一株瓊膠降解菌的篩選、鑒定及粗酶學性質

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(1.青島農業大學食品科學與工程學院,山東青島 266109;2.青島農業大學生命科學學院,山東青島 266109;3.君頂酒莊有限公司,山東蓬萊 265600)

一株瓊膠降解菌的篩選、鑒定及粗酶學性質

劉興凱1,3,朱丹2,周薪1,房玲1,郭爽1,郭瑞1,程凡升1

(1.青島農業大學食品科學與工程學院,山東青島 266109;2.青島農業大學生命科學學院,山東青島 266109;3.君頂酒莊有限公司,山東蓬萊 265600)

本研究通過初篩、復篩從青島近海沉積物中分離出一株具有瓊膠酶活性的菌株,該菌的最佳發酵時間為26 h,對該菌培養基進行盧戈氏碘液染色后菌落周圍出現明顯透明圈,鏡檢觀察菌株的革蘭氏染色結果表明,該菌為革蘭氏陰性菌。經過鑒定,該菌株為不動桿菌(Acinetobactersp.),命名為Acinetobactersp. LXK,對該菌的粗酶學特性進行初步研究,結果顯示,該酶的最適反應溫度為40 ℃,最適底物濃度為0.5%,最適反應體系pH為8.0,K+和Ca2+對酶解反應有促進作用,Fe2+、Mn2+和Ba2+對酶解反應有不同程度的抑制作用。

瓊膠酶,海洋細菌,篩選,鑒定

海洋多糖工業的興起使得海洋多糖及其降解酶受到了廣泛的重視。現如今,備受矚目的瓊膠寡糖有著分子量小、水溶性好、易吸收等特點,使其抗病消炎、抗淀粉老化、保濕美白等功效的應用價值大幅提升,已經廣泛應用在食品、化妝品和醫療等領域[1]。但是,利用瓊膠酶降解瓊膠規模性生產瓊膠寡糖在世界范圍內是個研究的難點,原因就在于缺少工程菌和瓊膠酶產生菌的產酶活力低等問題。我國雖然是一個海洋大國,海洋資源雄厚,但生產的多為初級產品,在瓊膠及瓊寡糖的研發與應用領域尚處于起步階段。瓊膠,也叫瓊脂,是從石花菜、江蘺等紅藻植物中提取出一類藻膠,由瓊脂糖(agarose)和瓊脂膠(agaropectin)組成[2]。瓊脂糖是由1,3連結的β-D-半乳糖和1,4連結的3,6-內醚-L-半乳糖交替連接起來的長鏈分子[3];瓊脂膠由包含硫酸基、甲基等多種取代基的復雜單糖殘基多糖鏈構成[4]。目前,降解瓊膠生產瓊寡糖較常用的方法有兩種,一個是化學法,另一個是酶解法[5]。化學降解法存在反應條件難以控制、產品分析和產物回收難等弊端[6]。酶解法降解瓊膠因特異性強、反應條件溫和、降解過程簡單易控等優點使其成為生產瓊寡糖的主要手段。

從19世紀50年代開始,人們陸續分離出多種瓊膠降解菌,包括芽孢桿菌屬(Bacillussp.)[7]、鹽桿菌屬(Salegentibactersp.)[8]、假單孢菌屬(Pseudomonassp.)[9]、寡養單胞菌屬(Stenotrophomonassp.)[10]、噬瓊膠菌屬(Agarivoranssp.)[11]、短桿菌屬(Brevibacteriumsp.)[12]、弧菌屬(Vibriosp.)[13]、黃桿菌屬(Flavobacteriumsp.)[14]、假交替單孢菌屬(Alteromonassp.)[15]和不動桿菌屬(Acinetobactersp.)[16]等,海洋是瓊膠酶產生菌生存的大環境,較容易分離出瓊膠降解菌,例如,劉麗莉[6]和蔡俊鵬[17]等人分別在海藻中分離出產瓊膠酶菌株Vibrioagarivorans. ZGR-26、Aeromonastrota. JK333;郭彥岑[18]等人在海洋沉積物中分離出產瓊膠酶菌株Vibriosp.FG2;馬悅欣[19]等人在仿刺參消化道內分離出產瓊膠酶菌株Pseudoalteromonassp. HF3-04;杜宗軍[20]等人和褚艷[21]等人分別在海水中分離出產瓊膠酶菌株Alteromonasaddita. QM65、Pseudomonassp. CY-24。但是,由于瓊膠酶活性低等問題,目前還沒有工業化的菌株。進一步尋找產瓊膠酶的菌株是酶法制備瓊寡糖的迫切需要。本研究從青島近海沉積物中分離具有瓊膠酶活性的菌株,對其進行鑒定和粗酶學特性的初步研究,以期獲得適合工業應用的瓊膠酶。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

