不同分子生物學(xué)方法在手足口病標(biāo)本檢測(cè)中的應(yīng)用

張龍，袁青，鄭雅萍

（浙江省金華市中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科，浙江 金華 321000）

不同分子生物學(xué)方法在手足口病標(biāo)本檢測(cè)中的應(yīng)用

張龍，袁青，鄭雅萍

（浙江省金華市中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科，浙江 金華 321000）

目的探究分析不同分子生物學(xué)方法在手足口病標(biāo)本檢測(cè)中的應(yīng)用效果。方法隨機(jī)選取我院2014年1月至2016年1月收集的120份手足口病標(biāo)本為研究對(duì)象，分別根據(jù)不同分子生物法，將其分為實(shí)時(shí)RTPCRZ組﹑一步法RT-PCRZ組﹑巢式PCR組進(jìn)行檢測(cè)，比較分析三種方法檢測(cè)腸道71型（EV71）敏感性。結(jié)果實(shí)時(shí)RT-PCR法與巢式PCR手足口病檢測(cè)率明顯高于與一步法RT-PCR法（P＜0.05）。結(jié)論RT-PCR法與巢式PCR法在手足口病檢測(cè)方面的檢測(cè)準(zhǔn)確性較高，值得臨床應(yīng)用。

手足口病；PCR；一步法；陽(yáng)性率

0 引言

手足口病（HFMD）是臨床診療中較為常見(jiàn)的小兒傳染性疾病，主要發(fā)病人群是5歲以下兒童，其病原體主要為科薩奇病毒A組16型，及腸道病毒71型[1]。目前，臨床上呢尚未出現(xiàn)有效針對(duì)治療藥物，因此，早期診斷手足口病是提高治療效果的關(guān)鍵[2-3]。隨著生物醫(yī)療研究發(fā)展的不斷深入，不同分子生物學(xué)方法在臨床上的應(yīng)用也更加普遍。鑒于此，本研究在手足口病標(biāo)本檢測(cè)中采用分子生物學(xué)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究所選120例研究標(biāo)本均來(lái)自于我院住院患兒，所有患兒入院時(shí)間為2014年1月至2016年1月。所有患兒均經(jīng)臨床診斷確診，符合手足口病診斷標(biāo)準(zhǔn)，具有發(fā)熱﹑口腔潰瘍﹑皮疹等臨床癥狀表現(xiàn)，并伴有不同程度中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[4]。120例患兒中30例需要住院，70例屬于病情較輕的患兒，20例患兒病情較重，男女患者分別65例﹑55例，年齡8個(gè)月至5歲，平均年齡為（3.1±1.5）歲。所有患兒所采集標(biāo)本均采用不同生物分子方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 檢測(cè)方法

所有手足口病標(biāo)本均取自120例患兒，標(biāo)本采集過(guò)程中嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作，將收集到的患兒糞便放置在無(wú)菌密封的大便盒中。采用醫(yī)用棉簽在患兒扁桃體及咽后壁擦拭，收集咽喉部位的樣本，并將所用棉簽放在3mL Hank采樣管中保存，為了確保標(biāo)本的完好保存，將所得標(biāo)本放置在-80℃冰箱內(nèi)進(jìn)行保存待用。然后，分別用實(shí)時(shí)RT-PCRZ法﹑一步法RT-PCRZ﹑巢式PCR法檢測(cè)所有標(biāo)本。PCR擴(kuò)增儀及試劑盒均購(gòu)自Promega公司，將溫度調(diào)至45℃并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄處理45min，然后將溫度控制在94℃，實(shí)施預(yù)變性處理2min，經(jīng)20s變性處理后，退火處理應(yīng)控制在45℃條件下，延伸溫度71℃條件下，時(shí)間為30s，共進(jìn)行36個(gè)循環(huán)。最后，分析三組檢測(cè)結(jié)果。

表1 手足口病陽(yáng)性結(jié)果（n，%）

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，P＜0.05表示數(shù)據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

