發酵-酶解耦合法大豆苷元轉化工藝

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(哈爾濱商業大學 黑龍江省高校食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076)

發酵-酶解耦合法大豆苷元轉化工藝

李笑梅,向世新,楊春華,馬慧玲,張娜

(哈爾濱商業大學 黑龍江省高校食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076)

以市售大豆異黃酮粉為樣品,選用產β-葡萄糖苷酶的LJ-Q2菌種與優化后的固定化β-葡萄糖苷酶進行耦合發酵,采用單因素、響應曲面法對耦合發酵條件進行優化,高效液相法(HPLC)測定大豆異黃酮苷元,考察耦合發酵條件對大豆苷元轉化率的影響。研究結果如下:最優條件為溫度54 ℃,耦合時間3 h,初始pH7,固定化酶添加量7%;大豆異黃酮苷元絕對質量13.76 mg,大豆異黃酮苷元轉化率為76.8%。對大豆苷制備應用技術開發有參考價值。

固定化,耦合發酵,大豆苷元,轉化率

大豆異黃酮(Soybean Isoflavone,SI)主要存在于大豆種皮、子葉、胚軸中[1]。是大豆生長過程形成的次級代謝產物,被稱為“植物雌激素”,是大豆中一類重要的生理活性物質[2]。分為游離型和結合型兩種,也稱苷元和糖苷。現在已知的大豆異黃酮的同分異構體一共有12種[3]。游離型苷元又稱非糖部分(大豆異黃酮配基),有3種:大豆素(Daidzein)、黃豆黃素(Glycitein)、染料木素(Genistein),以及對應的9種結合型糖苷:葡萄糖苷型3種、乙酰基葡萄糖苷型3種和丙二?；咸烟擒招?種[4-5]。在天然的大豆異黃酮產品中,具有生物活性的大豆異黃酮苷元易被人體吸收[6-8],僅占總量的2%～3%,剩余的是不易被人體吸收的結合型糖苷,占97%～98%[9]。大豆異黃酮具有重要的生物學活性,在類雌激素、抗腫瘤、預防骨質疏松和心血管疾病等方面有確切作用[10]。

國內外研究表明,游離型生物活性高于結合型[11-13],糖苷型的大豆異黃酮不能直接被小腸壁吸收,必須經水解去除糖基轉化為游離型的苷元才可被小腸吸收[14],所以要將結合型糖苷轉化成游離型苷元,關鍵技術是提高大豆苷元轉化率,開發出大豆苷元轉化新途徑、新工藝。大豆苷元轉化技術主要有酸堿水解法;酶水解法[15],最主要的酶有β-葡萄糖苷酶、葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、乳糖酶、真菌乳糖酶和乳糖酶F等[16];微生物降解法,對產β-葡萄糖苷酶的菌種研究主要集中在酵母、曲霉、木霉以及細菌內[17]。韓慧[18]得出微波、炒制、烘箱干燥有利于大豆異黃酮苷元轉化。關于苷元轉化工藝的相關研究多半側重于單一技術,耦合方法少見報道。

綜合目前的相關研究,存在的問題是,大豆苷元的提取率和轉化率都比較低,市售的大豆異黃酮產品總黃酮含量在30%～80%,而且其中苷元絕對質量也很低。另外,作為工業原料的市售大豆異黃酮主要是結合型,但游離型含量較高的產品價格相對較高。因此,開發大豆苷元轉化新途徑非常有意義。據此,在前期研究工作基礎上將產β-葡萄糖苷酶的LJ-Q2腸道菌種與優化后的固定化β-葡萄糖苷酶進行耦合發酵大豆異黃酮粉,旨在開發大豆苷元轉化的新工藝,優化耦合工藝條件參數,更好的提高苷元轉化率,為促進大豆異黃酮的利用率以及苷元制備技術開發提供參考依據。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

