HPLC法測定甲苯磺酸依度沙班有關物質

李志偉，張任飛，劉穎娜，禹葉廣，謝英花，仇燕

(1.河北科技大學 化學與制藥工程學院，河北 石家莊 050018；2.河北科技大學 生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018)

HPLC法測定甲苯磺酸依度沙班有關物質

李志偉1，張任飛1，劉穎娜1，禹葉廣1，謝英花1，仇燕2

(1.河北科技大學 化學與制藥工程學院，河北 石家莊 050018；2.河北科技大學 生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018)

建立了一種高效液相色譜(HPLC)法，用于檢測甲苯磺酸依度沙班有關物質.該法采用SunFire C8(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以20 mmol/L磷酸氫二鉀(pH 4.0)-乙腈(體積比為90∶10)為流動相A，20 mmol/L磷酸氫二鉀(pH 4.0)-乙腈(體積比為30∶70)為流動相B，按梯度洗脫程序洗脫.該方法的檢測波長為290 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL.結果表明，甲苯磺酸依度沙班及各雜質均能有效分離；在相應的濃度范圍內，各物質的線性關系良好；各雜質的回收率均在98.0%～102.0%，RSD(n=9)均小于2.0%；在色譜條件有微小變化時，各物質均能有效分離且雜質含量的差異在可接受范圍內.經方法學驗證，該方法專屬性好、靈敏度高、準確度高、耐用性好，可用于甲苯磺酸依度沙班的質量控制.

甲苯磺酸依度沙班；有關物質；高效液相色譜法;質量控制

甲苯磺酸依度沙班(edoxaban tosilate hydrate)是由日本第一三共株式會社研制的一種口服小分子抗凝血藥物，可用于治療靜脈血栓和全髖關節置換[1-3].甲苯磺酸依度沙班通過高選擇性直接抑制凝血因子Xa的表達，起到抗凝血作用，其對Xa的選擇性較對凝血酶高10 000倍，對其他絲氨酸蛋白酶無作用[4].甲苯磺酸依度沙班片于2011年在日本上市，2015年先后在美國和歐洲上市[5-7]，目前還未在國內上市.

為了保證藥物的安全性、可靠性，需對甲苯磺酸依度沙班的雜質進行研究.目前，有諸多文獻報道甲苯磺酸依度沙班的合成、藥理學、藥效學和藥動學[8-11]，但甲苯磺酸依度沙班有關物質的檢測方法未見報道.本文根據甲苯磺酸依度沙班的合成路線，建立了一種液相色譜測定甲苯磺酸依度沙班及其雜質的方法.按加校正因子的主成分對照法計算雜質含量，其中雜質A、雜質B和雜質E分別為甲苯磺酸依度沙班的起始原料1、起始原料2和起始原料3；雜質C和雜質D分別為甲苯磺酸依度沙班中間體1和中間體2；雜質F為合成中間體1中的副產物；雜質G、雜質H和雜質I為甲苯磺酸依度沙班的非對映異構體，即SRR-依度沙班，RRR-依度沙班和SSR-依度沙班.甲苯磺酸依度沙班和各雜質的結構式分別見圖1和圖2.

圖1 甲苯磺酸依度沙班-水合物結構式Fig.1 Structure of edoxaban tosilate hydrate

圖2 甲苯磺酸依度沙班雜質結構式Fig.2 Structure of impurities of edoxaban tosilate hydrate

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

SHIMADZU高效液相色譜儀(包括SCL-10Avp控制器，DGU-14A脫氣機，LC-10ADvp泵，SIL-10ADvp進樣器，CTO-10ACvp柱溫箱，SPD-10AV檢測器及LC solution工作站)；Waters高效液相色譜儀(包括Waters 2695 Separations Module和Waters 2996 Photodiode Array Detector)；AUW120D電子天平(SHIMADZU)；pH計，pHS-3C，上海精科；乙腈，色譜純，霍尼韋爾貿易(上海)有限公司；磷酸氫二鉀，分析純，天津市永大化學試劑有限公司；磷酸，分析純，天津市永大化學試劑有限公司.甲苯磺酸依度沙班、雜質A、B、C、D、E、F、G、H、I(自制，石家莊佰銳生物科技有限公司)，甲苯磺酸依度沙班(石家莊佰銳生物科技有限公司，批號：20141101、20141102、20141103).

