牛羊乳α-酪蛋白的B細(xì)胞抗原表位預(yù)測及免疫反應(yīng)性分析

薛海燕， 韓 波， 李 珊， 操 歌

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

牛羊乳α-酪蛋白的B細(xì)胞抗原表位預(yù)測及免疫反應(yīng)性分析

薛海燕， 韓 波， 李 珊， 操 歌

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

牛羊乳的α-酪蛋白營養(yǎng)功能相似，但蛋白質(zhì)亞類結(jié)構(gòu)和含量不同，可能是造成其過敏性差異的原因.本文旨在利用生物信息學(xué)DNAStar Protean軟件、SOPMA以及the BepiPred 1.0服務(wù)器對(duì)牛羊乳主要過敏蛋白αs1-酪蛋白(Casein，CN)的二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性、抗原指數(shù)、表面可及性和柔韌性進(jìn)行預(yù)測，分析鑒定主要B細(xì)胞抗原表位.合成相應(yīng)表位肽段序列，制備酪蛋白抗體，采用間接ELISA法分析驗(yàn)證合成多肽的免疫反應(yīng)性.結(jié)果表明：牛羊乳αs1-CN的氨基酸序列同源性89%，但抗原表位存在差異，與牛乳αs1-CN相比，羊乳抗原表位數(shù)目相差不大，但兩者抗原表位區(qū)域存在一定的包含重疊關(guān)系.且羊乳αs1-CN合成肽段P-1037(26～31，LSPEVP)、P-1040(140～142，EGN)和牛乳αs1-CN合成肽段P-1038(189～208，TDAPSFSDIPNPIGSENSEK)、P-1039(99～102，EDVP)都具有免疫反應(yīng)性，該結(jié)果為過敏原表位的選擇提供基礎(chǔ)，為牛羊乳過敏原性比較及改性加工提供理論依據(jù).

牛羊乳；αs1-酪蛋白； 二級(jí)結(jié)構(gòu)； 抗原表位

Abstract:Bovine and goat milkα-casein were very similar in the aspect of nutrition and function,but they induced different allergen reaction in consumers because of the differences in protein subclass structure and content.The purpose of this paper was to analyze and identify the B cell epitopes by predicting the secondary structure,hydrophilicity,antigenicity index,surface accessibility and flexibility of major allergic proteinαs1-casein from cow and goat milk using DNAStar Protean software,SOPMA and the BepiPred 1.0 server.Prepared the casein antibody by synthesizing the corresponding epitope peptide sequence and then used an indirect ELISA method to identify the immunoreactivity of the synthetic polypeptide.The results showed that the amino acid sequence homology of cow and goat milkαs1-CN was 89%,but the epitopes were different.The number of epitopes of goat milk was similar compared with cow milkαs1-CN,but there was a certain overlap between the two epitope regions.The peptide fragment P-1037 (26～31,LSPEVP),P-1040 (140～142,EGN) synthesized by the goat milkαs1-CN and the peptide P-1038 (189～208,TDAPSFSDIPNPIGSENSEK),P-1039(99～102,EDVP) synthesized by the cow milkαs1-CN had the immunoreactivity,which provided the basis for the selection of the allergen epitope,and provided the theoretical basis for the comparison of sensitization and modification of cow and goat milk.

Keywords:cow and goat milk;αs1-CN; the secondary structure; epitopes

0 引言

牛乳中富含多種蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素和礦物質(zhì)，是人體優(yōu)質(zhì)的營養(yǎng)來源，但同時(shí)也是聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織FAO (1995)報(bào)告的八大類過敏食物之一[1].牛乳過敏是指機(jī)體對(duì)牛乳蛋白的高反應(yīng)性(hypersensitivity)，是嬰幼兒最常見的食物過敏之一，在歐美發(fā)達(dá)國家，嬰兒牛乳過敏癥狀發(fā)生率達(dá)0.3%～7.5%[2].目前普遍認(rèn)為，牛乳蛋白中的酪蛋白(Casein，CN)、β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，β-LG)和α-乳白蛋白(α-lactalbumin，α-LA)是最主要的過敏原，其中酪蛋白主要由αs1、αS2、β和κ酪蛋白組成，約80%是由αs1-酪蛋白(αs1-CN)組成，對(duì)酪蛋白過敏的患者一般都對(duì)αs1-CN過敏[3,4].羊乳總熱量、干物質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂肪以及礦物質(zhì)含量均高于牛乳，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，且易被人體消化吸收利用，在國際營養(yǎng)學(xué)界被譽(yù)為“乳中之王”[5].以羊乳替代牛乳作為嬰幼兒主要的營養(yǎng)來源被廣泛認(rèn)可.羊乳和牛乳中酪蛋白所占比例相似，但羊乳中以β和κ-酪蛋白為主，αs1-CN含量(18.9%)遠(yuǎn)低于牛乳中的含量 (30.8%)[6].羊乳中αs1-CN含量較低，理論上具有較低的致敏性，Hodgkinson等[7]也證實(shí)了低αs1-CN含量的山羊乳可以減少抗原攝入量，降低致敏性.然而Muraro等[8]認(rèn)為山羊乳與牛乳具有相同的致敏性.所以，就目前山羊乳的低致敏性及其在預(yù)防嬰幼兒牛乳過敏中的應(yīng)用仍存在爭議.

