響應面法優化石榴葉總酚的亞臨界水提取工藝

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(中國林業科學研究院林產化學工業研究所,國家林業局林產化學工程重點開放性實驗室,江蘇南京 210042)

響應面法優化石榴葉總酚的亞臨界水提取工藝

閆林林,鄭光耀*,韋朝寬

(中國林業科學研究院林產化學工業研究所,國家林業局林產化學工程重點開放性實驗室,江蘇南京 210042)

本研究采用亞臨界水萃取法提取石榴葉總酚,并通過響應面法優化其提取工藝參數。在單因素實驗的基礎上,根據響應面Box-Behnken實驗設計原理,采用三因素三水平的分析法,選取提取溫度、提取時間、液料比為自變量,考察其對石榴葉提取物中總酚含量的影響,并通過方差分析優化其工藝。結果表明,回歸方程對實驗擬合較好,可以對石榴葉中總酚含量進行很好的分析和預測;優化后的最佳工藝條件為:提取溫度134 ℃、提取時間31 min、液料比52∶1 mL/g。在該條件下,石榴葉總酚含量為169.24 mg GAE/g,與預測值173.31 mg GAE/g基本一致。通過與溶劑加熱回流法相比較,亞臨界水提取可明顯提高石榴葉總酚的含量,并縮短提取時間。

石榴葉,總酚,亞臨界水提取,響應面法

石榴葉為石榴科(Punicaceae)石榴屬(Punica)植物石榴(PunicagranatumL.)的葉,據《圖經本草》記載“榴葉者,去咽喉燥渴,止下痢漏精,消食祛火之功效”[1]。研究表明,石榴葉含有豐富的多酚及黃酮類活性物質,如鞣花酸、沒食子酸、短葉蘇木酚、熊果酸等,具有抗氧化、抗腫瘤、收斂止血等功效[2-5],是潛在的天然抗氧化劑的來源。目前,石榴葉已被開發為石榴茶,具有健脾、防暑、爽心明目、抗氧化等保健作用[6]。然而,絕大部分石榴葉資源還是被作為廢棄物丟棄,造成了資源的浪費。因此,對石榴葉中酚類物質的研究對于石榴資源的充分開發和利用具有重要意義。

目前,對石榴葉中酚類物質的提取,一般多采用有機溶劑或熱水浸泡提取、加熱回流提取、超聲提取等技術,存在著耗時長、提取率低、提取溶劑污染環境等問題[1,7-9]。亞臨界水提取技術是近年來發展起來的一種新興的提取技術,具有提取時間短、高效率、綠色環保等優勢,已被廣泛應用于多種植物材料中酚類物質的提取[10-11]。有研究表明亞臨界水萃取可以提高石榴籽中多酚的提取率[12],但是針對亞臨界水提取石榴葉總酚及其工藝優化的研究尚缺乏。因此,本研究首次采用亞臨界水提取法,以石榴葉提取物中總酚含量為指標,選取提取溫度、提取時間、液料比為自變量,結合響應面Box-Behnken實驗設計原理,優化石榴葉總酚的提取工藝,旨在為石榴葉中多酚的開發和利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

石榴葉 采集于2016年10月,于南京市玄武區鎖金北路，將采集的石榴葉用清水洗凈后放置于烘箱40 ℃下干燥后,用中藥粉碎機粉碎,過60目篩后,將石榴葉粉末置于-20 ℃冰箱備用；福林酚試劑(Folin-Ciocalteu reagent) 美國Sigma公司;沒食子酸標準品(純度>90%)、鞣花酸標準品(純度>98%) 南京春秋生物工程有限公司;乙腈和甲酸 色譜級,默克公司;碳酸鈉、無水甲醇等 均為分析級,國藥集團。

LC-20AT HPLC-PAD液相色譜工作站 配有自動進樣器(SIL-20A)、PDA檢測器(SPD-20A)、柱溫箱(CTO-10AS) 日本島津;UV-2102 PC型紫外-可見分光光度計 尤尼克(上海)儀器有限公司;TGL-16C型高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;亞臨界水萃取裝置(自制),如圖1所示。

