硫代黃素T與溶菌酶淀粉樣纖維結(jié)合的熒光停流動(dòng)力學(xué)

馬剛,秦哲，劉思陽，商艷麗，賈寶環(huán)

(河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，藥物化學(xué)與分子診斷教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071002)

硫代黃素T與溶菌酶淀粉樣纖維結(jié)合的熒光停流動(dòng)力學(xué)

馬剛,秦哲，劉思陽，商艷麗，賈寶環(huán)

(河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，藥物化學(xué)與分子診斷教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071002)

蛋白淀粉樣纖維與多種疾病有關(guān)，如阿爾茨海默病、帕金森病、Ⅱ型糖尿病等.熒光染料硫代黃素T(ThT)廣泛地應(yīng)用于淀粉樣纖維的定性和定量測定.但從目前的研究來看，ThT與淀粉樣纖維結(jié)合的動(dòng)力學(xué)機(jī)理研究尚非常少見.本研究應(yīng)用熒光停流動(dòng)力學(xué)技術(shù)對鹽酸胍誘導(dǎo)的溶菌酶淀粉樣纖維和ThT的結(jié)合動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，提出ThT與溶菌酶淀粉樣纖維結(jié)合的動(dòng)力學(xué)符合雙位點(diǎn)平行反應(yīng)機(jī)理模型.本研究對深入理解熒光染料分子與蛋白淀粉樣纖維的作用有借鑒意義.

硫代黃素T；溶菌酶；淀粉樣纖維；動(dòng)力學(xué)

蛋白纖維化是一種獨(dú)特的蛋白聚集行為.在纖維化過程中，單體蛋白通過自組裝過程形成纖維狀的蛋白聚集體[1-2]，這種蛋白聚集體又被稱為淀粉樣纖維.研究表明，許多威脅人類健康的疾病都和某種特定蛋白在組織和細(xì)胞中的纖維化沉積有關(guān).這些疾病包括熟知的阿爾茲海默病、帕金森病、Ⅱ型糖尿病等多種退形性疾病.這類疾病可以被統(tǒng)一歸為淀粉樣蛋白沉積疾病[3].蛋白淀粉樣纖維與這些重大疾病的密切關(guān)聯(lián)使相關(guān)研究近年來在國內(nèi)外方興未艾[2,4-9].蛋白淀粉樣纖維的定性定量檢測無疑是蛋白纖維化研究中的一個(gè)重要內(nèi)容.其中，基于硫代黃素T(thioflavin T，簡稱ThT)熒光染料的熒光光譜技術(shù)廣泛地應(yīng)用于淀粉樣纖維的定性和定量測定[10-11].ThT屬于芳香族化合物，如圖1所示，中間的C—C鍵連接了苯并噻唑和苯胺環(huán)，2個(gè)芳香環(huán)可以以C—C鍵為軸自由轉(zhuǎn)動(dòng).當(dāng)ThT被激發(fā)后由于該自由轉(zhuǎn)動(dòng)的存在而導(dǎo)致熒光淬滅.但當(dāng)ThT與蛋白淀粉樣纖維結(jié)合后，芳香環(huán)的轉(zhuǎn)動(dòng)受到了抑制，則會(huì)發(fā)出熒光.一般實(shí)驗(yàn)中，人們使用450 nm左右的光對ThT進(jìn)行激發(fā)，如果ThT結(jié)合了蛋白淀粉樣纖維，便會(huì)在480 nm左右發(fā)射很強(qiáng)的熒光；如果體系中不存在蛋白淀粉樣纖維，ThT在480 nm處幾乎不發(fā)熒光[11].一般而言，該熒光的強(qiáng)度和體系中蛋白淀粉樣纖維的量成正比，因此，ThT熒光檢測法常用于淀粉樣纖維的定量分析，比如用于測量淀粉樣纖維的S-型生成動(dòng)力學(xué)曲線.