大豆異黃酮粉(含量 30%) 河南眾信生物科技有限公司;大豆素標準品Daidzein(純度 99%)、大豆黃素標準品Glycitein(純度 99%)、染料木素標準品Genistein(純度 99%)、大豆苷標準品Daidzin(純度 99%)、大豆黃苷標準品Glycitin(純度 99%)、染料木苷標準品Genistin(純度 99%) 西安市天園生物制藥廠;LJ-Q2腸道菌 自素食者糞便分離鑒定;黑曲霉β-葡萄糖苷酶 南京生利德生物技術有限公司;殼聚糖 國藥集團化學試劑有限公司;海藻酸鈉 天津市福晨化學試劑廠;腦心浸出液肉湯培養基(BHI)培養基 青島海博生物技術有限公司;甲醇 美國天地公司,色譜純;檸檬酸 天津市光復精細化工研究所,分析純;磷酸氫 二鉀天津市化學試劑一廠,分析純;氯化鈣 吉林宏久試劑廠,分析純;硫酸銨、硫酸鎂、硫酸亞鐵、氯化鋅 天津市天新精細化工開發,分析純;吐溫-80 邢臺藍星助劑廠。

YQX-Ⅱ型厭氧培養箱 上海新苗醫療器械有限公司;SW-CJ-1超凈工作臺 北京東聯儀器制造有限公司;LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;Agilent 1200LC高效液相色譜 美國安捷倫公司;TU-1901雙光束紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;SHZ-D3循環水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司;AS3120A超聲波 天津奧特賽恩斯儀器有限公司;PHS-3C型pH計 上海精密儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 固定化β-葡萄糖苷酶的制備 采用海藻酸鈉-殼聚糖法將β-葡萄糖苷酶固定化[19]。吸取稀釋酶液與質量分數2%的海藻酸鈉水溶液混合均勻。用注射器緩慢滴到2%的殼聚糖-醋酸溶液和2%的CaCl2溶液混合溶液,形成微膠囊。然后置于冰箱在恒溫層4 ℃的溫度下硬化2 h,抽濾。在0.2%的戊二醛中,40 ℃下、交聯1 h[20]。洗滌,得到固定化酶,置于冰箱恒溫層儲存備用。

1.2.2 六種大豆異黃酮定性定量方法 稱取一定量大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素、染料木素標準品,用80%甲醇溶解超聲30 min后定容,配制成六種單標液,各濃度為0.4 mg/mL。再用上述六種標液以相同比例分別配制成0.048、0.096、0.144、0.192、0.240 mg/mL系列濃度大豆異黃酮混和標液[21]。

用0.048 mg/mL混標在雙光束紫外分光光度計中進行全波長掃描,確定最大吸收波長。

采用高效液相色譜法進行定性定量檢測,固定相為Agilent1200LC C18柱(250 mm×4.6 mm 5 μm),以甲醇、水為流動相,以甲醇∶(水+甲醇)=20%～60%的比例進行梯度洗脫,流速為1.2 mL/min,柱溫為40 ℃,檢測波長為確定的最大吸收波長。將各單標過0.45 μm微孔濾膜于進樣瓶中,依次進樣,各組分保留時間作為樣品的定性依據。用配置好的混合標液進樣,得到六種標準品的標準曲線及回歸方程。

按公式(1)分別計算每種大豆異黃酮含量,游離型大豆異黃酮總量由三種游離型大豆異黃酮相加得出,結合型大豆異黃酮總量由三種結合型大豆異黃酮相加得出。

m=c×V×10-3

式(1)

式(1)中:c-由各類型大豆異黃酮回歸方程得出其濃度,μg/mL;V-定容體積,mL。

按公式(2)計算游離型大豆異黃酮轉化率。

式(2)

式(2)中:m-每種大豆異黃酮絕對質量,mg;m1-樣品中游離型異黃酮絕對質量,mg;m2-耦合發酵后游離型異黃酮絕對質量,mg；m3-樣品中結合型異黃酮絕對質量,mg。