瓊脂粉、酵母粉、蛋白胨 北京雙旋微生物培養基制品廠；NaCl、MgSO4、KCl 天津市致遠化學試劑有限公司；CaCl2、K2HPO4、乙醇 天津市巴斯夫化工有限公司；FeSO4萊陽市康德化工有限公司；沙皇染液、結晶紫染液 北京陸橋技術有限責任公司。

DHP-9.32恒溫培養箱 山東龍口市先科儀器公司)；QYC-200恒溫搖床 上海福瑪實驗設備有限公司；SW-CJ-2D超凈工作臺 青島恒正實驗設備有限公司；711111090000移液槍 上海恒奇儀器儀表有限公司；XSP-460.460T顯微鏡 上海中恒儀器有限公司；Bio-Rad T100 PCR儀 北京伯輝生物科技有限公司；XYOG02高壓蒸汽滅菌鍋 新華醫療器械有限公司；PB-10pH計 北京力高興業科技有限公司；WFZ-2100分光光度計 尤尼克上海儀器有限公司，等。

1.2培養基

人工海水(%,w/v):NaCl 2.5,MgSO40.5,KCl 0.1,CaCl20.02,K2HPO40.01,FeSO40.002;牛肉膏蛋白胨培養基(%,w/v):蛋白胨1,牛肉膏0.3,瓊脂粉1.5,NaCl 0.5,pH7.2～7.6;初篩培養基:2216 E固體培養基;復篩培養基(%,w/v):瓊脂粉0.2,酵母浸出粉0.3,人工海水配制,pH7.2～7.6;斜面培養基:同初篩培養基

1.3菌株的篩選

取樣地點是青島紅島近海海域。取近海沉積物于無菌密封袋中,常溫保存。取沉積物樣品5 g于45 mL無菌水中,振蕩搖勻。將稀釋10-1～10-5五個濃度梯度的樣液分別涂布在牛肉膏蛋白胨平板培養基中,30 ℃培養1～2 d,挑取透明圈或凹陷較大的菌落點接于初篩平板培養基,并做好標記,在30 ℃下培養1～2 d后用盧戈氏碘液進行染色,挑選透明圈與菌落的直徑比值大的菌落,并根據標記挑取原菌落于初篩培養基上進行劃線培養1～2 d,挑取單菌落于復篩液體培養基中,30 ℃,150 r/min發酵培養1～2 d,測發酵液的酶活力,篩選出酶活力較高的菌株,并進行斜面和甘油管保藏。

1.4瓊膠酶活力測定

于25 mL比色管中加入0.5 mL經4 ℃ 6000 r/min離心10 min的發酵上清液和1.5 mL含0.5%瓊脂的磷酸鹽緩沖液(pH7.0),置于50 ℃水浴保溫15～20 min后取出,加入1.0 mL DNS試劑終止酶解反應,沸水浴顯色5 min,冷卻后定容至25 mL,充分搖勻后于5000 r/min離心10 min,取適量上清液在520 nm處測吸光值,將酶液煮沸滅活后同此法處理作為對照。根據標準曲線算出上清液中的還原糖含量。酶活力單位定義為在上述條件下,1 min轉化生成1 μg還原糖所需酶的量為一個酶活力單位(U/mL)。

1.5菌體生長和產酶曲線的測定

以3%的接種量將種子液接種到發酵培養基,150 r/min,30 ℃搖床發酵培養,每2 h取適量發酵液測生物量及酶活力,繪制生長和產酶曲線。

1.6菌種形態學鑒定

觀察菌落在平板上的形態并對其進行盧戈氏[22]染色、革蘭氏染色并鏡檢觀察菌體形態等。

1.7系統發育樹的構建

CTAB法提取菌株基因組DNA,將收集得到的DNA為模板,引物采用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGCTA CCTTGTTACGACTT-3′)。PCR擴增程序為 95 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35 個循環;72 ℃ 10 min。將PCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測,送至上海生工生物工程有限公司測序。利用 BLAST 程序在GenBank上對結果進行相似性比對,使用 MEGA6.0的 Neighbor-Joining(NJ)方法構建系統發育進化樹。