圖1 亞臨界水萃取裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of the subcritical water system注：1:加熱裝置;2:物料籃;3:氮氣瓶;4:萃取釜;5:冷卻器;6:收集器;P:壓力表;T:溫度指示器;M:電機;A、B:調節閥。

1.2實驗方法

1.2.1 亞臨界水提取單因素實驗 精確稱取一定量的石榴葉粉末,置于亞臨界萃取裝置的萃取罐中,在不同提取溫度(100～200 ℃)、提取時間(10～100 min)和液料比(20∶1～60∶1 mL/g)的條件下提取,重復提取兩次后合并提取液,將所得到的提取液以4000 r/min的速度離心10 min后,取上清液定容至一定體積,備用。具體為:考察一系列提取溫度(100～200 ℃)對石榴葉提取物中總酚含量及其抗氧化活性的影響,在固定提取時間為20 min,液料比為50∶1 mL/g的前提下,對石榴葉總酚進行亞臨界水提取;考察一系列提取時間(10～100 min)對石榴葉提取物中總酚含量的影響,在固定提取溫度為130 ℃,液料比為50∶1 mL/g條件下,對石榴葉總酚進行亞臨界水提取;考察一系列液料比(20∶1～60∶1 mL/g)對石榴葉提取物中總酚含量的影響,在固定提取溫度為130 ℃,提取時間為30 min的條件下,對石榴葉總酚進行亞臨界水提取。

1.2.2 加熱回流提取 參照文獻[1]中的方法,稱取一定量的石榴葉粉末,置于圓底燒瓶中,分別按照液料比50∶1 mL/g加入純水和75%乙醇水溶液,在80 ℃的水浴中回流提取2 h,將得到的提取液以4000 r/min的速度離心10 min后取上清液,殘渣再按上述條件重復提取一次,分別合并兩次的提取液,定容至一定體積,備用。

1.2.3 福林酚法測定石榴葉提取物中總酚含量 采用福林酚比色法測定石榴葉提取物中總酚的含量[8]。首先制作標準曲線:精確稱取沒食子酸標準品0.0050 g,用蒸餾水溶解并定容于50 mL容量瓶中,配制成濃度為0.1 mg/mL的沒食子酸標準液。將標準液稀釋至一系列濃度后,精確量取一定體積,分別加入5 mL棕色容量瓶中,向其中各加3 mL蒸餾水,振蕩搖勻,再加入0.25 mL 福林酚試劑,充分搖勻。靜置1 min后,加入20% 碳酸鈉溶液0.75 mL,混勻后定容至5 mL,避光靜置90 min,于760 nm波長下測定吸光值。石榴葉中總酚含量的測定按上述方法進行,將樣品測得的吸光值代入標準曲線,計算得出的石榴葉總酚含量用mg GAE(gallic acid equivalent)/g表示。

1.2.4 HPLC法測定石榴葉提取物中鞣花酸含量 石榴葉中含有豐富的酚類物質,其中包括大量鞣花酸[8],本研究中采用高效液相色譜(HPLC)法對石榴葉提取物中鞣花酸的含量進行測定和比較,具體色譜條件和方法參考相關文獻并作改進[8]。色譜柱:Diamonsil RP-C18色譜柱(250 mm,4.6 mm,5 μm);流動相:0.2%甲酸水(A):乙腈(B)=80%:20%;等濃度洗脫;流速為1.0 mL/min;檢測波長254 nm;柱溫為30 ℃;運行時間為20 min。

鞣花酸標準曲線的制作:精密稱取一定量的鞣花酸標品10.0 mg,配制成濃度為1.0 mg/mL的標準母液,依次用甲醇稀釋成一系列濃度的標準品工作液,分別進HPLC分析。

1.2.5 石榴葉提取物的抗氧化活性評價 石榴葉提取物的抗氧化活性評價參照文獻中的DPPH自由基和ABTS自由基清除實驗進行[8],具體如下。

DPPH自由基清除力測定:分別取0.1 mL待測樣品溶液加入5 mL離心管中,再分別向各管中依次加入0.25 mL新鮮配制的DPPH·甲醇溶液(濃度為1 mmol/L)和2 mL甲醇。將上述反應液混勻后,于室溫下避光放置20 min,以純甲醇作空白對照,于517 nm測定吸光值。DPPH自由基清除率(%)按以下公式計算,即RSA(%)=100×(A0-As)/A0,其中,A0表示0.25 mL DPPH·溶液加入2.1 mL甲醇在517 nm處的吸光值;As表示0.25 mL DPPH·溶液加入0.1 mL樣品溶液和2 mL甲醇在517 nm處的吸光值。