ThT在蛋白纖維化研究中的重要作用，使人們對其多種物理化學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生了極大興趣.目前有許多研究報(bào)道致力于深刻理解ThT的光物理性質(zhì)以及ThT和蛋白淀粉樣纖維的作用位點(diǎn)和作用模式[12-13]．相比這些研究，有關(guān)ThT和蛋白淀粉樣纖維結(jié)合的動(dòng)力學(xué)過程，文獻(xiàn)中報(bào)道非常少見[14-15].在非常早期的熒光動(dòng)力學(xué)研究中，LeVine[14]研究了ThT與Aβ1-40多肽形成的纖維的結(jié)合動(dòng)力學(xué)，其傾向于認(rèn)為ThT和纖維的結(jié)合過程是一個(gè)多步連續(xù)反應(yīng)過程，包括1個(gè)類似雙分子反應(yīng)的結(jié)合過程和3個(gè)連續(xù)的復(fù)合物構(gòu)型順變過程.而近期的熒光動(dòng)力學(xué)研究中，Sabate等[15]研究了ThT與HET-s多肽形成的纖維的結(jié)合動(dòng)力學(xué)，他們傾向于認(rèn)為ThT和纖維的結(jié)合就是一個(gè)簡單的類似雙分子一步結(jié)合的過程.這主要是因?yàn)榈矸蹣永w維的結(jié)合位點(diǎn)是一種不易發(fā)生構(gòu)象變化的剛性β-折疊結(jié)構(gòu)，而早期LeVine的假說中提出的淀粉樣纖維結(jié)合ThT后會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化的情況與這一理論預(yù)期不符.筆者新近利用紫外吸收停流動(dòng)力學(xué)技術(shù)的研究也支持Sabate的論點(diǎn)[16]，即ThT與淀粉樣纖維的結(jié)合動(dòng)力學(xué)是一個(gè)多位點(diǎn)平行反應(yīng)，每個(gè)位點(diǎn)上的結(jié)合過程都是簡單的雙分子一步反應(yīng).

為更加深入地理解ThT結(jié)合蛋白淀粉樣纖維的動(dòng)力學(xué)過程，本文將以雞卵清溶菌酶形成的蛋白淀粉樣纖維為模型體系，應(yīng)用基于ThT熒光檢測的停流動(dòng)力學(xué)技術(shù)，研究ThT和纖維結(jié)合的動(dòng)力學(xué)過程并提出和動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相匹配的機(jī)理模型.

圖1 ThT的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of ThT

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

雞卵清溶菌酶蛋白(以下簡稱溶菌酶)、剛果紅(>85%)、鹽酸胍(>99%)由美國Sigma-Aldrich公司購得.ThT(超純級)由美國AnaSpec公式購得.磷酸氫二鉀(>99%)、磷酸二氫鉀(>99%)由阿拉丁購得.超純水(電阻率18.2 MΩ·cm)由美國密理博公司的Millipore超純水機(jī)制得.

1.2 溶菌酶淀粉樣纖維的制備及預(yù)處理方法

溶菌酶纖維的制備條件參照文獻(xiàn)[17].配制2 mg/mL溶菌酶、3 mol/L鹽酸胍、20 mmol/L 磷酸鹽緩沖溶液 (pH=6.3)，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾.放入恒溫混勻儀中孵育4 h，孵育溫度為50 ℃，頻率為900 r/min.經(jīng)孵育后，上述溶液由澄清變?yōu)闇啙?用原子力顯微鏡、ThT熒光分析法、剛果紅染色法、紅外光譜對制備的纖維進(jìn)行表征和確認(rèn).

在進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究前，需要對溶菌酶淀粉樣纖維進(jìn)行預(yù)處理.預(yù)處理的目的是獲得分散良好的穩(wěn)定膠體體系，從而提高動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性.預(yù)處理過程中，先進(jìn)行離心處理，以去除鹽酸胍以及緩沖溶液對后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響.離心機(jī)轉(zhuǎn)速為10 000 r/min，每次離心10 min，共離心3次.每次離心后棄去上清液，然后加入超純水混勻再重懸.經(jīng)3次離心處理后，將獲得的蛋白淀粉樣纖維在冰浴環(huán)境下進(jìn)行超聲，功率為130 W，超聲時(shí)間1 s，間隔時(shí)間5 s，總時(shí)間5 min.經(jīng)過預(yù)處理，溶菌酶纖維懸濁液變?yōu)榉€(wěn)定的在純水中的膠體溶液.所獲得的溶液可以進(jìn)一步用純水稀釋以獲得動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)所需濃度.

1.3 溶菌酶纖維的ThT熒光分析

采用日立F-7000熒光分光光度計(jì)對溶菌酶淀粉樣纖維進(jìn)行ThT熒光檢測.激發(fā)波長450 nm，狹縫寬度5 nm；發(fā)射波長460～600 nm，狹縫寬度10 nm.檢測器光電倍增管的電壓為500 V.取新制備的2 mg/mL溶菌酶纖維10 μL加入到1 mL 10 μmol/L ThT的磷酸鹽溶液中，混勻后用1 cm石英池進(jìn)行熒光測量.單純的10 μmol/L ThT磷酸鹽溶液的熒光光譜做空白對照.

