亮氨酸氨肽酶的制備及在大米肽脫苦中的協同應用

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(江南大學工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇無錫 214122)

亮氨酸氨肽酶的制備及在大米肽脫苦中的協同應用

朱強,吳警濤,田亞平*

(江南大學工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇無錫 214122)

采用絮凝、超濾和冷凍干燥組合的方法制備重組枯草芽孢桿菌亮氨酸氨肽酶,以氨肽酶切除末端疏水性氨基酸為酶解脫苦效果的指標,考察了該氨肽酶與脯氨酸氨肽酶協同水解大米肽的脫苦效果。酶的制備工藝條件如下:加入0.15%±0.008%的絮凝劑,2.5%±0.006%的硅藻土,調節pH8.0進行過濾,采用30 kDa的PES卷式膜,超濾濃縮7倍,氨肽酶的總回收率為64.69%±1.29%;在優化的酶解條件下,大米肽的酶解液中的亮氨酸、精氨酸及游離的疏水性氨基酸總量分別是酶解前的3.39±0.10、16.48±0.49、4.39±0.13倍,酶解后分子量500～1000 Da的肽含量降低了30.63%±0.61%,經雙酶協同水解后脯氨酸含量是單酶水解后的1.78±0.07倍。優化后工藝簡便,且該酶在大米肽脫苦中有良好的應用。

亮氨酸氨肽酶,提取,回收率,協同水解,疏水性氨基酸

細菌發酵液中實現菌體分離有高速離心法,絮凝法,膜過濾法等,但細菌菌體較小,離心需要較高轉速,設備昂貴,不易放大,而膜過濾法雖然容易放大但膜孔也易被細小細菌堵塞,所以細菌發酵液常需選擇絮凝法。程璐等[1]人在乳桿菌發酵液中加入硫酸鋁進行了絮凝預處理,絮凝率達到68%,絮凝效果良好,更利于后續的提取。曹松龍等[2]利用18%的硫酸銨澄清枯草芽孢桿菌發酵液,使菌體絮凝,再利用超濾法提取氨肽酶,回收率為67.15%?？追宓萚3]利用雙水相萃取和超濾法提取枯草芽孢桿菌發酵液中的氨肽酶,其超濾回收率為85.01%,表明超濾法在氨肽酶提取中有較好的應用。

氨肽酶是一種很重要的風味蛋白酶,可解離N末端的疏水性氨基酸而被用于蛋白水解液的脫苦[4-6]。大米肽主要由多種多肽分子混合物所組成,以及其它少量的游離氨基酸、糖類和無機鹽等,具有降血壓、抗氧化、促脂肪代謝及增強體能和恢復疲勞等作用[7-8]。目前,利用酶法制備活性肽時,蛋白水解液往往產生一些苦味,嚴重影響其品質[9-11]。T.K.Murry和Baker等[12]證明苦味是由多肽而不是游離氨基酸產生的。K.N.Ney等[13]研究進一步表明了苦味是由于多肽鏈上疏水性氨基酸引起的。馬鐵錚等[14]研究發現:除了Leu,Pro等疏水性氨基酸殘基對苦味有影響,尤其Arg在N末端的肽是極苦的,去除多肽末端疏水性氨基酸及Arg等堿性氨基酸就可降低苦味,但未研究酶法脫苦效果。魏亞娟等[15]研究了氨肽酶與堿性蛋白酶對大豆分離蛋白的協同水解作用,發現水解液幾乎不呈現苦味,未研究多種外切酶協同水解去除酶解液中的苦味。

表1 真空冷凍干燥參數Table 1 Parameters of vacuum freeze drying

本實驗建立了絮凝法與超濾法相結合,易于規?；a的氨肽酶的制備工藝,為工業化生產提供了理論基礎,以氨肽酶切除多肽末端疏水性氨基酸為脫苦效果的指標,確定了亮氨酸氨肽酶酶解大米肽脫苦的最適條件,進一步考察了亮氨酸與脯氨酸氨肽酶協同水解大米肽脫苦的效果,為后續研究亮氨酸氨肽酶的復配應用具有一定的意義。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

枯草芽孢桿菌發酵液、脯氨酸氨肽酶、亮氨酸氨肽酶 實驗室自制;L-亮氨酸-對硝基苯胺(AR) 美國Alfa公司;陽離子絮凝劑、硅藻土 江蘇泰州市博立生物制品有限公司。