ABTS自由基清除力測定:分別取0.15 mL待測樣品溶液加入5 mL玻璃試管中,再分別向各試管中加入2.85 mL用甲醇新鮮配制的ABTS+·工作液,將上述反應液混勻后,室溫下避光放置10 min,最后于734 nm處測定吸光值。ABTS+·自由基清除率按照公式計算,即RSA(%)=100×(A0-As)/A0,其中,A0表示0.15 mL甲醇加入2.85 mL ABTS+·工作液在734 nm處的吸光值;As表示0.15 mL 樣品溶液加入2.85 mL ABTS+·工作液在734 nm處的吸光值。

為了對石榴葉提取物的抗氧化活性進行統一比較,首先通過測定一系列濃度的抗壞血酸(Ascorbic acid)對DPPH和ABTS自由基的清除率,制作標準曲線,得到其線性回歸方程(DPPH:y=462.41x+2.6803,R2=0.9996;ABTS:y=1337.4x-3.1569,R2=0.9998);再將測得的石榴葉提取物的自由基清除率(%)代入標準曲線,從而得出石榴葉總酚提取物清除DPPH和ABTS自由基能力的抗壞血酸當量(mg Ascorbic acid/g干物質樣品)。

1.2.6 響應面法優化實驗設計 在單因素實驗的基礎上,選取提取溫度、提取時間、液料比這三個因素,以總酚含量為指標,按照Box-Behnken 實驗設計原理,設計3因素3水平實驗(見表1),根據回歸模型分析確定各因素的影響,以總酚含量為響應值(Y)作等值線圖與響應曲面圖,分析優化最佳提取條件,從而對石榴葉總酚的提取方法進行工藝優化。

表1 響應面分析實驗因素與水平表Table 1 Factors and levels Table of response surface analysis

1.2.7 統計學分析 實驗數據通過SPSS 20.0軟件進行分析,并進行方差分析和多重比較,每個實驗條件下,均進行3次平行操作,結果以平均值±標準差來表示。響應面分析采用Design-Expert 8.0.6軟件進行,并進行模型優化。

2 結果與分析

2.1石榴葉提取物中總酚含量、鞣花酸含量標曲的繪制

以沒食子酸濃度為橫坐標(x),吸光值(OD)為縱坐標(y),建立標準曲線,得到福林酚法測定石榴葉提取物中總酚含量的線性回歸方程:y=104.42x+0.0283,R2=0.9991,沒食子酸在濃度范圍0.005～0.030 mg/mL內線性關系良好。

以鞣花酸濃度(μg/mL)為橫坐標(x),以峰面積(mV)為縱坐標(y)制作標準曲線,得到HPLC法測定石榴葉提取物中鞣花酸含量的回歸方程:y=240390x-4612.9,R2=0.9994,鞣花酸在濃度范圍為0.01～2.00 μg/mL內線性關系良好。圖2是鞣花酸標準品及石榴葉提取物的高效液相色譜圖。

圖2 鞣花酸標準品及石榴葉提取物的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of ellagic acidand pomegranate leaves extracts注:A:鞣花酸標品;B:石榴葉提取物。

2.2單因素實驗

據文獻[13]報道,提取壓力在亞臨界水提取過程中對提取效率的影響不大,因此本實驗中暫未考慮壓力變化對石榴葉總酚提取效果的影響,固定提取壓力為3.0 MPa,研究提取溫度、提取時間和液料比這3個因素對石榴葉中總酚含量及其抗氧化活性的影響。

