。某些植物精油或提取物除了能損傷細(xì)胞壁(膜),也能進(jìn)入胞內(nèi),干擾遺傳物質(zhì)的合成,進(jìn)而殺死細(xì)菌。Chung[62]等認(rèn)為蒿屬植物Vulgarone B精油的抗菌機(jī)制與 DNA 裂解有關(guān)。因?yàn)榻?jīng)vulgarone B處理的質(zhì)粒pBR322和λDNA,超螺旋結(jié)構(gòu)解體,產(chǎn)生大量線性DNA片段,表明Vulgarone B精油能損壞細(xì)菌DNA。殼聚糖是甲殼素脫乙酰化的衍生物,為天然生物抗菌物質(zhì),研究發(fā)現(xiàn)低聚殼聚糖同樣可穿透微生物細(xì)胞,抑制mRNA轉(zhuǎn)錄,從而殺死靶細(xì)胞[63]。

4 以G-外膜層為損傷目標(biāo)的生物防腐劑

G-細(xì)胞壁外包裹著一層厚厚的外膜層,由脂多糖、脂蛋白和脂質(zhì)雙層組成。多數(shù)抗菌劑在外膜層上無(wú)特定的受體,因而很難起到殺菌作用。因此越來(lái)越多的學(xué)者開始將目光投向能損傷外膜層的生物防腐劑上。殼聚糖和植物精油是目前已知的典型代表。

4.1殼聚糖

殼聚糖是生物多糖甲殼素的衍生物,研究表明其對(duì)部分G-有較高的抗菌活性[64]。做為聚合高分子物質(zhì),殼聚糖雖然無(wú)法通過(guò)G-的外膜,但它的C-2位氨基的pKa在6.3～7.0左右,在酸性溶液中氨基可以質(zhì)子化帶正電,因而可以與外膜層的陰離子相互作用,破壞外膜層。Helander[65]發(fā)現(xiàn),在SDS的存在下殼聚糖可激活銅綠假單胞菌和鼠傷寒沙門氏菌的水解,這是因?yàn)闅ぞ厶强善茐耐饽?增強(qiáng)了SDS對(duì)內(nèi)膜的溶解。含高陽(yáng)離子鼠傷寒沙門氏菌突變體比親本菌株更耐殼聚糖說(shuō)明殼聚糖對(duì)外膜層的破壞力與菌株表面的陰離子直接相關(guān)。目標(biāo)菌株表面攜帶的負(fù)電荷越多,將會(huì)吸附更多的殼聚糖,細(xì)胞表面則聚集更多的正電荷,這必將破壞外膜的完整性,最終導(dǎo)致細(xì)胞壁和細(xì)胞膜通透性顯著增大,細(xì)胞溶解死亡。因此,比起G+,G-由于其細(xì)胞表面攜帶更多的負(fù)電荷,比G+更容易對(duì)殼聚糖敏感[66]。段靜蕓等[67]將殼聚糖應(yīng)用于冷卻鮮豬肉的保鮮,結(jié)果表明:1%酸溶性殼聚糖溶液可將保鮮期延長(zhǎng)至7 d。劉占東等[68]制備了肉桂精油殼聚糖納米粒,可顯著改善冷卻豬肉的貨架期。雖然殼聚糖具有無(wú)毒、生物相容性、生物可降解性、高化學(xué)活性等優(yōu)點(diǎn),但殼聚糖作為抑菌劑還存在最小抑菌濃度高,且只有酸溶性殼聚糖溶液才具有抑菌活性,中性和堿性環(huán)境體系中不具有抑菌活性也極大限制了殼聚糖在食品保鮮中的應(yīng)用。

4.2植物精油

除了殼聚糖,部分植物精油或提取物也能損傷G-的外膜層[69]。Helander等[70]發(fā)現(xiàn)香芹酚和百里香酚能夠瓦解G-外膜,釋放脂多糖(LPS)進(jìn)而增加細(xì)胞膜的通透性。百里香精油,可導(dǎo)致歐文氏菌外膜蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變,從而破壞外膜層起到抗菌作用[71]。

5 結(jié)語(yǔ)