1.4 溶菌酶纖維的剛果紅染色分析

剛果紅染色分析實(shí)驗(yàn)在德國Implen紫外可見超微量分光光度計(jì)上進(jìn)行.剛果紅濃度為5 μmol/L，緩沖體系為10 mmol/L磷酸鹽溶液，pH =7.4并含有體積分?jǐn)?shù)0.5% 的乙醇.染色分析時(shí)，取新制備的2 mg/mL的溶菌酶纖維30 μL加入到1 mL剛果紅溶液中，充分作用后測量紫外可見光譜.單純的剛果紅溶液做空白對照.

1.5 溶菌酶纖維的紅外光譜分析

對溶菌酶纖維的固態(tài)樣品進(jìn)行紅外測試.固態(tài)樣品制備方式如下：將前述經(jīng)離心水洗去除鹽酸胍后的樣品冷凍干燥，然后進(jìn)行紅外測試.紅外光譜測試采用德國Bruker公司Vertex 70傅里葉變換紅外光譜儀.光譜采集使用衰減全反射(ATR)模式.數(shù)據(jù)采集的分辨率為 4 cm-1，掃描次數(shù)32次.

1.6 溶菌酶纖維的原子力顯微鏡形貌表征

原子力圖像通過俄羅斯的NT-MDT Solver P47 掃描探針顯微鏡，采用輕敲模式測得.測量時(shí)，將預(yù)處理前的溶菌酶纖維溶液用高純水稀釋2倍，然后滴在新鮮剝離的云母表面.靜置5 min后，用去離子水沖洗云母表面，自然風(fēng)干后測樣.

1.7 動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)方法

動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)采用SFM-300停流動(dòng)力學(xué)裝置進(jìn)行實(shí)驗(yàn).實(shí)驗(yàn)時(shí)，1個(gè)樣品室加入0.4 mmol/L ThT，另外2個(gè)樣品室儲(chǔ)存加入9.6 μmol/L預(yù)處理過的溶菌酶纖維.進(jìn)行停流動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)，3個(gè)樣品室中的樣品按ThT：淀粉樣纖維：淀粉樣纖維=1∶2∶2的體積比，同時(shí)打入到停流反應(yīng)池內(nèi).混合后，ThT的濃度為80 μmol/L，溶菌酶纖維濃度為7.7 μmol/L.基于以往研究，鹽酸胍誘導(dǎo)的溶菌酶纖維的位點(diǎn)數(shù)目基本上每3個(gè)溶菌酶單體構(gòu)成一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)[18]，這樣80 μmol/L 的ThT和7.7 μmol/L的溶菌酶纖維的濃度組合可以保證ThT的量相對于溶菌酶纖維上的位點(diǎn)而言是大大過量的，保證纖維上的所有結(jié)合位點(diǎn)均被結(jié)合.熒光激發(fā)波長為435 nm，PMT上加裝450 nm的濾光片.數(shù)據(jù)采集間隔：0～2 s內(nèi)每50 ms監(jiān)測1次，2～10 s內(nèi)每100 ms監(jiān)測1次.

2 結(jié)果與討論

2.1 溶菌酶淀粉樣纖維的表征

首先對預(yù)處理前鹽酸胍誘導(dǎo)的溶菌酶纖維采用原子力顯微鏡進(jìn)行形貌表征，如圖2所示，纖維高度大約為20 nm.這里需要指出的是，鹽酸胍誘導(dǎo)法制備的淀粉樣纖維的形貌與筆者之前研究的淀粉樣纖維的形貌有較大的不同[19]，這主要是由于纖維化具體條件的差異.之前筆者的研究中采用酸性和加熱的條件，使溶菌酶先進(jìn)行水解，生成一系列較小分子量的多肽，這些多肽再進(jìn)一步進(jìn)行纖維化，這樣獲得的纖維較為光滑和細(xì)長.但缺點(diǎn)是成分復(fù)雜，不適合進(jìn)行定量動(dòng)力學(xué)分析.在本研究中，使用鹽酸胍誘導(dǎo)法獲得的溶菌酶蛋白由純的溶菌酶單體構(gòu)成，成分單一，適合動(dòng)力學(xué)研究，而且其結(jié)合位點(diǎn)大致數(shù)目在從前文獻(xiàn)中也有報(bào)道.