1.8酶學性質研究

最適溫度的測定:在20～70 ℃下測定酶活力,其中底物濃度0.5%、反應體系pH7.0;最適pH的測定:在pH4.0～9.0下測定酶活力,其中酶解溫度是45 ℃、底物濃度為0.5%;最適底物濃度的測定:在底物濃度0.1%～1.0%下測定酶活力,其中酶解溫度45 ℃、反應體系pH7.0;金屬離子對酶解反應的影響:將瓊膠酶酶液中分別加入Mn2+(MnCl2)、Ca2+(CaCl2)、Ba2+(BaCl2)、Na+(NaCl)、K+(KCl)、Mg2+(MgCl2)、Fe2+(FeCl2)使酶溶液含有5 mmol/L的金屬離子,4 ℃放置10 min后測定酶活力。以上實驗做三次平行,結果取平均值。

2 結果與分析

2.1菌體生長及產酶曲線

對菌體進行搖瓶發酵,每2 h取少量發酵液測其酶活力和在600 nm處的吸光值,由圖1知,發酵前期菌體生長速度較快,在20 h后生物量基本達到平衡,酶活力在24～26 h處達到最大。

圖1 菌株生長及產酶曲線Fig.1 Time courses of growth in seed culture of the strain

圖2 盧戈氏染色結果Fig.2 Bacterial cultures stained with lugol iodine

2.2篩選及形態學鑒定

圖4 依據16S rDNA序列同源性比較構建的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of the Acinetobacter sp. strains based on 16S rRNA gene sequence

將該菌在平板上培養24 h后,培養基表面形成明顯白色菌落,菌落表面濕滑,邊緣平整,中央凹陷。對菌落進行盧戈氏碘液染色,染色結果如圖2所示,菌落周圍形成明顯的透明水解圈,這是由于培養基被降解的部分生成具有還原性的寡糖,不能被盧戈氏碘液染色,而未被降解掉的部分能夠被盧戈氏碘液染成深色[10]。對菌落進行革蘭氏染色鏡檢結果如圖3所示,菌體被染成紅色,表明該菌屬革蘭氏陰性菌,與已報道的絕大多數產瓊膠酶菌株屬革蘭氏陰性菌[23-24]結果相符。

圖3 革蘭氏染色鏡檢結果Fig.3 Microscopic bacterial gram stain

2.3系統發育樹的構建

用MEGA6.0軟件,根據16S rDNA序列相似性,將該菌與NCBI數據庫中相應的細菌一起構建系統發育樹,由系統發育樹可知,該序列與Acinetobacterbeijerinckii(Genbank Accession No.KX856281.1)和Acinetobacterbouvetii(Genbank Accession No. NR117628.1)等菌屬相似性高達99%,能夠證明菌LXK為不動桿菌(Acinetobactersp.)。目前,不動桿菌產瓊膠酶的研究報道較少,僅Lakshmikanth[16]等人和陳虹[25]等人從土壤中篩選出能夠產瓊膠酶的不動桿菌,從海洋環境中分離出產瓊膠酶的不動桿菌未見報道。

2.4酶解反應最適溫度的確定

將酶反應體系分別置于20、30、40、50、60和70 ℃的水浴中反應,測定各溫度下瓊膠酶活力,結果見圖5。從圖5中可以看出,最適酶解溫度為40 ℃,溫度過高和過低都不利于酶解,這與來自不動桿菌AG LSL-1[16]、紫色桿菌SY12[26]、弧菌JMUAZ6[27]的瓊膠酶的最適酶解溫度相同。由于瓊膠具有凝固性,當溫度較低時底物發生凝固,粗酶液與底物的接觸面積減少,酶解效率降低;溫度過高時,酶受熱失活,同樣影響酶解效率。