SHZ-22電熱恒溫水浴鍋 上海醫療器械五廠;2L超濾設備FILTECH-UF101型 上海弗立特實業有限公司;UV-1600PC紫外-可見分光光度計 上海美普達有限公司;不銹鋼板框過濾器 溫州展博設備制造有限公司;真空冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司;Delter320pH計 梅特勒-托利多公司;數顯恒溫磁力攪拌器 江蘇科析儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 亮氨酸氨肽酶的制備 本課題組原有建立的對氨肽酶的制備工藝為:發酵液低速離心雙水相萃取超濾濃縮獲得酶液等步驟,由于規?；a,發酵液離心能耗大,不利于工廠操作,在此基礎上建立一種新的制備工藝:發酵液絮凝→板框壓濾機過濾→超濾濃縮→真空冷凍干燥→粉碎過篩→獲得酶粉。新工藝操作簡單,設備投資低,維護及保養成本低,更利于大規模生產。

1.2.1.1 發酵液絮凝單因素實驗 固定硅藻土的添加量為1.5%、絮凝劑的添加量為0.15%,考察不同pH對絮凝時氨肽酶回收率的影響;固定硅藻土添加量1.5%、固定pH7.0考察絮凝劑的添加量對絮凝時氨肽酶回收率的影響;固定絮凝劑添加量0.15%、固定pH7.0考察硅藻土添加量對絮凝時氨肽酶回收率的影響。

1.2.1.2 發酵濾液的超濾濃縮 將經過絮凝且過濾的發酵液加入超濾系統中,選擇操作壓力為0.25 MPa,pH6.5考察濃縮倍數(2、3、4、5、6、7)對氨肽酶回收率和膜通量以及比酶活的影響。

1.2.1.3 濃縮液的冷凍干燥 將1.2.1.2超濾的冷濃縮液進行冷凍干燥,粉碎,過篩(200目),獲得亮氨酸氨肽酶酶粉,后置于-4 ℃儲存,其冷凍干燥參數如表1所示。

1.2.2 膜通量的測定 發酵液膜通量的測定:在超濾系統中加入預處理的發酵液,待壓力穩定后(操作壓力0.2 MPa),計時2 min,收集透過液并量體積,計算膜通量。膜通量公式:

式(1)

式(1)中:J-式中:膜通量(L/(m2·h));V-取樣體積(L);T-取樣時間(h);A-膜有效面積(m2)

1.2.3 蛋白質含量的測定 利用考馬斯亮藍法[16-18]測定亮氨酸氨肽酶發酵過程中發酵液中的蛋白質含量,以牛血清蛋白作為標準蛋白,標準曲線方程為:

Y=146.43x-1.5000(R2=0.998)

式(2)

式(2)中:Y為波長595 nm 處測定的吸光值;X為蛋白質量濃度(ug/mL)。

1.2.4 亮氨酸氨肽酶酶活力測定 利用LNA法[19]測定亮氨酸氨肽酶酶活力計算公式:

式(3)

式(3)中:X-樣品的酶(U/mL);N-于波長405 nm處測得吸光度值;Y-酶液稀釋的倍數。

氨肽酶酶活定義:在以上分析測定的基礎上,定義一個酶活單位(U)為,在特定條件下(50 ℃,pH8.5),每分鐘催化分解L-亮氨酸-對硝基苯胺產生1微摩爾的對硝基苯胺所需要的酶量。

1.2.5 單酶及雙酶協同水解在大米肽脫苦中的應用

1.2.5.1 亮氨酸氨肽酶水解大米肽 準確稱取大米肽2.5 g,配制成濃度為50 g/L大米肽溶液50 mL,水解溫度50 ℃,加入0.5 g亮氨酸氨肽酶(酶活力9000 U/g)于大米肽溶液中,調轉速至120 r/min,調節pH,維持在pH8.3～8.5,酶解4 h,沸水浴10 min,滅酶。

1.2.5.2 亮氨酸和脯氨酸氨肽酶協同水解大米肽 準確稱取大米肽2.5 g,配制成50 g/L溶液,pH8.5、溫度50 ℃、亮氨酸氨肽酶添加量1800 U/g(E/S)、酶解4 h,沸水浴10 min,冷卻至50 ℃,加入脯氨酸氨肽酶300 U/g、溫度50 ℃、維持pH7.3～7.5、酶解3 h、沸水浴10 min,冷卻,15000 r/mim離心30 min,取上清-4 ℃保存。

1.2.5.3 大米肽的酶解液中多肽分子量分布及氨基酸含量測定 酶解液12000 r/min 離心10 min,取上清2 mL測酶解液的多肽分子量分布,取上清1 mL加入等體積的10%的TCA溶液,靜置3 h,15000 r/min,離心10 min,取離心后的上清液400 μL利用氨基酸液相色譜儀(Ag1100)進行測定酶解液中游離的氨基酸含量[20]。