食物蛋白質(zhì)引起機(jī)體致敏的主要原因是消化道內(nèi)未水解的蛋白質(zhì)抗原表位被免疫系統(tǒng)識(shí)別.抗原表位預(yù)測中，B細(xì)胞線性表位預(yù)測是目前研究的重點(diǎn)，它是研究抗原表位與已知氨基酸序列在蛋白質(zhì)上的某些結(jié)構(gòu)特征之間的關(guān)系，從氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)，親水性，表面可及性，柔韌性等方面，進(jìn)行序列的分析預(yù)測[6,9].常用的分析軟件有ABCpred[10]，BepiPred[11]，SOPMA[12]，DNAStar[13]，其中BepiPred，SOPMA，DNAStar這三種軟件較為常用，其基本原理是結(jié)合抗原蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)顯著性度量，理化性質(zhì)等指標(biāo)進(jìn)行簡單預(yù)測，操作簡單，只需輸入蛋白質(zhì)氨基酸序列，即可得出結(jié)果.該研究采用BepiPred，SOPMA和DNAStar這三種預(yù)測軟件對(duì)牛羊乳過敏原αs1-CN B細(xì)胞線性抗原表位進(jìn)行預(yù)測分析，并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證合成的抗原表位是否具有免疫反應(yīng)性，為進(jìn)一步對(duì)比驗(yàn)證牛乳和羊乳之間的抗原關(guān)系提供一定的理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

(1)主要材料：兔抗牛α-CN多克隆抗體(α-CN-IgG，效價(jià)1∶204800)，本室制備；HRP-羊抗兔Ig G抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；碳酸鈉、碳酸氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、明膠等常規(guī)試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純.

(2)主要儀器：MULTISKANmk3型酶標(biāo)儀，賽默飛世爾上海儀器有限公司；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海島析實(shí)業(yè)有限公司.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 牛羊乳αs1-CN氨基酸序列

通過NCBI數(shù)據(jù)庫檢索牛羊乳αs1-CN氨基酸序列，該序列在NCBI的基因登錄號(hào)分別為NP_851372、P18626.

1.2.2 牛羊乳αs1-CN二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用DNAStar Protean軟件(Gamier-Robson方法)和SOPMA網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器輸入檢索到的牛羊乳αs1-CN氨基酸序列分析預(yù)測兩者的二級(jí)結(jié)構(gòu).

1.2.3 牛羊乳αs1-CN親水性、抗原指數(shù)、表面可及性及柔韌性預(yù)測

應(yīng)用DNAStar Protean軟件，采用Kyte-Doolittle法、Jameson-Wolf法、Emini法和Karplus-Schulz法分別對(duì)檢索到的牛羊乳αs1-CN氨基酸序列進(jìn)行親水性、抗原指數(shù)、表面可及性及柔韌性預(yù)測.

1.2.4 B細(xì)胞線性抗原表位確定

利用the BepiPred 1.0服務(wù)器，直接輸入牛羊乳αs1-CN氨基酸序列，抗原指數(shù)高于1即為可能表位區(qū)域[14].并與牛羊乳αs1-CN二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果和親水性、抗原指數(shù)、表面可及性及柔韌性預(yù)測結(jié)果相結(jié)合，綜合分析得到B細(xì)胞線性抗原表位.

1.2.5 牛羊乳αs1-CN多肽合成及鑒定

選擇牛羊乳差異較大的抗原表位肽段，由杭州丹港生物科技有限公司，應(yīng)用全自動(dòng)多肽合成儀，采用固相合成法從肽鏈C端向N端依次合成.經(jīng)反高效液相色譜(RP-HPLC)以及質(zhì)譜對(duì)其進(jìn)行純度鑒定，純度大于98%，符合實(shí)驗(yàn)室要求.