對上述鹽酸胍誘導(dǎo)法獲得的溶菌酶纖維，筆者進(jìn)行了ThT熒光表征、剛果紅染色分析和紅外光譜表征.ThT與溶菌酶纖維結(jié)合的熒光光譜如圖3所示.通過和單純ThT溶液在相同條件下測得的熒光光譜對比.發(fā)現(xiàn)當(dāng)ThT與溶菌酶纖維結(jié)合后，當(dāng)激發(fā)波長為450 nm時(shí)，熒光發(fā)射光譜在480 nm附近會(huì)產(chǎn)生明顯的熒光增強(qiáng)，而單純ThT溶液在這個(gè)區(qū)域基本無熒光.

圖2 溶菌酶纖維的原子力形貌表征Fig.2 AFM image of lysozyme fibrils

圖3 ThT與溶菌酶纖維結(jié)合后的熒光光譜和單純ThT熒光光譜對比Fig.3 Fluorescence spectrum of ThT bound onto lysozyme fibrils and ThT control

剛果紅與溶菌酶纖維結(jié)合的紫外可見光譜如圖4所示.通過和單純剛果紅溶液在相同條件下測得的光譜對比，發(fā)現(xiàn)當(dāng)剛果紅與溶菌酶纖維結(jié)合后，在540 nm處出現(xiàn)吸收峰增強(qiáng).這是淀粉樣纖維的一個(gè)特征光譜標(biāo)志[20].圖5中檢測了溶菌酶纖維的紅外光譜.淀粉樣纖維的形成必然伴隨β-折疊結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生.β-折疊結(jié)構(gòu)在蛋白紅外光譜的酰胺Ⅰ帶1 640 cm-1以下區(qū)域有特征吸收峰[21].這個(gè)峰的存在可以作為蛋白淀粉樣纖維成功制備的一個(gè)佐證.如圖5所示，其在1 629 cm-1附近有明顯的吸收峰，這個(gè)峰就來自淀粉樣纖維中β-折疊結(jié)構(gòu).

圖4 剛果紅與溶菌酶纖維結(jié)合后的紫外可見吸收光譜和單純剛果紅吸收譜的對比Fig.4 UV-Vis spectroscopy of Congo red bound onto lysozyme fibril and Congo red control

圖5 溶菌酶纖維的紅外光譜Fig.5 FTIR spectrum of lysozyme fibril

2.2 ThT結(jié)合溶菌酶纖維的熒光停流動(dòng)力學(xué)研究

應(yīng)用熒光檢測的方法，結(jié)合停流技術(shù)研究了ThT結(jié)合溶菌酶纖維的動(dòng)力學(xué)過程.實(shí)驗(yàn)中，為了確保動(dòng)力學(xué)反應(yīng)在ThT過量的條件下進(jìn)行，使ThT大過量，即在ThT濃度為80 μmol/L、淀粉樣纖維濃度為7.7 μmol/L的條件下進(jìn)行熒光停流動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn).圖6為熒光變化曲線，筆者看到隨著反應(yīng)時(shí)間的推移，ThT熒光先呈現(xiàn)一個(gè)快速上升的過程，這一過程大約持續(xù)2 s，之后呈現(xiàn)緩慢上升的過程，最后在10 s左右趨于平緩變化.

圖6 ThT與淀粉樣纖維結(jié)合的停流動(dòng)力學(xué)曲線Fig.6 Stop-flow kinetic curve of ThT binding onto amyloid fibril

對這一動(dòng)力學(xué)曲線，進(jìn)行了數(shù)學(xué)擬合.發(fā)現(xiàn)單指數(shù)擬合效果不好.雙指數(shù)可以獲得非常好的擬合效果，(函數(shù)形式:y=A1e-k1t+A2e-k2t)相關(guān)系數(shù)R2為0.999，同時(shí)把相關(guān)擬合參數(shù)列于表1.

表1 ThT與溶菌酶纖維結(jié)合的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.1 kinetic parameters of ThT binding onto amyloid fibril

2.3 平行反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型的建立和推導(dǎo)

筆者提出應(yīng)用多位點(diǎn)平行反應(yīng)模型來解釋觀察到的雙指數(shù)擬合現(xiàn)象，具體推導(dǎo)如下.假設(shè)淀粉樣纖維上存在多個(gè)可以與ThT進(jìn)行結(jié)合的位點(diǎn)，如圖7所示：

圖7 ThT與淀粉樣纖維結(jié)合的多位點(diǎn)平行反應(yīng)模型Fig.7 Multi-site parallel mechanism of ThT binding onto amyloid fibril

其中a、b、c… 分別為0時(shí)刻ThT和纖維上各結(jié)合位點(diǎn)的濃度，x1、x2… 分別為t時(shí)刻纖維上各結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的ThT的濃度，也等同于各個(gè)位點(diǎn)在t時(shí)刻被消耗掉的濃度.則各平行反應(yīng)的反應(yīng)速率如下：

(1)

(2)

?