1.3數據統計分析

每組實驗重復3次,取平均值,采用origin8.5進行數據分析。

2 結果與討論

2.1發酵液絮凝單因素實驗

2.1.1 絮凝時發酵液的pH對氨肽酶回收率的影響 由圖1所示,絮凝時的pH對氨肽酶回收率影響顯著,隨著pH的增加,氨肽酶的回收率先增加后降低,當絮凝體系的pH為8.0時,氨肽酶回收率達到最大,為82.7%±1.65%,由于發酵液中的pH不同,導致蛋白帶有不同的電荷,絮凝劑也顯示不同的活性,pH8.0時絮凝劑能將雜蛋白和菌體絮凝成團,而對目標蛋白的影響較小,故選擇pH8.0為絮凝時體系的最適pH。

圖1 絮凝時的pH對氨肽酶回收率的影響Fig.1 Effect of pH on recovery ofaminopeptidase during flocculation

2.1.2 絮凝劑的添加量對氨肽酶回收率的影響 圖2中可以看出發酵液中絮凝劑的添加量影響氨肽酶的回收率,且絮凝劑的添加量為0.15%±0.008%左右時氨肽酶的回收率最好,為79.83%±2.39%。這是因為絮凝作用的原理是絮凝劑上的功能團和不同的蛋白及菌體等膠粒表面通過架橋聯結結合,從而產生粗大的絮凝沉淀[21-22]。發酵液中絮凝劑的添加量增加有助于架橋的充分,但是過高反而會引起吸附飽和,在膠粒表面上形成覆蓋層,從而使絮凝體系再次趨于穩定,因此發酵液中絮凝劑的添加量偏高或偏低都達不到絮凝的效果。

圖2 絮凝劑添加量對氨肽酶回收率的影響Fig.2 Effect of adding amount of flocculanton recovery of aminopeptidase

2.1.3 硅藻土的添加量對氨肽酶回收率的影響 由3中可以看出,隨著硅藻土添加量的增加,氨肽酶回收率逐漸降低,當添加量大于2.5%±0.006%時回收率下降迅速,當添加量為3.5%±0.008%時,回收率降至58.36%±1.17%,這是因為硅藻土特有的天然“分子篩”狀孔隙結構,具有較強的吸附性能和離子交換性能,可能吸附了目的蛋白,導致氨肽酶含量降低,絮凝中硅藻土的添加只是起到加速過濾的作用,考慮濾速及氨肽酶的回收率選擇硅藻土的添加量為2.5%±0.006%。

圖3 硅藻土添加量對氨肽酶回收率的影響Fig.3 Effect of adding amount ofdiatomite on recovery of aminopeptidase

2.1.4 發酵液超濾濃縮倍數的選擇 采用截留分子量為30 kDa的聚醚砜(PES)膜,操作壓力為0.25～0.3 MPa。從表2和圖4中可以看出隨著濃縮倍數的增加,氨肽酶的回收率與膜通量都有一定幅度的降低,當濃縮倍數由四倍增加到五倍,回收率和膜通量下降較快,主要是開始超濾膜膜孔無堵塞,阻力較小,隨著超濾操作進行大分子物質在膜表面沉淀使得阻力增加、濃差極化的現象導致膜通量下降顯著。結合表2,考慮減少后續冷凍干燥的處理量,選擇發酵濾液的濃縮倍數為7,此時氨肽酶回收率為78.22%±1.41%。由于絮凝后的濾液具有澄清度高等優點,較離心處理的發酵液更有利于超濾操作,節約成本。

2.2單酶及雙酶協同水解后多肽分子量分布及疏水性氨基酸含量變化

由圖5可以看出,經單酶水解后分子量小于180 Da的含量增加了102.04%±3.06%,180～500 Da的肽含量增加了20.42%±0.49%,500～1000 Da的肽含量降低了30.63%±0.70%,1000～2000 Da的肽含量降低了35.60%±0.36%,2000～5000 Da的肽含量降低了32.80%±0.62%,而雙酶協同與單酶水解相比多肽分子量分布變化不大,只有180～500 Da的肽含量略有增幅,這是由于雙酶中的脯氨酸氨肽酶具備高特異性,只切除多肽鏈N端的脯氨酸殘基。據文獻[23-24]報道:分子量大于5000 Da的肽不具苦味,而介于500～1000 Da的短肽苦味最強。

