HPLC法同時(shí)測定康復(fù)新液中兩種成分的含量

石金鳳，張臻＊，宋芹，章津銘＊，傅超美，何瑤，劉彬

·炮制制劑·

HPLC法同時(shí)測定康復(fù)新液中兩種成分的含量

石金鳳1，張臻1＊，宋芹2，章津銘1＊，傅超美1，何瑤1，劉彬3

目的：建立同時(shí)測定康復(fù)新液中尿苷和黃嘌呤含量的方法。方法：采用HPLC法，Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm,5 μm）色譜柱，甲醇-水(5：95) 作為流動(dòng)相，于254 nm波長下檢測，流速1.0 mL．min-1，柱溫30 ℃。結(jié)果：尿苷、黃嘌呤分別在0.10～3.96 μg．mL-1（r2=0.9998）、0.52～20.80 μg．mL-1（r2=0.9992）濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率分別為97.86%（RSD=1.25%）、97.39%（RSD= 0.68%）。測定5批次康復(fù)新液中尿苷和黃嘌呤的含量范圍分別為1.69～1.76 μg．mL-1、12.76～13.06 μg．mL-1，說明各批樣品質(zhì)量較均一。結(jié)論：本文建立的方法精密度高、重復(fù)性好，操作簡便快速，可用于康復(fù)新液的質(zhì)量控制。

HPLC；尿苷；黃嘌呤；康復(fù)新液

康復(fù)新液是昆蟲美洲大蠊(Periplaneta americanaL.)干燥蟲體的乙醇提取物制成的口服和外用制劑。該藥臨床應(yīng)用廣泛，效果良好，副作用小，具有通利血脈、養(yǎng)陰生肌等作用。內(nèi)服可用于瘀血阻滯，胃痛出血，胃，十二指腸潰瘍；以及陰虛肺癆，肺結(jié)核的輔助治療。外用可用于金瘡，外傷，潰瘍，瘺管，燒傷，燙傷，褥瘡之創(chuàng)面[1]。同時(shí)它對(duì)化療性疾病、婦科疾病，小兒手足口等病也具有較好療效[2～4]。康復(fù)新液中化學(xué)成分較復(fù)雜，主要為多元醇類、核苷類、肽類、粘糖氨酸、多種氨基酸等小分子類成分[5]，這對(duì)康復(fù)新液的質(zhì)控帶來困難，其現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[6]僅以測定總氨基酸含量來評(píng)價(jià)制劑品質(zhì)的高低，難以達(dá)到全面質(zhì)量控制的目的。

核苷類成分為美洲大蠊的抗炎成分之一[7]，同時(shí)核苷類物質(zhì)不僅是構(gòu)成核酸 RNA、DNA單體的前體，也是生物氧化、能量代謝中的能源物質(zhì)和抗病毒、抗腫瘤藥物的中間體，具有重要的生物活性[8]。其中，尿苷和黃嘌呤是主要的核苷成分，常被用于作為動(dòng)物藥的質(zhì)控指標(biāo)，如地龍[9]、海馬[10]、冬蟲夏草[11]等。目前尚未見有將尿苷、黃嘌呤兩種成分作為康復(fù)新液質(zhì)量控制方式的報(bào)道，因此本文旨在采用高效液相色譜儀（HPLC）建立一種同時(shí)測定康復(fù)新液尿苷和黃嘌呤的分析方法，用以更好地控制和完善康復(fù)新液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DL-720D數(shù)控超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）；UPH-I-10T優(yōu)普超純水器（成都超純科技有限公司）；BS200S電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；DZKW-4電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；SSI series 1500高效液相色譜儀（美國SSI公司）；Diamonsil C18（250×4.6mm，5μm）色譜柱。

1.2 試藥

康復(fù)新液（規(guī)格：100mL/瓶 四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限責(zé)任公司 批號(hào)分別為：140230、140905、150353、150723、151001）；尿苷對(duì)照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號(hào)：N-025-150730）；黃嘌呤對(duì)照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號(hào)：H-069-150729）；甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；超純水（成都超純科技有限公司）；三氯甲烷、鹽酸等其他試劑均為分析純（成都科龍化學(xué)試劑廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（5∶95）；體積流量1.0 mL．min-1；檢測波長254 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

取尿苷和黃嘌呤對(duì)照品，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，制成濃度分別為尿苷19.80 μg．mL-1、黃嘌呤104.00 μg．mL-1的混合對(duì)照品貯備液。

2.3 供試品溶液的制備

精密量取康復(fù)新液20 mL，加三氯甲烷12 mL、1 mol．L-1鹽酸3.4 mL，攪拌至析出的晶體完全溶解，置分液漏斗中，棄去三氯甲烷，再用三氯甲烷8 mL，洗滌，棄去三氯甲烷，重復(fù)兩次。精密量取6 mL，置10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備

按處方比例制成不含康復(fù)新的陰性樣品，并按”2.3”供試品溶液的制備項(xiàng)下方法制得陰性樣品溶液。

2.5 線性關(guān)系的考察

精密吸取上述對(duì)照品貯備液0.05，0.1，0.25，0.5，1，2 mL，分別至10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，制得不同濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取10 μL進(jìn)樣，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。見表1。