1.2.6 多肽免疫反應(yīng)性鑒定

采用間接ELISA檢測合成多肽的免疫反應(yīng)性.將上述合成的多肽用包被緩沖液稀釋至10μg/mL，每孔加入100μL，以α-CN、β-LG蛋白分別作為陽性、陰性對(duì)照，4 ℃包被過夜[15].棄去蛋白包被液，每孔加入300μL PBST洗滌液洗滌3次，每次4 min，拍干，除去殘留氣泡和液體.每孔加入200μL明膠封閉液，37 ℃溫箱封閉1.5 h，洗滌，拍干.每孔加入濃度為5μg/mL的α-CN-Ig G 100μL(實(shí)驗(yàn)室制備，抗牛乳α-CN多克隆抗體兔血清)，同時(shí)設(shè)置陰性血清對(duì)照，37 ℃溫箱溫育1.5 h，使抗原抗體充分反應(yīng)，洗滌拍干.用PBS稀釋液將羊抗兔HRP-Ig G以1∶4000的比例稀釋作為二抗，每孔加入100μL，37 ℃溫箱溫育1 h，洗滌，拍干.每孔加入50μL TMB顯色液，37 ℃溫箱避光顯色15 min，顯色后每孔加入50μL終止液2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，450 nm測定吸光值.檢測時(shí)以P/N值>2.1(即多克隆抗體上清的吸光值大于陰性血清值的2.1倍)判定檢測結(jié)果為陽性，P/N值<2.1(即多克隆抗體上清的吸光值小于陰性血清值的2.1倍)判定檢測結(jié)果為陰性[15].

2 結(jié)果與分析

2.1 牛羊乳αs1-CN所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列

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對(duì)比分析牛羊乳αs1-CN氨基酸序列，將不同差異位點(diǎn)標(biāo)出，其同源性達(dá)到89%，且牛乳αs1-CN氨基酸序列相比羊乳氨基酸差異位點(diǎn)大多為一些極性親水性氨基酸.

2.2 牛羊乳αs1-CN的二級(jí)結(jié)構(gòu)

利用SOPMA網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器對(duì)牛羊乳αs1-CN二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果如圖1所示.

(a)牛乳αs1-CN

(b)羊乳αs1-CN圖1 SOPMA預(yù)測牛乳αs1-CN 和羊乳αs1-CN二級(jí)結(jié)構(gòu)

利用DNAStar Protean軟件對(duì)牛羊乳αs1-CN二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果如圖2所示.

(a)牛乳αs1-CN

(b)羊乳αs1-CN圖2 DNAStar預(yù)測牛乳αs1-CN 和羊乳αs1-CN二級(jí)結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是抗原表位預(yù)測的重要參數(shù)之一.β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲由于其松散的結(jié)構(gòu)，易發(fā)生扭曲、盤旋，并展示在蛋白質(zhì)的表面，因此該區(qū)域常含有優(yōu)勢抗原表位而α-螺旋和β-折疊化學(xué)鍵能比較高，結(jié)構(gòu)規(guī)則不易變形，較難結(jié)合抗體，一般不作為抗原表位[16-18].綜合上述兩者的預(yù)測結(jié)果可推出牛乳αs1-CN可能抗原表位區(qū)域?yàn)?9～27，41～43，60～62，99～102，118～120，127～129，148～150，185～186，189～210；羊乳αs1-CN可能抗原表位區(qū)域?yàn)?8～31，41～42，59～62，78～83，99～103，119～121，128，140～142，172～178，183～186，189～210.對(duì)比分析預(yù)測出的牛羊乳αs1-CN抗原表位區(qū)域，從二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示羊乳可能抗原區(qū)域數(shù)目高于牛乳，且它們具有相同抗原區(qū)域189～210.

2.3 牛羊乳αs1-CN親水性、抗原指數(shù)、表面可及性及柔韌性預(yù)測結(jié)果

利用DNAStar Protean軟件對(duì)αs1-CN(bovine、capra hircus)親水性、抗原指數(shù)、表面可及性及柔韌性進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如圖3所示.

(a)牛乳αs1-CN

(b)羊乳αs1-CN圖3 DNAStar預(yù)測牛乳αs1-CN和 羊乳αs1-CN親水性、抗原指數(shù)、 表面可及性和柔韌性

蛋白質(zhì)的親水性、抗原指數(shù)、表面可及性和柔韌性在抗原形成方面起著主要作用，當(dāng)親水性>0、抗原指數(shù)>0和表面可及性>1時(shí)，形成表位的可能性較大[19-21].綜合預(yù)測結(jié)果推出牛乳αs1-CN可能抗原表位區(qū)域?yàn)?7～19，22～26，50～52，63～67，70～74，77～83，85～105，117～122，129～134，145～149，185～210；羊乳αs1-CN可能抗原表位區(qū)域?yàn)?7～19，27，30～31，35，48～52，55，62～67，70～76，81～84，90～105，117～119，129～134，139～149，205～219.對(duì)比分析兩者抗原表位差異得出羊乳αs1-CN抗原表位區(qū)域與牛乳相比，其大多分布在αs1-CN氨基酸序列的C端，且羊乳αs1-CN表位區(qū)域于牛乳表位區(qū)域存在一定的包含重疊關(guān)系.