2.2.1 提取溫度的影響 由圖3A可知,隨著提取溫度的升高,總酚含量逐漸升高,在100～130 ℃升高趨勢較為明顯,但超過130 ℃后再繼續升高溫度,總酚含量有明顯下降的趨勢。在亞臨界水提取過程中,提取溫度起著重要的作用,溫度的升高可以提高亞臨界水對提取材料中酚類物質的溶解性,可以加速分子擴散運動,達到類似于有機溶劑的效果;但是過高的提取溫度也會造成其中某些熱不穩定酚類物質的降解,從而導致總酚含量降低[14-15]。通過對石榴葉提取物中鞣花酸含量的測定發現,隨著溫度的升高(100～200 ℃),鞣花酸含量不斷增加。這可能是因為石榴葉中含有的大量鞣花單寧,在高溫條件下不穩定,易降解形成小分子物質如鞣花酸等[16-17],而鞣花酸在較高溫度下相對穩定。但由于本實驗中最高提取溫度為200 ℃,溫度超過200 ℃之后鞣花酸的變化趨勢還有待進一步探究。為了篩選出最佳提取溫度,并得到具有潛在抗氧化活性的石榴葉提取物,本研究通過DPPH自由基和ABTS自由基清除力實驗比較了不同溫度下石榴葉提取物的抗氧化活性(見圖3B)發現,隨提取溫度的變化,抗氧化活性的強弱趨勢與總酚含量的變化趨勢有一定的相似性,而與鞣花酸含量的相關性不大,這與文獻報道的結果相似[16]。因此,本實驗選取130 ℃作為后續實驗中的亞臨界水提取石榴葉總酚的提取溫度。

圖3 提取溫度對石榴葉總酚、鞣花酸含量(A)及其抗氧化活性(B)的影響Fig.3 Effects of extraction temperatureon the contents of total phenolic and ellagic acid(A),and antioxidant activities(B)of pomegranate leaves

2.2.2 提取時間的影響 由圖4A可知,在10～30 min內,石榴葉總酚含量會隨著提取時間的延長而增加;但是超過30 min后,再繼續延長提取時間,總酚含量有明顯降低的趨勢。據文獻[14-15]報道,亞臨界水萃取植物中活性成分的過程是分子擴散達到固液平衡的過程,在一定提取時間內隨時間的延長所溶解的活性物質不斷增加;但是在萃取過程達到平衡后,隨著時間的延長萃取物質的得率不會再增加,相反其中某些不穩定的物質還會發生降解,從而造成其含量的降低。通過對石榴葉提取物中鞣花酸含量的測定發現,鞣花酸含量在10～50 min內,呈逐漸升高的趨勢,在超過50 min后有下降趨勢。又因為石榴葉提取物的抗氧化活性與其總酚含量有正相關的關系,而與鞣花酸含量關系不大,故經綜合考慮將所得到的總酚含量為最高的時間點(30 min)選為亞臨界水萃取的最佳提取時間。綜上,亞臨界水提取石榴葉總酚不適宜采用過長的時間,在本實驗中30 min為亞臨界水提取石榴葉總酚的最佳提取時間。

圖4 提取時間對石榴葉總酚、鞣花酸含量(A)及抗氧化活性(B)的影響Fig.4 Effects of extraction time on the contents oftotal phenolic and ellagic acid(A),and antioxidant activities(B)of pomegranate leaves

圖5 液料比對石榴葉總酚、鞣花酸含量(A)及抗氧化活性(B)的影響Fig.5 Effects of solvent/solid ratio on the contents oftotal phenolic and ellagic acid(A),and antioxidantactivities(B)of pomegranate leaves

2.2.3 液料比的影響 由圖5可知,總酚和鞣花酸的含量均隨液料比的增大而增加,當液料比從20∶1 mL/g增加到50∶1 mL/g,總酚和鞣花酸含量也增加較快;在50∶1 mL/g 時總酚達到最高,但繼續增加液料比,總酚含量不會再繼續增加,但鞣花酸的含量繼續增加。在前人的研究中有報道稱,適度增加液料比,有利于加快介質傳遞過程,提高多酚提取率;但是過多的溶劑量也會造成資源浪費并增加后續去溶劑過程的工作量[18]。故經綜合考慮,50∶1 mL/g為本研究中石榴葉總酚亞臨界水提取的最佳液料比。