1.2.3 耦合發酵工藝 用于發酵的LJ-Q2腸道菌是前期工作自素食者腸道分離得到的革蘭氏陽性球菌,為厭氧型,與黑曲霉相比較,在發酵時間短于64 h時LJ-G1、LJ-Q2產酶能力高于黑曲霉[22],產β-葡萄糖苷酶[23]。配置50 mL腦心浸出液培養基(BHI),將活化后的LJ-Q2腸道菌接種于BHI液體培養基中,接菌量(體積分數)5%、培養基pH8、培養溫度38 ℃、培養時間38 h。將大豆異黃酮粉原料進行發酵,待發酵時間剩余3 h時,添加固定化酶于發酵液中,進行耦合酶解發酵,初始pH為7、耦合時間為3 h,固定化酶添加量為5%,溫度40 ℃,然后在空氣搖床中發酵,得酶解發酵液。

1.2.4 耦合發酵工藝單因素實驗 單因素實驗主要考察耦合溫度,耦合時間,初始pH,固定化酶添加量四個因素,以未經耦合發酵的經炒制后的大豆異黃酮原料為對照組,采用HPLC進行檢測,以游離型大豆異黃酮苷元絕對質量為評價指標,各組實驗重復三次。

1.2.4.1 初始pH對苷元絕對質量的影響 在其他條件不變的情況下,考察初始pH4、5、6、7、8,耦合溫度為40 ℃,耦合時間為3 h,酶添加量為5%。對耦合發酵大豆異黃酮苷元絕對質量的影響。

1.2.4.2 耦合溫度對苷元絕對質量的影響 在其他條件不變的情況下,考察耦合溫度20、30、40、50、60 ℃,初始pH7,耦合時間為3 h,酶添加量為5%。對耦合發酵大豆異黃酮苷元絕對質量的影響。

1.2.4.3 耦合時間對苷元絕對質量的影響 在其他條件不變的情況下,考察耦合時間1、3、5、7、9 h,初始pH7,耦合溫度40 ℃,酶添加量為5%。對耦合發酵大豆異黃酮苷元絕對質量的影響。

1.2.4.4 酶添加量對苷元絕對質量的影響 在其他條件不變的情況下,考察酶添加量1%、3%、5%、7%、9%,初始pH7,耦合溫度40 ℃,耦合時間3 h。對耦合發酵大豆異黃酮苷元絕對質量的影響。

1.2.5 響應面法優化耦合發酵工藝條件 采用Box-Behnken模型,以溫度、時間、初始pH和酶添加量四個單因素為耦合發酵大豆異黃酮苷元絕對質量影響的主要考察因子(自變量),分別以A、B、C、D表示,并以-1、0、+1分別代表自變量的低、中、高水平對自變量進行編碼。因子編碼及水平見表1。并采用多元回歸分析,擬合二次多項式回歸模型的Box-Behnken設計實驗[24],進行結果分析,得到固定化酶水解大豆異黃酮粉優化工藝條件,在此基礎上,做驗證實驗。

表1 Box-Behnken 實驗設計因素水平表Table 1 Factors and levels Table of Box-Behnken design

1.3數據處理

實驗操作重復三次,采用SPSS 19.0軟件進行單因素顯著性分析,采用Design-Expert 8.05b軟件設計響應面實驗方案、建立數學模型并進行多元回歸分析。

2 結果與分析

2.1六種大豆異黃酮標樣定性檢測

2.1.1 大豆異黃酮最大吸收波長 由紫外掃描圖可以看出,確定259 nm為最大吸收波長,作為液相的測定條件。

圖1 大豆異黃酮紫外全波長掃描圖Fig.1 Soy isoflavones full wavelength ultraviolet scan

2.1.2 游離大豆異黃酮的標準曲線 用HPLC法分別測定配制的系列標準溶液,進樣量20 μL,n=3。以峰面積為縱坐標,濃度為橫坐標,繪制標準曲線。

圖2 六種大豆異黃酮標準曲線Fig.2 Standard curve of six soybean isoflavones

峰面積y對濃度x(μg/mL)進行回歸分析,回歸方程分別為:

大豆素:y=129.55x-43.855,r=0.9996;大豆黃素:y=61.151x-53.554,r=0. 998;

染料木素:y=105.85x-50.178,r=0.9991;大豆苷:y=53.574x-34.498,r=0.9987;