圖5 溫度對瓊膠酶活性的影響Fig.5 Effect of temperature on the agarase activity

2.5酶解反應最適底物濃度的確定

選取0.1%～1.0%的濃度梯度研究瓊脂粉濃度對瓊膠酶活力的影響,實驗結果見圖6。從圖6中可以看出,隨著底物濃度的增大,瓊膠酶活力隨之增大,在底物濃度為0.5%時瓊膠酶活力達到最大值,繼續增大底物濃度,瓊膠酶活力逐漸下降,原因是底物濃度過大,降低了分子的擴散性,降低酶解反應效率。因此,酶的最適底物濃度為0.5%。

圖6 底物濃度對瓊膠酶活力的影響Fig.6 Effects of substrate concentration on the agarase activity

2.6酶解反應體系最適pH的確定

圖7 酶解反應體系pH對瓊膠酶活力的影響Fig.7 Effects of pH on the agarase activity

反應體系pH可以影響酶的結構和穩定性,同時底物和酶的解離狀態也受pH的影響[26]。為探究反應體系pH對瓊膠酶活力的影響,選取pH4.0～9.0六個pH梯度進行酶解實驗,結果見圖7。由圖7可知,瓊膠酶活力隨著體系pH的增大呈現先增大后減小趨勢,在pH8.0附近達到最大值,繼續增大pH,瓊膠酶活力反而下降,可能是強堿性環境導致酶蛋白變性從而使瓊膠酶失活[28]。

2.7金屬離子對酶解反應的影響

選取7種金屬離子研究它們對酶解反應的影響,結果見圖8。從圖中可以看出,K+和Ca2+能促進酶解反應,Na+和Mg2+對酶解反應的影響較小,而Fe2+、Mn+和Ba2+對酶解反應起抑制作用,此結果與瓊膠酶降解菌Agarivoranssp. LQ48[11]、Vibriosp. JMUAZ5[29]研究結果相似。

圖8 金屬離子對酶解反應的影響Fig.8 Effects of metal ion on enzymatic hydrolysis

3 結論

本研究通過大量篩選工作,從海洋環境分離得到一株具有瓊膠酶活性的細菌,通過鏡檢發現該菌為革蘭氏陰性菌,并通過16Sr RNA基因序列的測定,確定該菌為不動桿菌,是首次從海洋環境中分離出的能夠產瓊膠酶的不動桿菌,并命名為不動桿菌Acinetobactersp. LXK。對該菌的粗酶學特性進行了初步研究,結果表明,最適酶解溫度為40 ℃,酶解最適底物濃度在0.5%,酶解反應體系最適pH在8.0,K+和Ca2+能促進酶解反應,Na+和Mg2+對酶解反應的影響較小,而Fe2+、Mn+和Ba2+對酶解反應起抑制作用。本研究的開展為海洋多糖的深入研究和瓊膠寡糖的規模化生產起到了極大的促進作用。

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一套《食品工業科技》在手，縱觀食品工業發展全貌

Isolation,identificationandenzymologypropertiesofanagarase-producingstrain

LIUXing-kai1,3,ZHUDan2,ZHOUXin1,FANGLing1,GUOShuang1,GUORui1,CHENGFan-sheng1

(1.College of Food Science and Engineering,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China;2.College of Life Science,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China;3.Chateau Junding,Penglai 265600,China)

An agar-decomposing strain was isolated from Qingdao offshore deposits. The optimal fermentation time was 26 h,transparent zones appeared after staining with lugol’s iodine. The bacteria was gram-negative and classified in the genusAcinetobacter,named asAcinetobactersp. LXK. By studying the primary properties of agarase and study showed that:the optimal pH and temperature for enzymolysis were pH8.0 and 40 ℃ respectively,the optimum concentration of substrate was 0.5%,the enzyme was activate by K+,Ca2+and inhabited by Fe2+,Mn2+,Ba2+.

agarase;marine bacteria;screening;identification

TS201.3

A

1002-0306(2017)19-0100-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.019

2017-02-21

劉興凱(1994-)，男，本科，研究方向：食品生物技術，E-mail:1176738058@qq.com。

國家自然科學基金項目(31301438，31501331)；山東省優秀中青年科學家獎勵基金(BS2013SW034)；校高層次人才啟動基金(1113321)；青島農業大學應用型人才培養特色名校建設工程大學生科技創新項目。