2.3響應面分析法優化亞臨界提取工藝參數

2.3.1 響應面實驗設計及結果 綜合上述單因素實驗的結果,應用Design-Expert 8.0.6 軟件中的Box-Behnken實驗設計原理,以石榴葉提取物的總酚含量為響應值(Y),以提取溫度(A)、提取時間(B)及液料比(C)3個因素為自變量,進行3因子3水平的Box-Behnken響應面優化實驗,具體實驗因素和水平設計見表1,響應面實驗設計方案和結果見表2。

表3 擬合回歸方程的模型方差分析Table 3 Analysis variance for response surface quadratic model

注:*p<0.05表示影響顯著;**p<0.01表示影響極顯著。

表2 響應面Box-Behnken實驗設計方案及結果Table 2 Box-Behnken experiment designand results of response surface methodology

2.3.2 模型的建立及其顯著性分析 運用Design-Expert 8.0.6軟件對表2的實驗數據進行多元回歸擬合,得到石榴葉總酚含量(Y)對提取溫度(A)、提取時間(B)和液料比(C)的回歸模型方程為:

Y=-2714.96+31.55 A+12.95B+22.28C+0.02AB+0.05AC+0.02BC-0.13A2-0.28B2-0.29C2。

2.3.3 各因子對石榴葉中總酚含量影響的等高線圖和響應面直觀圖 根據回歸方程得到的響應值(Y,總酚含量)對應于自變量A(提取溫度)、B(提取時間)和C(液料比)構成的二維平面等高線圖和三維空間曲面圖,分別見圖6～圖8,響應曲面的形狀可直觀反映各因素之間的交互作用及其對響應值的影響[21]。

由圖6中的可以看出,固定液料比不變,提取溫度和提取時間對總酚含量的影響都比較顯著,交互作用顯著,且提取溫度比時間對總酚含量的影響更為顯著,其響應曲面彎曲程度較大,曲線較為陡峭。石榴葉中總酚含量隨著提取溫度的增加而增加,在達到最大之后有下降趨勢,該極大值存在于響應面的頂部,也是等高線的最小橢圓的中心點。

圖6 提取溫度(A)及提取時間(B)影響石榴葉總酚含量的等高線圖和響應曲面圖Fig.6 Contour plot and response surface showingthe effects of extraction temperature and extraction timeon the total phenolics from pomegranate leaves

圖7反映了固定提取溫度后,提取時間和液料比之間的交互作用對石榴葉中總酚含量的影響,可見固定其中一個因素提取溫度后,總酚含量會隨著另外兩個因素的增加而呈現出先增高后降低的趨勢,在合適的條件下總酚含量達到最大值。

圖7 提取時間(B)及液料比(C)影響石榴葉中總酚含量的響應曲面圖和等高線圖Fig.7 Contour plot and response surface showingthe effects of extraction time and solvent/solid ratioon the total phenolics from pomegranate leaves

圖8反映了固定提取時間不變,提取溫度和液料比對于石榴葉總酚含量的影響及其交互作用,由圖8可知石榴葉總酚含量會隨著提取溫度和液料比的增加均呈現出先升高后降低的趨勢,曲面陡峭;換言之,總酚含量在一定的提取溫度和液料比下有極大值,即響應曲面的頂點和等高線中最小橢圓的中心點。

綜上所述,圖6～圖8直觀地反映了亞臨界萃取過程中各因素交互作用對石榴葉總酚含量的影響。通過對圖6～圖8的綜合比較并結合表3結果可知,3個因子對石榴葉中總酚含量的影響均達到極顯著水平(p<0.01),提取溫度(A)與提取時間(B)和液料比(C)之間的交互作用均達到了顯著水平(p<0.05),曲面較為陡峭;而提取時間和液料比的交互作用未達到顯著水平。由表3的F值可知,亞臨界水提取過程中各因素對石榴葉總酚含量的影響大小順序依次為:液料比>提取溫度>提取時間。