大豆黃苷:y=60.494x-43.071,r=0.9986;染料木苷:y=71.444x-27.151,r=0.9990。

式中:y為大豆異黃酮的峰面積:x 為大豆異黃酮的濃度,μg/mL,線性范圍是0～40 μg/mL。

2.1.3 大豆異黃酮的定性

2.1.3.1 混合標樣中六種大豆異黃酮定性 根據單標的保留時間對混標色譜圖各組分進行定性。由圖3可知:19.200 min是大豆苷,20.700 min是大豆黃苷,24.604 min是染料木苷,36.321 min是大豆素,38.383 min是大豆黃素,41.861 min是染料木素。

圖3 混合標樣大豆異黃酮色譜圖Fig.3 The chromatogram of six soyisoflavones in standard substance

2.1.3.2 原料中大豆異黃酮的定性定量 由圖4可知,原料中各組分大豆異黃酮出峰時間與圖3混合標樣各組分的出峰時間相同,含有上述六種大豆異黃酮。根據相應標準曲線,計算出原料中大豆苷含量為2.187 mg/g;大豆黃苷含量為1.764 mg/g;染料木苷含量為1.242 mg/g;大豆素含量為3.661 mg/g;大豆黃素含量為0.634 mg/g;染料木素含量為0.4 mg/g。三種結合型異黃酮總含量為5.193 mg/g;三種游離型異黃酮總含量為4.695 mg/g。

圖4 原料未經預處理大豆異黃酮色譜圖Fig.4 The chromatogram of soybean isoflavoneswithout any pretreatment in sample

2.2單因素實驗

2.2.1 初始pH對苷元絕對質量的影響結果 如圖5所示,初始pH是4.0時大豆異黃酮苷元絕對質量較低,然后隨pH上升,苷元絕對質量同步增加,初始pH7,苷元絕對質量達到最高,之后開始下降,經顯著性分析,pH6和pH7(p>0.05)無顯著性差異,pH7和pH8(p>0.05)也無顯著性差異。pH5和pH7(p<0.05)存在顯著性差異,表明適宜的初始pH為6.0～8.0。

圖5 初始pH對苷元絕對質量的影響Fig.5 Effect of initial pH on the absolute quality of aglycone

2.2.2 耦合溫度對苷元絕對質量的影響結果 如圖6所示,耦合溫度為20 ℃時大豆異黃酮苷元絕對質量較低,然后隨溫度升高,苷元絕對質量也增加,到50 ℃時苷元絕對質量最高,之后開始下降,經顯著性分析,40 ℃和50 ℃(p<0.05)存在顯著性差異,50 ℃和60 ℃(p<0.05)同樣存在顯著性差異。表明適宜溫度為40～60 ℃。

圖6 溫度對苷元絕對質量的影響Fig.6 Effect of temperature on the absolute quality of aglycone

2.2.3 耦合時間對苷元絕對質量的影響結果 如圖7所示,當耦合時間為1 h時大豆異黃酮苷元絕對質量較低,隨著耦合時間上升,大豆異黃酮苷元絕對質量升高,耦合時間為3 h時苷元酮絕對質量最高,之后絕對質量開始下降,經顯著性分析,1 h和3 h存在顯著性差異(p<0.05),3 h和5 h(p>0.05)無顯著性差異。表明適宜時間為1～5 h。

圖7 耦合時間對苷元絕對質量的影響Fig.7 Effect of coupling time on absolute quality of aglycone

2.2.4 酶添加量對苷元絕對質量的影響結果 如圖8所示,固定化酶添加量為1%時大豆異黃酮苷元絕對質量較低,然后隨酶添加量增加,大豆異黃酮苷元絕對質量同步升高,添加量為7%時苷元絕對質量最高,之后開始下降,經顯著性分析,5%和7%(p<0.05)有顯著性差異,7%和9%(p>0.05)無顯著性差異,表明固定化酶適宜添加量為5%～9%。

圖8 酶添加量對苷元絕對質量的影響Fig.8 Effect of enzyme additionon the absolute quality of aglycone