表2 濃縮倍數對比酶活的影響Table 2 The influence of concentration multiple on comparison enzyme activity

圖4 濃縮倍數對氨肽酶回收率及膜通量的影響Fig.4 Effect of concentration multipleon recovery and membrane flux of aminopeptidase

圖5 酶解前后多肽分子量分布Fig.5 Molecular weight distribution ofpeptides before and after enzymatic hydrolysis

如圖6所示,大米肽經過亮氨酸氨肽酶處理后:Leu、Arg、Lys及游離的疏水性氨基酸含量是酶解前的3.39±0.10、16.48±0.49、22.47±0.67、4.39±0.67倍,表明水解液中游離的疏水性氨基酸含量大幅度提高且其中的Leu、Arg、Lys提高比例最大,符合亮氨酸氨肽酶水解特色;經雙酶協同水解后Pro含量是單酶水解后的1.78±0.07倍,其他疏水性氨基酸增幅較小,符合該酶的水解特異性。結合多肽分子量分布和氨基酸含量分析表明,其分子量的改變是亮氨酸氨肽酶將肽鏈末端的疏水性氨基酸切除下來,從而達到脫苦的效果,而亮氨酸與脯氨酸氨肽酶協同作用更能強化脫苦效果,進一步提升大米肽的風味和品質。

圖6 酶解前后疏水性氨基酸及兩種堿性氨基酸含量變化Fig.6 Changes of hydrophobic amino acids and two kinds ofbasic amino acids before and after enzymolysis

3 結論

本研究在前期基礎上建立了絮凝加超濾后凍干亮氨酸氨肽酶的制備工藝:加入0.15%±0.008%的絮凝劑,2.5%±0.006%的硅藻土,調節pH8.0,過濾,選用30 kDa的超濾膜超濾濃縮7倍,氨肽酶的總回收率為64.69%±1.29%。該制備工藝操作簡便,穩定性較好,便于操作和控制,易放大生產;用該工藝制備的亮氨酸氨肽酶水解大米肽通過分析水解產物的情況評價其脫苦效果,結果表明,在優化的酶解條件下酶解液中的亮氨酸、精氨酸、賴氨酸含量及疏水性氨基酸總量分別是酶解前的3.39±0.1、16.48±0.49、22.47±0.67、4.39±0.67倍,酶解后分子量500～1000 Da的肽含量降低了30.63%±0.61%,而亮氨酸與脯氨酸氨肽酶協同作用更能強化脫苦效果,提升大米肽的品質,相對于在多肽中添加苦味掩蔽劑,酶法更加安全可靠,將是今后食品蛋白資源深加工的應用大趨勢。

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Preparationofleucineaminopeptidaseandcollaborativeapplicationofdebitterizinginricepeptides

ZHUQiang,WUJing-tao,TIANYa-ping*

(Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

The combination of flocculation,ultrafiltration,and freeze drying method to extract the recombinant bacillus subtilis leucine aminopeptidase,with aminopeptidase removal terminal hydrophobic amino acids for debittering effect index,debittering effect effects of leucine aminopeptidase and proline aminopeptidase hydrolysis of rice peptide was investigated. The preparation conditions of the enzyme were as follows:adding 0.15%±0.008% flocculant,2.5%±0.006% diatomite,adjusting pH8.0 for filtration,using 30 kDa PES roll membrane,ultrafiltration concentration 7 times,under this condition:the total recovery of aminopeptidase rate was 64.69%±1.29%. In the optimized enzymatic hydrolysis conditions,the total amount of leucine,arginine and free hydrophobic amino acids in the hydrolyzate were 3.39±0.10,16.48±0.49 and 4.39±0.13 times higher than that of the hydrolyzate. After the enzymolysis,the molecular weight was 500～1000 Da was reduced by 30.63%±0.61%,and the content of proline was 1.78±0.07 times higher than that of single enzyme hydrolysis after double enzyme synergistic hydrolysis. The optimized process is simple and the enzyme has good application in the peeling of rice peptides.

leucine aminopeptidase;extraction;recovery rate;synergistic hydrolysis;hydrophobic aminoacid

TS201.21

A

1002-0306(2017)19-0109-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.021

2017-03-22

朱強(1991-),男,碩士研究生,研究方向:發酵工學,E-mail:zqll2012@163.com。

*通訊作者:田亞平(1964-),女,博士,教授,研究方向:主要從事生物活性物質方面的研究,E-mail:yapingtian@hotmail.com。

江蘇省產學研聯合創新資金(BY2014023-22)。