1.2 色譜條件

色譜柱：SunFire C8(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相A為20 mmol/L磷酸氫二鉀(pH 4.0)-乙腈(體積比為90∶10)，流動相B為20 mmol/L磷酸氫二鉀(pH 4.0)-乙腈(體積比為30∶70)，梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為290 nm，進樣量為10 μL.

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution procedure

1.3 溶液配制

雜質F儲備液：取雜質F適量，精密稱定，用乙腈溶解并稀釋制成每1 mL含0.05 mg的雜質F儲備液.

其他雜質儲備液：分別取雜質A、E、C、D、G、H、I、甲苯磺酸依度沙班對照品各適量，精密稱定，分別加甲醇溶解并稀釋制成1 mL中約含0.5 mg的各雜質一級儲備液.取上述雜質的一級儲備液2.5 mL，置50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得對照品儲備液.

標準溶液：分別精密量取雜質A、E、C、D、G、I、H儲備液各5 mL，雜質F儲備液2.5 mL以及甲苯磺酸依度沙班對照品適量(約含依度沙班25 mg)，置于同一50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度，制成每1 mL中約含2.5 μg的各雜質對照品和每1 mL中約含0.5 mg依度沙班對照品的標準溶液.

供試品溶液：取本品適量(含依度沙班約25 mg)，精密稱定，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液.

對照溶液：精密量取供試品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；再精密量取溶液1 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液.

2 結果與討論

2.1 色譜條件選擇

2.1.1 檢測波長的選擇

取甲苯磺酸依度沙班、雜質A、B、C、D、E、F、G、H、I適量，用甲醇稀釋至適當濃度，于190～400 nm波長內掃描，甲苯磺酸依度沙班和大部分雜質在290 nm附近有強吸收，因此選擇290 nm作為檢測波長.雜質B的最大吸收波長在206 nm，在290 nm處無吸收，該雜質在中間體1的過程中嚴格控制，因此不作為本文考察的雜質.

2.1.2 色譜柱的選擇

在梯度洗脫程序確定前，首先對色譜柱進行篩選，包括：Agela Venusil ASD C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，phenomenex Luna (250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，SHIMADZU HRC-C8(150 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，Waters SunFire C8(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱.在相同的分析條件下，4根不同品牌的色譜柱都不能將主峰與其后的雜質分離，但Waters SunFire C8 (250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱對雜質的分離優于其他色譜柱，因此最終確定選用Waters SunFire C8 (250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱作為甲苯磺酸依度沙班有關物質的分析色譜柱.

2.1.3 pH值的選擇

在梯度洗脫程序確定后，本文考察了pH值對雜質分離度的影響.將磷酸鹽緩沖液的pH值調整為7.0、5.5、4.0、3.0對雜質進行分析.實驗結果表明，隨著pH值的減小，雜質的分離度增強，當pH值為7.0和5.5時，該梯度洗脫程序不能將雜質全部分離，當pH值為4.0和3.0時，各物質均能有效分離，但考慮到色譜柱pH值的耐用范圍，確定磷酸鹽緩沖液的pH值為4.0.

2.2 方法學驗證

2.2.1 專屬性

取空白溶劑(甲醇)、標準溶液、供試品溶液和各雜質定位溶液，按“1.2”節色譜條件進行測定，標準溶液的出峰順序雜質E、雜質D、對甲苯磺酸、依度沙班、雜質G、雜質H、雜質I、雜質A、雜質C、雜質F，且空白溶劑不干擾甲苯磺酸依度沙班和各雜質的檢測，且各雜質間最小的分離度為1.775，達到分離要求，實驗結果表明該法專屬性良好.實驗結果見圖3.