近些年來(lái),生物防腐劑的作用機(jī)理已取得一定進(jìn)展,從損傷指示菌的外膜層、細(xì)胞壁、到改變細(xì)胞膜的滲透性,導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)泄露,細(xì)胞溶解直到損傷胞內(nèi)核酸等遺傳物質(zhì)。但目前食品貯藏過(guò)程中,多數(shù)還是通過(guò)控制單一因素來(lái)達(dá)到食品的保鮮,這勢(shì)必會(huì)增加每個(gè)因素的強(qiáng)度,從而影響品質(zhì)。另外某一個(gè)單一因素通常只針對(duì)一個(gè)特定的靶點(diǎn),例如多數(shù)細(xì)菌素通常作用于細(xì)胞膜,造成膜穿孔而使胞內(nèi)物質(zhì)泄露,除了極少數(shù)細(xì)菌素,它們?cè)谕饽由蠠o(wú)特定的受體,因而很難起到殺菌作用。肽聚糖水解酶能水解細(xì)胞壁的肽聚糖造成細(xì)胞裂解,對(duì)G+有較好的抑菌效果,但是G-細(xì)胞壁肽聚糖層較薄,肽聚糖層對(duì)G-的屏障保護(hù)作用不如G+那么強(qiáng),并且肽聚糖水解酶也不能穿過(guò)外膜層順利到達(dá)細(xì)胞壁,從而起到裂解作用。基于此,德國(guó)學(xué)LeLisoter博士提出的一套用于食品保藏的科學(xué)理論[72],即柵欄技術(shù),將抑制腐敗菌生長(zhǎng)繁殖的多個(gè)柵欄因子協(xié)同作用,以最大限度地形成不利于微生物生長(zhǎng)的微環(huán)境。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外也逐步將柵欄理論應(yīng)用于食品保鮮中,曾友明等用Nisin和溶菌酶復(fù)配可將低溫肉制品保鮮期達(dá)到3個(gè)月以上[73]。Vardaka[74]將柑橘提取物和殼聚糖復(fù)配應(yīng)用于真空包裝的火雞肉,抑制了大腸桿菌和沙門氏菌的生長(zhǎng),將保質(zhì)期延長(zhǎng)至21 d以上。但目前的研究多集中在對(duì)不同的柵欄因子防腐效果的研究上,針對(duì)不同的產(chǎn)品,多憑經(jīng)驗(yàn)自由組合,需多次嘗試防腐效果,耗時(shí)耗力,也浪費(fèi)大量的資源。這就需要以細(xì)胞模型為基礎(chǔ),系統(tǒng)研究不同柵欄因子的防腐機(jī)理,有效針對(duì)微生物細(xì)胞的不同靶點(diǎn),如細(xì)胞外膜層、細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和胞內(nèi)核酸和蛋白等,科學(xué)合理的由外至內(nèi),從多方面打破其內(nèi)環(huán)境平衡,則可實(shí)現(xiàn)有效的柵欄交互作用,比應(yīng)用單一而高強(qiáng)度的柵欄更為有效。

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Preservationmechanismandapplicationsofbiologicalpreservatives

WANGXiao-meng1,2,JIANGYun2,SUNZhi-lan1,*,LIUFang1,WANGDao-ying1,ZHANGXin-xiao1,ZHUYong-zhi1,XUWei-min1,3

(1.Institute of Agricultural Products Processing,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Nanjing 210014,China;2.Department of Food Science,Ginling College,Nanjing Normal University,Nanjing 210097,China;3.Jiangsu Collaborative Innovation Center of Meat Productionand Processing,Quality and Safety Control,Nanjing 210095,China)

Spoilage caused by microorganisms during the food processing,storage and transportation process has been a worldwide problem in the field of food preservation. Due to the security risks can not be ignored caused by the use of chemical preservatives,the development of safe and efficient biological preservatives has gradually become the focal point. However,the single target and high-cost of biological preservative restricts its development. So how to combine different biological preservatives reasonably and achieve multi-target attack on the spoilage bacteria on the basis of reducing the intensity of single factor has attracted more and more concern. In this paper,the biological preservative with the target of cell wall,cell membrane,intracellular genetic material and outer membrane layer of gram negative bacteria were systematically reviewed. Their mode actions and applications in food preservation were summarized,and further studies in this area are also suggested. This work will provide a theoretical basis for the precise combination of biological preservatives.

biological preservatives;preservation mechanism;preservation applications

TS201.3

A

1002-0306(2017)19-0304-08

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.056

2017-04-14

王筱夢(mèng)(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：肉品安全與質(zhì)量控制，E-mail：625196221@qq.com。

*通訊作者:孫芝蘭(1984-)，女，博士，副研究員，研究方向：肉品安全與質(zhì)量控制，E-mail：zhilan408@163.com。

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目(CX(15)1008)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31601530)；江蘇省產(chǎn)學(xué)研合作項(xiàng)目(BY2015073-01)。