2.3響應面實驗

本實驗利用Design-Expert軟件,獲得響應面實驗結果見表2。

表2 響應面實驗結果Table 2 Results of response surface experiment

表3 響應面回歸方程系數及顯著性檢驗Table 3 Significance test and the regression equation of response surface experiment

注:p<0.01,差異極顯著,**表示;p<0.05,差異顯著,*表示。

由表2可以看出,2組游離型大豆異黃酮絕對質量最高為12.42 mg。根據表2實驗結果,經回歸擬合后,各實驗因子對響應值的影響可通過以下回歸方程表示:

Y=11.53+0.34A+0.071B+0.035C+0.51D-0.14AB-0.14AC-0.057AD-0.074BC-0.097BD+0.14CD+0.031A2-0.98B2-0.17C2-1.67D2

響應面回歸方程及顯著性分析見表3。

2.4耦合發酵法制備大豆異黃酮苷元響應面分析圖

由圖9可知,溫度為40 ℃,隨溫度的上升,苷元絕對質量逐漸加大,溫度在54 ℃左右,苷元絕對質量為最大值,之后又慢慢下降。隨水解時間繼續增加,苷元絕對質量增大,在水解時間3 h左右,大豆異黃酮苷元絕對質量為最大值,其后呈下降趨勢。

圖9 溫度和水解時間的交互作用對大豆異黃酮苷元含量的影響Fig.9 Effects of temperature and hydrolysis timeon the content of soybean isoflavone glycosides

圖10 溫度和pH的交互作用對大豆異黃酮苷元含量的影響Fig.10 Effects of temperature and pH interactionon the content of soybean isoflavone glycosides

由圖10可知,溫度為40 ℃,隨溫度的上升,苷元絕對質量逐漸升高,溫度在54 ℃左右,苷元絕對質量為最大值,之后又慢慢下降。然后pH的增加,大豆異黃酮苷元絕對質量增大,在初始pH為7左右,大豆異黃酮苷元絕對質量為最大值,其后呈下降趨勢。

由圖11可知,隨溫度的升高,苷元絕對質量逐漸加大,溫度在54 ℃左右,苷元絕對質量為最大,之后又慢慢下降。然后固定化酶添加量的增加,大豆異黃酮苷元絕對質量增大,在固定化酶添加量7%左右,大豆異黃酮苷元絕對質量為最大值,其后呈下降趨勢。

圖11 溫度和酶添加量的交互作用對大豆異黃酮苷元含量的影響Fig.11 Effects of temperature and enzyme interactionon the content of soybean isoflavone glycosides

由圖12可知,水解時間的延長,苷元絕對質量加大,水解時間3 h左右,苷元絕對質量為最大,之后又呈下降趨勢。當pH增加苷元絕對質量增大,在初始pH為7左右時,大豆異黃酮苷元絕對質量為最大值,其后呈下降趨勢。

圖12 水解時間和pH的交互作用對大豆異黃酮苷元含量的影響Fig.12 Effects of hydrolysis time and pHon the content of soybean isoflavone glycosides

由圖13可知,水解時間延長,苷元絕對質量增大,在水解時間3 h左右,苷元絕對質量到達最高點,之后又呈下降趨勢。隨著固定化酶添加量加大,大豆異黃酮苷元絕對質量增大,在固定化酶添加量在7%左右,大豆異黃酮苷元絕對質量為最大值,其后呈下降趨勢。

圖13 水解時間和酶添加量的交互作用對大豆異黃酮苷元含量的影響Fig.13 Effects of interaction between hydrolysis timeand enzyme content on soybean isoflavone glycoside content

由圖14可知,隨pH的上升,苷元絕對質量逐漸升高,然后pH在7左右時苷元絕對質量到達最高點,之后又慢慢下降。隨著固定化酶添加量的升高,苷元絕對質量增大,在固定化酶添加量在7%左右,苷元絕對質量為最大值,其后呈下降趨勢。

圖14 pH和酶添加量的交互作用對大豆異黃酮苷元含量的影響Fig.14 Effects of the interaction of pH and enzyme contenton the content of soybean isoflavone glycosides