表1 線性范圍考察結(jié)果

2.6 專屬性試驗(yàn)

取陰性樣品溶液、混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，見圖1。

圖1 陰性樣品（A）、混合對(duì)照品（B）和康復(fù)新液樣品（C）的HPLC色譜圖

可見陰性樣品溶液在此條件下在與尿苷、黃嘌呤對(duì)照品相同的保留時(shí)間處未見干擾峰出現(xiàn)，表明其專屬性良好。

2.7 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，以峰面積計(jì)算，見表2。尿苷、黃嘌呤的RSD分別為：1.64%、1.81%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明儀器精密度良好。

表2 精密度試驗(yàn)數(shù)據(jù)表

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)的供試品溶液20 mL，共6份，按照供試品溶液的制備和檢測方法制備樣品溶液并進(jìn)行檢測，結(jié)果見表3。尿苷、黃嘌呤的平均含量分別為1.72 μg．mL-1、13.06 μg．mL-1，RSD分別為1.32%、1.92%，表明本方法重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)數(shù)據(jù)表

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份康復(fù)新液供試品溶液，按試驗(yàn)所得方法，分別于0，2，4，6，8，10，12 h取10 μL進(jìn)樣，結(jié)果見表4。供試品溶液中尿苷、黃嘌呤的峰面積RSD 分別為1.69%、1.90%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表4 供試品穩(wěn)定性試驗(yàn)數(shù)據(jù)表

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取尿苷對(duì)照品1.0 mg加入10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，作為尿苷對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密稱取黃嘌呤對(duì)照品5.5 mg加入50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，再吸取上述溶液4 mL至10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，作為黃嘌呤對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取康復(fù)新液樣品10 mL共9份，每組分別加入一定量的尿苷對(duì)照品儲(chǔ)備液和黃嘌呤對(duì)照品儲(chǔ)備液，使其含量分別達(dá)到樣品中尿苷和黃嘌呤含量的80%、100%、120%，每個(gè)濃度做3份，均照樣品含量測定項(xiàng)下制備供試液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表5。

表5 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

9 17.20 20.64 37.49 98.3 1 130.60 104.48 231.74 96.8黃嘌呤2 130.60 104.48 232.89 97.9 3 130.60 104.48 232.57 97.6 4 130.60 130.60 259.24 98.5 5 130.60 130.60 256.89 96.7 6 130.60 130.60 258.72 98.1 7 130.60 156.72 282.93 97.2 8 130.60 156.72 282.30 96.8 9 130.60 156.72 282.46 96.9 97.39 0.68

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示尿苷和黃嘌呤的平均回收率分別為97.86%、97.39%，RSD分別為1.25%、0.68%，表明所建立方法可滿足實(shí)驗(yàn)要求。

2.11 樣品含量測定

取5個(gè)批次的樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件及方法測定樣品中的尿苷和黃嘌呤的含量，結(jié)果見表6。

表6 5批康復(fù)新液樣品含量測定結(jié)果（n=3）

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5批康復(fù)新液中尿苷的含量范圍為1.69～1.76 μg．mL-1，黃嘌呤的含量范圍為12.76～13.06 μg．mL-1，各批次中尿苷和黃嘌呤含量較均一、穩(wěn)定。

3 討論

康復(fù)新液中含一定的附加劑，如果樣品不經(jīng)處理，對(duì)尿苷和黃嘌呤含量測定會(huì)帶來很大干擾，因此要除去溶液中的附加劑。通過多次考察試驗(yàn)，康復(fù)新液20 mL，加1 mol．L-1的鹽酸3.4 mL，分別用三氯甲烷12 mL，8 mL，8 mL萃取洗滌三次即可。

在研究中，篩選了甲醇-水、甲醇-0.1%冰醋酸、含0.07%冰醋酸的3%甲醇溶液三個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)；考察了甲醇-水（2:98）、甲醇-水（5:95）、甲醇-水（10:90）三個(gè)流動(dòng)相比例；考察了0.6mL．min-1、0.8mL．min-1、1.0mL．min-1三個(gè)流速。結(jié)果表明：除了甲醇-水系統(tǒng)能實(shí)現(xiàn)將兩種成分分離，其余流動(dòng)相系統(tǒng)均不能實(shí)現(xiàn)對(duì)兩種成分的分離。甲醇-水系統(tǒng)能夠得到基線平穩(wěn)、穩(wěn)定性好、分離度好、色譜峰峰形較好的HPLC圖譜。在流速小于1.0mL．min-1時(shí)，尿苷和黃嘌呤2種核苷類成分出峰時(shí)間稍長，峰寬較寬；而選擇1.0mL．min-1的流速時(shí)，兩種成分能夠在10 min內(nèi)快速同時(shí)分離。