2.3.4 最佳條件的優化和驗證實驗 在本實驗中采用響應面軟件中Optimization的優化功能,根據建立的模型進行優化,可以得到亞臨界水萃取石榴葉總酚的理論最佳條件為:提取溫度為133.63 ℃、提取時間為31.01 min、液料比52.00∶1 mL/g,在該條件下石榴葉總酚含量的理論預測值為173.31 mg GAE/g。為檢驗響應面法優化的可靠性,根據預測參數進行驗證實驗,考慮到操作的便利性在實際實驗中將各因素調整為提取溫度為134 ℃、提取時間為31 min,液料比為52∶1 mL/g,在該條件下測得石榴葉總酚含量為169.24 mg GAE/g,基本和預測值保持一致,說明響應面法可適用于對石榴葉總酚的亞臨界水提取工藝進行回歸分析和參數優化,且具有較高的實用價值。

表4 亞臨界水提取與熱回流法提取石榴葉總酚含量的比較Table 4 Comparison of total phenolics contents from pomegranate leaves obtained by subcritical water and hot reflux extraction methods

注：同一列中不同小寫字母上標表示差異具有顯著性(p<0.05)。

2.4亞臨界水提取法與熱回流提取法的比較

從表4可知,采用加熱回流法使用75%乙醇和水作為溶劑提取的石榴葉提取物的總酚含量均顯著低于亞臨界水萃取法,且提取過程中耗時更長。而邱濤濤等[1]用有機溶劑提取的石榴葉總酚粗提物得率為16.63%,雖與本研究中亞臨界水提取得到的總酚含量相差不大,但是提取過程耗時較長且耗費有機溶劑。因此可知,亞臨界水提取作為一種環保、有效的提取法,可明顯提高石榴葉提取物中總酚含量,可減少有機溶劑的使用且大大縮短其提取時間。

3 結論

采用亞臨界水提取法提取石榴葉中的總酚,通過單因素實驗對影響總酚含量的幾個主要因素如提取溫度、提取時間和液料比進行了研究,并在此基礎上采用三因素三水平響應面分析法進行了實驗。通過優化分析得到亞臨界水提取石榴葉中總酚的最佳工藝條件為:提取溫度為134 ℃、提取時間為31 min、液料比為52∶1 mL/g,在此條件下,亞臨界水提取得到的石榴葉中總酚含量為169.24 mg GAE/g。比較亞臨界水提取和傳統加熱回流提取法得到的總酚含量,發現亞臨界水提取法可明顯提高石榴葉總酚含量,并且大大縮短提取時間,是一項非常綠色環保、有效的石榴葉總酚的提取技術,具有較好的開發前景。

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Optimizationofsubcriticalwaterextractionfortotalphenolicsfrompomegranate(PunicagranatumL.)leavesbyresponsesurfacemethodology

YANLin-lin,ZHENGGuang-yao*,WEIChao-kuan

(Institute of Chemical Industry of Forest Products,CAF,Key and Open Lab.on Forest Chemical Engineering,SFA,Nanjing 210042,China)

The aim of this study was to optimize the technology parameters of subcritical water extraction for extracting total phenolics from pomegranate leaves by response surface methodology. On the basis of single-factor experiments,three-factors and three-level response surface methodology was applied to investigate the effects of extraction temperature,extraction time and solvent/solid ratio on the total phenolics contents. The results showed that model regression was significant,and the established regression equation for phenolics contents had an excellent of fit. The optimized extraction temperature was 134 ℃,extracting time was 31 minutes,and solvent/solid ratio was 52∶1 mL/g. Under the optimized conditions,the total phenolics content was 169.24 mg GAE/g,which was consistent with the predictive value of 173.31 mg GAE/g. In addition,the total phenolic content of the optimized extracts was higher than the reflux extraction using aqueous-organic solvent,and the time was shortened.

pomegranate leaves;total phenolics;subcritical water extraction;response surface methodology

TS209

B

1002-0306(2017)19-0184-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.034

2017-04-14

閆林林(1986-)，女，博士，助理研究員，研究方向：植物資源提取分離與開發利用，E-mail：yanlinlin155@163.com。

*通訊作者:鄭光耀(1964-)，男，本科，副研究員，研究方向：植物資源提取分離與開發利用，E-mail：zhguya@sina.com。

中國林業科學研究院林產化學工業研究所研究團隊建設創新工程項目(LHSXKQ4)。