圖3 專屬性實驗對比Fig.3 Chromatograms comparison of methanol and standard solution

2.2.2 系統精密度

按“1.3”節配制標準溶液，于“1.2”節的分析方法下連續進樣6次，雜質E峰面積的相對標準偏差為10.55%，其他各物質峰面積的相對標準偏差均小于2.0%，保留時間的相對標準偏差均小于1.0%.實驗結果表明，雜質E不穩定，就其他物質而言，該方法系統適用性良好.

2.2.3 降解實驗

酸降解實驗：取甲苯磺酸依度沙班約25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸2 mL，于室溫下放置24 h后，加2 mL 0.1 mol/L氫氧化鈉溶液中和，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，測定.另取同法配制酸空白溶劑做空白實驗.

堿降解實驗：取甲苯磺酸依度沙班約25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加0.1 mol/L氫氧化鈉2 mL，于室溫下放置5 min后，加2 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液中和，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，測定.另取同法配制堿空白溶劑做空白實驗.

氧化降解實驗：取甲苯磺酸依度沙班約25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加2 mL質量分數 30%雙氧水，于室溫下放置24 h后，用甲醇溶解定容并稀釋至刻度，搖勻，測定.另取同法配制氧化空白溶劑做空白實驗.

高溫固體降解實驗：取甲苯磺酸依度沙班約25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，于80 ℃烘箱中放置24 h后，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，測定.

光照降解實驗：取甲苯磺酸依度沙班約25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，于照度為 4 500 lx下放置24 h后，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，測定.

A.未破壞；B.酸破壞；C.堿破壞；D.光照液體；E.氧化破壞；F.高溫固體破壞；G.光照固體破壞.圖4 降解實驗色譜Fig.4 Chromatograms of forced degradation test

光照液體降解實驗：取甲苯磺酸依度沙班約25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，于4 500 lx下放置24 h后進行測定.

照上述分析方法測定，各條件下降解實驗的物料守恒值均在90%～110%，遵循物料守恒原則，且主峰的純度角度值均小于閾值，表明峰純度符合要求.本品在酸、堿、氧化條件下有雜質產生，酸降解實驗產生了雜質E和2個未知雜質；堿降解實驗產生了雜質E和1個未知雜質；氧化降解實驗產生了雜質E和3個未知雜質.各條件下雜質均能達到有效分離，表明該方法專屬性強.實驗結果見圖4.

2.2.4 檢測限與定量限

以信噪比S/N=3時的濃度作為檢測限，S/N=10時的濃度作為定量限，并取定量限溶液進行重復性實驗，定量限重復性實驗峰面積的相對標準偏差均小于5.0%，保留時間的相對標準偏差均小于1.0%，實驗結果見表2和圖5.

表2 檢測限、定量限實驗結果Tab.2 Results of LOD and LOQ

圖5 定量限圖譜Fig.5 Chromatogram at the limit of quantitation of edoxaban tosilate hydrate and its impurities

2.2.5 線性與范圍

取甲苯磺酸依度沙班和各雜質儲備液適量，用甲醇稀釋成6個不同質量濃度的混合溶液，按“1.2” 節色譜條件進樣分析，以各物質的線性質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸.實驗結果表明，各物質在相應的質量濃度范圍內，線性關系良好.線性實驗結果見表3.

表3 線性實驗結果Tab.3 Results of linearity test

2.2.6 重復性

按“1.3”節的溶液配制方法配制6份供試品溶液和自身對照溶液，分別進行色譜分析，6份供試品溶液中均未檢測出已知雜質，均檢測到同一未知雜質，未知雜質的質量分數均值為0.044%，RSD為3.81%，小于4.0%，符合要求.實驗結果表明，該方法重復性良好.

2.2.7 中間精密度

由不同人員于不同時間按“重復性”項下操作，進行樣品測定，6份供試品溶液中均未檢測出已知雜質，均檢測到同一未知雜質，未知雜質的質量分數均值為0.047%，RSD為4.32%，小于5.0%.與重復性結果共計，12份樣品未知雜質含量的RSD為5.20%，小于6.0%.實驗結果表明，該方法中間精密度良好.