在實(shí)時(shí)RT-PCR組，重死患兒﹑輕癥患兒以及住院患兒標(biāo)本陽(yáng)性率檢測(cè)結(jié)果分別為80%﹑22.9%﹑80%。在一步法RT-PCR組中，重死患兒﹑輕癥患兒以及住院患兒標(biāo)本陽(yáng)性率檢測(cè)結(jié)果分別為45%﹑8.6%﹑16.7%。在巢式PCR組中，重死患兒﹑輕癥患兒以及住院患兒標(biāo)本陽(yáng)性率檢測(cè)結(jié)果分別為85%﹑25.7%﹑86.7%。各組檢測(cè)陽(yáng)性率比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

3 討論

手足口病在兒童醫(yī)療診治中具有較高的發(fā)病率，是臨床醫(yī)療診治中較為常見(jiàn)的出疹性疾病，以人腸道病毒屬﹑微小核糖核酸病毒等病原為主，臨床發(fā)病率較高[5-7]。由于患兒體制較弱，各項(xiàng)免疫系統(tǒng)發(fā)展還不完善，一旦出現(xiàn)手足口病，將在一定程度上影響患兒健康成長(zhǎng)，需要早發(fā)現(xiàn)早治療。因此，臨床檢測(cè)手足口病標(biāo)本病原體可以臨床病例治療中提供相關(guān)指導(dǎo)價(jià)值。陳競(jìng)[8]等人通過(guò)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄（RT）-聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）以及巢式PCR進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果比較，結(jié)果顯示，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)對(duì)兩種病毒的檢測(cè)分別是EV71為79例（38.9%），CAV16為 48例（23.6%）;巢 式 PCR監(jiān)測(cè)方法是EV71為145例（71.5%），CAV16為59例（29.1%）說(shuō)明巢式PCR在CAV16及EV71檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值更高，其靈敏度也相對(duì)較高。其中，實(shí)時(shí)RT-PCR需要在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)完成，病原體陽(yáng)性分析結(jié)果在合理的時(shí)間內(nèi)結(jié)果較為準(zhǔn)確[9]。一步法RT-PCR指的是在逆轉(zhuǎn)錄條件下，實(shí)施DNA擴(kuò)增，并進(jìn)行臨床分析[10]。巢式 PCR法需要與模板結(jié)合制作引物，并在引物的作用下完成擴(kuò)增，進(jìn)而實(shí)施病原體分析[11-12]。在本次研究中，實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性率與一步法RTPCR﹑巢式PCR比較存在一定差異，前者檢測(cè)效果更為靈敏，檢測(cè)結(jié)果與以往研究報(bào)告[5]一致。

綜上所述，相對(duì)于一步法RT-PCR﹑巢式PCR，實(shí)時(shí)RT-PCR操作簡(jiǎn)便，且在手足口病標(biāo)本檢測(cè)中的準(zhǔn)確率較高，因此，可將實(shí)時(shí)RTPCR﹑巢式PCR作為小兒手足口病檢測(cè)中的重要方式，值得深入探究。

[1] 關(guān)桂英,王風(fēng)朝.不同分子生物學(xué)方法檢測(cè)手足口病標(biāo)本的應(yīng)用分析[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2014,20(22):133-134.

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Application of Different Molecular Biological Methods in Detection of Hand,Foot and Mouth Disease

ZHANG Long, YUAN Qing, ZHENG Ya-ping
(Department of Clinical Laboratory, Jinhua City Central Hospital of Zhejiang, Jinhua, Zhejiang, 321000)

ObjectiveTo investigate and analyze application effect of different molecular biological methods in detection of hand, foot and mouth disease.MethodsChoose 120 cases HFMD collected in our hospital from January 2014 to January 2016 randomly as research objects, according to different molecular biological methods, divide them into real-time RTPCRZ group, on step method RT-PCRZ group, nested PCR group respectively for detection, compare and analyze sensitivity detecting enterovirus 71 type (EV71) of three methods.ResultsHFMD detection rate of real-time RT-PCR and nested PCR was significantly higher than one-step RT-PCR method (P＜0.05).ConclusionRT-PCR and nested PCR method has higher accuracy in detecting HFMD disease, which is worthy of clinical promotion and application.

Hand foot mouth disease; PCR; One step method; Positive rate

10.19335/j.cnki.2096-1219.2017.12.038