由耦合發酵法制備大豆異黃酮苷元響應面分析圖得到最優耦合發酵條件溫度54.03 ℃,水解時間3 h,初始pH7,固定化酶添加量7.29%。以此優化條件進行驗證實驗,耦合發酵條件溫度54 ℃,水解時間3 h,初始pH7,固定化酶添加量7%,大豆異黃酮苷元絕對質量13.76 mg,與響應曲面實驗中的第2組結果12.42 mg差異顯著(p<0.05),具有統計學意義。耦合發酵前原料樣品中大豆異黃酮苷元絕對質量為6.695 mg,三種結合型異黃酮總絕對質量為9.193 mg,根據公式(2)計算出大豆異黃酮苷元轉化率76.8%。

其大豆苷元轉化率與近幾年相關研究結果相比均有提高,張濤[25](2008)采用固定化酶β-葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮轉化率達到70%,相比之下轉化率增加了6.8%。素食者糞便分離到的腸道菌LJ-Q2具有產β-葡萄糖苷酶能力[13],課題前期李笑梅[22]采用LJ-Q2菌株發酵大豆異黃酮轉化率達到 39.4%,相比之下轉化率增加了37.4%。與黑曲霉相比產酶能力達到峰值的時間短為36 h,遠短于黑曲霉108 h。由此認為采用LJ-Q2菌-β-葡萄糖苷酶耦合發酵法全程發酵時間明顯縮短,且可以提高大豆苷元轉化率,具有開發應用前景。

3 結論

在單因素實驗的基礎上通過響應面實驗得到耦合發酵最優條件為溫度54 ℃,耦合時間3 h,初始pH7,固定化酶添加量7%,此條件下大豆異黃酮苷元轉化率為76.8%。其大豆苷元轉化率與近幾年相關研究結果相比均有提高,對大豆苷制備應用技術開發有參考價值。后續工作應進一步討論另外六種結合型,即丙二?；咸烟擒招秃鸵阴；咸烟擒招偷能赵D化,探討多種產β-葡萄糖苷酶復合菌種與β-葡萄糖苷酶耦合發酵途徑,多途徑提高大豆異黃酮苷元的轉化率,開發易于實際生產的應用技術。

[1]付麗佳,林海,王玉華.大豆異黃酮雌激素樣作用的研究進展[J].中國傷殘醫學,2008(6):134-135.

[2]梁曉芳. 6種大豆異黃酮單體的分離、純化及穩定性研究[D].北京：中國農業科學院,2014.

[3]王春娥,劉叔義.大豆異黃酮的成分、含量及特性[J].食品科學,1998(4):39-43.

[4]李笑梅.復合生物法大豆異黃酮苷元制備技術的研究與開發[R].黑龍江省應用技術研究與開發計劃項目可行性研究報告.2013.

[5]Wang H J,Murphy P A. Isoflavone composion of American and Japanese soybeans in lowa:Effects if variety crop year and location[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1994(42):1674-1677.

[6]Kiyosawa I,Matsuyama J,Arai C,et al. Suppressive effects of the methanol extracts from soyabean products on SOS response of Salmonella typhimurium induced by mutagens and their contents of isoflavones[J]. Journal of the Japanese Society for Food Scie-nce and Technology,1995,42(10):835-842.

[7]Masayoshi Y,Ying H G. Anabolic effect of genistein and genistin on bone metabolism in thefemoral-metaphyseal tissues of elderly rats:The genistein effect is enhanced by zinc[J]. Molecularand Cellular Biochemistry,1998,178(1-2):377-382.

[8]Yamaki K,Kim D H,Ryu N,et al. Effects of naturally occurring isoflavones on prostaglandin E2 production[J]. Planta Medica,2002,68(2):97-100.

[9]周玲,蘇黎紅.大豆異黃酮研究概況[J].時珍國醫國藥,2001,12(2):157-158.

[10]王建華. 大豆異黃酮研究進展[J]. 現代中藥研究與實踐,2013(1):85-88.