2.2.8 溶液穩定性

按“1.3”節配制供試品溶液和標準溶液，在室溫下放置，分別于0、2、4、6、8 h進樣分析，考察其穩定性.經測定，雜質E峰面積的RSD為13.83%，其余各物質峰面積的RSD均小于2.5%，則說明雜質E不穩定，需臨用現配，其他各雜質在室溫下放置8 h穩定.供試品溶液的雜質質量分數均值為0.042%，RSD為3.94%，小于4.0%，說明甲苯磺酸依度沙班溶液在室溫下放置8 h穩定.

2.2.9 回收率

分別向甲苯磺酸依度沙班中加入80%、100%、120% 3種質量分數的雜質溶液，每個質量濃度平行配制3份溶液，按“1.2”節測定，按外標法計算各雜質的回收率，各雜質的回收率均在98%～102%，RSD均小于2.0%.實驗結果表明，該方法準確度高.實驗結果見表4.

表4 回收率實驗結果Tab.4 Results of recovery test

2.2.10 耐用性

本實驗主要考察了在流速改變±0.1 mL/min，流動相乙腈體積分數改變±2%，柱溫變化±5 ℃，pH調節±0.1條件下各雜質的分離情況和供試品的雜質含量.在上述條件下，各雜質的分離度均大于1.5，符合分離要求；供試品總雜質在各個條件下的RSD最大為5.92%.實驗結果表明，該方法在適量改變(流速±0.1 mL/min，流動相乙腈比例±2%，柱溫± 5℃，pH±0.1)范圍內耐用性良好.

2.3 樣品測定結果

取中試3批(批號為：20141101、20141102、20141103)樣品，按照上述方法進行測定， 3批樣品均未檢測出已知雜質，未知雜質質量分數分別為0.049%、0.053%、0.051%.

3 結論

本文建立了一種高效液相色譜分析方法，用于檢測甲苯磺酸依度沙班的有關物質，采用加校正因子的自身對照法計算雜質含量.實驗結果表明，方法專屬性好，靈敏度高，準確度高，耐用性好，可用于甲苯磺酸依度沙班有關物質的檢測.

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[7] DAIICHI SANKYO COMPANY LIMITED.SAVAYSATM (edoxaban)now available in U.S.pharmacies.http://www.daiichisankyo.com/media_investors/media_relations/press_releases/detail/006247.html.

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(責任編輯：梁俊紅)

DeterminationofrelatedsubstancesinedoxabantosilatehydratebyHPLC

LIZhiwei1，ZHANGRenfei1,LIUYingna1，YUYeguang1，XIEYinghua1，QIUYan2

(1.College of Chemical &Pharmaceutical Engineering,Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang 050018,China;2.College of Bioscience &Bioengineering,Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang 050018,China)

A HPLC method was established to separate edoxaban tosilate hydrate and its related substances.SunFire C8 (250 mm×4.6 mm,5 μm)column was adopted in the analysis method and its temperature was kept at 30 ℃.The mobile phase A consisted of 20 mmol/L K2HPO4(pH 4.0)-acetonitrile (90∶10,V/V)and the mobile phase of B consisted of 20 mmol/L K2HPO4(pH 4.0)-acetonitrile (30∶70,V/V).A gradient elution at flow of 1.0 mL/min was used.The detection wavelength was 290 nm and the injection volume was 10 μL.The calibration curve of all substances were linear in appropriate concentration range,and the average recovery of all compounds were among 98.0%～102.0%,RSD (n=9)values were less than 2.0%.Each impurity was separated when the parameters had small changes and the assay variation of impurities was accepted.Methodology validation results proved that the method had good selectivity,high sensitivity,high accuracy and good robustness and it can be used for quality control of edoxaban tosilate hydrate.

edoxaban tosilate hydrate；related substances;HPLC；quality control

O29

A

1000-1565(2017)05-0489-08

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.05.008

2016-12-25

河北省自然科學基金資助項目(C2014208084)

李志偉(1977—),男，河北唐縣人，河北科技大學副教授，主要從事藥物分析和分離材料方面的研究.E-mail：lizhiwei@hebust.edu.cn