本品為動(dòng)物類中成藥，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)難以控制產(chǎn)品質(zhì)量，目前康復(fù)新液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[6]采用單一成分丙氨酸為對(duì)照品，對(duì)總氨基酸進(jìn)行測定，利用茚三酮比色法，由于不同氨基酸所顯顏色不盡相同，導(dǎo)致該法專屬性不強(qiáng)，也不夠準(zhǔn)確；另一方面茚三酮顯色不穩(wěn)定，受外界及試劑因素的影響較大，且對(duì)環(huán)肽和內(nèi)酰胺類化合物需特殊處理，操作較為復(fù)雜。采用 HPLC 法測定康復(fù)新液中尿苷和黃嘌呤的含量，具有精密度高，回收率和專屬性好的優(yōu)點(diǎn)，符合《中國藥典》2015年版四部通則高效液相色譜法的各項(xiàng)要求，可作為提高康復(fù)新液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的檢測指標(biāo)。

[1] 國家藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)[S]. WS3-B-3674-2000.

[2] 舒崇湘, 冉新澤, 程天民, 等. 全身放射損傷對(duì)皮膚傷口組織細(xì)胞的影響及康復(fù)新的促愈作用[J]. 中國臨床康復(fù), 2003,7(11): 1644.

[3] 王靜. 康復(fù)新液治療慢性宮頸炎的臨床觀察[J]. 中外健康文摘, 2007, 4(1): 29.

[4] 謝楊學(xué), 何淑君. 康復(fù)新液治療小兒手足口病療效分析[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué), 2012, 39(1): 52.

[5] 焦春香, 劉光明, 周萍. 天然藥物康復(fù)新的研究進(jìn)展[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥, 2008, 19(11): 2623.

[6] 中國人民共和國衛(wèi)生部. 中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑. 第19冊[S]. 北京:人民衛(wèi)生出版社,1998:176.

[7] 肖小琴, 汪世平, 徐紹銳, 等. 美洲大蠊提取物抗炎、鎮(zhèn)痛作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國病原生物學(xué)雜志, 2007, 2(2): 140.

[8] 冷玲穎, 蔡志強(qiáng), 孫鐵民. 核苷類抗病毒前藥的研究進(jìn)展[J].中國藥物化學(xué)雜志, 2008, 18(4): 310.

[9] 李偉, 文紅梅, 鐘進(jìn), 等. HPLC測定地龍中次黃嘌呤、黃嘌呤、尿嘧啶、尿苷的含量[J]. 中藥材, 1996, 19(12): 625.

[10] 趙曉莉, 崔小兵, 狄留慶, 等. HPLC法測定海馬中次黃嘌呤、黃嘌呤的含量[J]. 中藥材, 2002, 25(10): 716.

[11] 靳丹虹, 梁芳慧, 董麗丹, 等. RP-HPLC 測定凍干鹿茸中的尿嘧啶和尿苷[J]. 現(xiàn)代科學(xué)儀器, 2013, (2): 141.

（ 責(zé)任編輯：何瑤）

Simultaneous determination of two components in Kangfuxin Ye by HPLC/

SHI Jin-feng1, ZHANG Zhen1, SONG Qin2,ZHANG Jin-ming1, FU Chao-mei1, HE Yao1, LIU Bin3//(1. College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan;2.College of bioengineering, Chengdu University, Chengdu 610106, Sichuan;3. Sichuan good doctor Pharmaceutical Group Co., Ltd, chengdu 610075, Sichuan).

Objective:To establish a method to detect xanthine and uridine content in Kangfuxin Ye at the same time.Method:HPLC method was established. The separation was carried out on a Diamonsil C18column (250 mm×4.6 mm, 5 μm)at 254 nm. The mobile phase was consist of MeOH and H2O (5:95) at the fl ow rate of 1 mL．min-1, and the column temperature was set at 30℃.Result:The linear ranges of uridine and xanthine were 0.10～3.96 μg．mL-1(r2=0.9993) and 0.52～20.80 μg．mL-1(r2=0.9991), respectively. The average recoveries of uridine and xanthine were 97.86% (RSD=1.25%) and 97.39% (RSD=0.68%),respectively. The method was applied in the determination of 5 batches of Kangfuxin Ye. The content ranges of uridine and xanthine were1.69～1.76 μg．mL-1and 12.76～13.06 μg．mL-1, respectively, which suggested that the quality of each batch was uniform.Conclusion:The method has high precision, good repeatability, simple and rapid operation. It can be used to control the standard of Kangfuxin Ye.

HPLC; uridine; xanthine; Kangfuxin Ye

R 283.6

A

1674-926X(2017)02-010-04

成都中醫(yī)藥大學(xué)科技發(fā)展基金（030018052）

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137；2. 成都大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 成都 610106；3.四川好醫(yī)生藥業(yè)集團(tuán)有限公司，四川 成都 610075

石金鳳（1993-），女，漢，重慶墊江人，中藥藥劑學(xué)專業(yè)在讀碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幮轮苿?Email:191006842@qq.com

1.張臻（1987-），女，漢，四川樂山人，講師，中藥藥劑學(xué)， Email:zhangzhendr@126.com 2.章津銘（1987-），男，漢，四川內(nèi)江人，講師，中藥藥劑學(xué)， Email:zhangjinming1987@126.com

2016-11-24