當(dāng)a遠(yuǎn)大于b、c、時(shí)，對本研究而言也就是相當(dāng)于ThT過量的情況，

(3)

(4)

?

將上式積分可得：

x1=b-bexp(-k1at)，

(5)

x2=c-cexp(-k2at)，

(6)

?

因?yàn)樵跓晒鈼l件下，所得信號(hào)為各結(jié)合位點(diǎn)上ThT的總和，所以

x=x1+x2+…=(b+c+…)-bexp(-k1at)-cexp(-k2at)-…

(7)

因?yàn)闊晒鈴?qiáng)度與濃度成正比，所以體系實(shí)測的總熒光強(qiáng)度為

Ix=(Ib+Ic+…)-Ibexp(-k1at)-Icexp(k2at)-…

(8)

由以上(8)推導(dǎo)看出，熒光動(dòng)力學(xué)曲線為雙指數(shù)方程形式，符合多位點(diǎn)平行反應(yīng)機(jī)理模型.具體到筆者的溶菌酶纖維體系，其雙指數(shù)熒光動(dòng)力學(xué)形式說明我們?nèi)芫咐w維上有2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，每個(gè)結(jié)合位點(diǎn)上ThT均以一個(gè)簡單的一步結(jié)合的方式與纖維結(jié)合，2個(gè)位點(diǎn)上的結(jié)合動(dòng)力學(xué)反應(yīng)平行發(fā)生.

3 結(jié)論

本文應(yīng)用停流動(dòng)力學(xué)技術(shù)研究了ThT與溶菌酶淀粉樣纖維結(jié)合的快速動(dòng)力學(xué)過程，發(fā)現(xiàn)ThT和溶菌酶纖維結(jié)合的熒光增長曲線符合雙指數(shù)增長模式，提出了一個(gè)雙位點(diǎn)平行反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型.筆者希望本研究對進(jìn)一步深入理解熒光染料分子與淀粉樣纖維之間的相互作用提供有益借鑒.

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(責(zé)任編輯：梁俊紅)

Fluorescence-detectedstopped-flowkineticinvestigationofthioflavinTbindingontotheamyloidfibriloflysozyme

MAGang,QINZhe,LIUSiyang,SHANGYanli,JIABaohuan

(Key Laboratory of Medicinal Chemistry and Molecular Diagnosis of Ministry of Education,College of Chemistry and Environmental Science,Hebei University,Baoding 071002,China)

Deposition of amyloid fibrils in tissues and organs is relevant to a wide range of devastating human diseases,including Alzheimer’s disease,Parkinson’s disease,and type Ⅱ diabetes.Thioflavin T (ThT)is widely used as a fluorescent probe for qualitative and quantitative detections of amyloid fibrils.Yet the exact kinetic mechanism of ThT binding onto amyloid fibril remains elusive.In this study,we used fluorescence-detected stopped-flow technique to study the binding mechanism of ThT onto the amyloid fibril of hen egg white lysozyme induced by guanidine hydrochloride.We proposed a kinetic binding mechanism to interpret our experimental observations.Our results showed that the binding of ThT onto lysozyme fibril follow a dual-site parallel binding mechanism.We believe our work is beneficial for better understanding of the interaction between fluorescent dye and amyloid fibril.

thioflavin T;lysozyme;amyloid fibril;kinetics

O643

A

1000-1565(2017)05-0476-07

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.05.006

2017-03-26

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21075027)；河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(B2011201082；B2016201034)

馬剛 (1971—)，男，北京人，河北大學(xué)教授，博士，主要從事與蛋白纖維化聚集相關(guān)的研究.E-mail：gangma@hbu.edu.cn

馬剛 (1971—)，男，北京人，河北大學(xué)教授，博士，主要從事與蛋白纖維化聚集相關(guān)的研究.E-mail：gangma@hbu.edu.cn；商艷麗(1979—)，女，河北保定人，河北大學(xué)副教授，博士，主要從事材料化學(xué)方面的研究.E-mail：ylshang@hbu.edu.cn