[11]Kiyosawa I,Matsuyama J,Arai C,et al. Suppressive effects of the methanol extracts from soybean products on SOS response of Salmonella typhimurium induced by mutagens and their absolute qualitys of isoflavones[J]. Journal of the Japanese Society for Food Science and Technology,1995,42(10):835-842.

[12]Masayoshi Y,Ying H G. Anabolic effect of genistein and genistin on bone metabolism in the femoral-metaphyseal tissues of elderly rats:The genistein effect is enhanced by zinc[J]. Molecular and Cellular Biochemistry,1998,178(1-2):377-382.

[13]Yamaki K,Kim D H,Ryu N,et al. Effects of naturally occurring isoflavones on prostaglandin E2 production[J]. Planta Medica,2002,68(2):97-100.

[14]孫遜,姚文,朱偉云.腸道大豆異黃酮降解菌研究進展[J].世界華人消化雜志,2006,14(10):236-241.

[15]李明元,余渝,杜小琴.水解法提取大豆異黃酮苷元工藝研究[J]. 西南大學學報：自然科學版,2008,30(4):119-122.

[16]張曉紅,于殿宇,周鳳超.制備大豆異黃酮苷的方法[J]. 食品科學,2006,27(11):583-585.

[17]韓婷,程鋼.β-葡萄糖苷酶以及益生菌生物轉化大豆異黃酮糖苷的研究進展[J].食品科學,2010,31(9):333-337.

[18]韓慧,張加玲.熱處理與大豆異黃酮苷元的轉化分析[J].中國食品衛生雜志.2010,22(3):250-253.

[19]馬慧玲,李笑梅.響應曲面法優化β-葡萄糖苷酶固定化的研究[J].哈爾濱商業大學學報：自然科學版,2016(3):357-362.

[20]ChangMY,Juang RS. Use of chitosan-clay composite as immobilization support for improved activity and stability of B-glucosidase[J].Biochem Eng J,2007(35):93-98.

[21]Walter E D,et al.J Am Chem Soc,1941(63):327.

[22]李笑梅,馬慧玲.兩株素食者腸道菌產β-葡萄糖苷酶考察及產酶條件優化[J].食品科學,2016(7):123-127.

[23]李笑梅,賈堯.素食者產雌馬酚腸道菌生長條件優化[J].食品科學,2014(23):199-203.

[24]Bemelmans W J,Broer J,Feskens E J,et al. Effect of an increased intake of alpha-linolenic acid and group nutritional education on cardiovacular risk factors:the Mediterranean alpha-linolenic enriched groningen dietary intervention(MARGARIN)study[J]. Am J Clin Nutr,2002(75):221-227.

[25]張濤,黃哲,林章凜.固定化β-葡萄糖苷酶雙相體系中水解大豆異黃酮[J].化工學報,2008(2):387-392.

Fermentation-enzymaticcouplingmethodfordaidzeintransformation

LIXiao-mei,XIANGShi-xin,YANGChun-hua,MAHui-ling,ZHANGNa

(Key Laboratory of Food Science and Engineering,Harbin University of Commerce,Harbin 150076,China)

The commercially available soybean isoflavone powder was used as sample,LJ-Q2 strain withβ-glucosidase was selected and coupled with optimized immobilizedβ-glucosidase.The coupling conditions were optimized by single factor and response surface method. The content of soybean isoflavone glycoside was determined by high performance liquid chromatography(HPLC). The effects of coupled fermentation conditions on the conversion of daidzein were investigated.The results of optimal conditions were as follows:temperature 54 ℃,coupling time 3 h,initial pH7,immobilized enzyme addition amount 7%. The absolute quality of soybean isoflavone aglycon was 13.76 mg,the conversion rate of soybean isoflavone aglycon was 76.8%,application of technology development for soybeans glycosides had reference value.

immobilization;coupled fermentation;daidzein;conversion rate

TS201.3

A

1002-0306(2017)19-0118-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.023

2017-03-24

李笑梅(1960-),女,大學本科,教授,研究方向:食品科學,E-mail:lixm0451@163.com。

黑龍江省科技廳應用技術項目(GC13B203);黑龍江省高?？萍紕撔聢F隊建設計劃項目(2010td04)。