2.4 B細(xì)胞線性抗原表位綜合預(yù)測

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和氨基酸殘基的親水性、抗原指數(shù)、表面可及性和柔韌性都是影響B(tài)細(xì)胞線性抗原表位的重要因素[22].利用the BepiPred 1.0服務(wù)器對(duì)牛乳αs1-CN氨基酸序列的抗原指數(shù)進(jìn)行預(yù)測得到的可能性抗原表位是21，60～68，80～81,85～86，99～102，142～152，173～179，187～208，羊乳αs1-CN可能性抗原表位是26～31，60～70，74～91，100～102， 140～146，187～208.將the BepiPred 1.0、SOPMA、和DNAStar這三種預(yù)測軟件得到的抗原表位綜合分析得出牛乳αs1-CN可能抗原表位為22～26，86～87，99～102，118～120，148～149，185～186，189～210，羊乳αs1-CN可能抗原表位為18～19，27，30～31，83～84，99～103，117～119，140～142，205～210.對(duì)比分析預(yù)測得到的牛羊乳αs1-CN抗原表位，較牛乳αs1-CN相比，羊乳αs1-CN同樣具有較多區(qū)域的抗原表位，且二者存在一定的包含關(guān)系.

2.5 牛羊乳αs1-CN合成肽的設(shè)計(jì)

綜合上述可能抗原表位，選擇其長度不同的四條預(yù)測表位肽段采用固相合成法合成.分別來自于羊乳αs1-CN命名為：P-1037(26～31，LSPEVP)和P-1040(140～142，EGN)；來自于牛乳αs1-CN命名為：P-1038(189～208，TDAPSFSDIPNPIGSENSEK)和P-1039(99～102，EDVP).

2.6 合成肽免疫反應(yīng)性鑒定

利用實(shí)驗(yàn)室制備的兔抗牛α-CN多克隆抗體作為一抗，間接ELISA法檢測合成肽的免疫反應(yīng)性，以P/N>2.1為判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果如圖4示.由圖4可知，合成的四種多肽和α-CN均與α-CN-Ig G呈陽性反應(yīng)，且α-CN測出的吸光值高于合成的四種多肽；而β-LG與α-CN-IgG呈陰性反應(yīng)，由此初步說明，合成多肽具有免疫反應(yīng)性.其免疫原性還需進(jìn)一步驗(yàn)證.

圖4 合成多肽免疫反應(yīng)性鑒定

3 討論

關(guān)于牛乳主要過敏原抗原表位的預(yù)測研究報(bào)道較多.B Ruite等[23]利用重疊肽的方法發(fā)現(xiàn)牛乳αs1-CN的T細(xì)胞表位識(shí)別位點(diǎn)即43-66，73-96，91-114和127-180.Picariello G等[24]利用體外模擬胃腸消化后的牛乳蛋白水解液通過在Caco-2細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收研究發(fā)現(xiàn)β-Lg 40～60和125～135具有一定的致敏性.但目前從抗原位點(diǎn)出發(fā)研究羊乳過敏性的報(bào)道并不多見，Sanz C L等[25]利用豚鼠進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)豚鼠經(jīng)口給予羊奶、牛奶和抗乳血清時(shí)，山羊奶的變應(yīng)原性低于牛奶，其變應(yīng)原性可能是由酪蛋白和抗乳血清不同蛋白質(zhì)之間的特異性抗原決定簇引起.本研究對(duì)牛羊乳主要過敏原αs1-CN B細(xì)胞線性抗原表位進(jìn)行預(yù)測，可為對(duì)目前山羊乳的低致敏性及其在預(yù)防嬰幼兒牛乳過敏中的應(yīng)用提供一定的理論和技術(shù)參考.

蛋白引起致敏的前提是它具有抗原性，而抗原表位是蛋白質(zhì)具有抗原性的關(guān)鍵因素，是抗原與抗體特異性識(shí)別的基本單位.B細(xì)胞線性抗原表位是指抗原表面可被B細(xì)胞抗體識(shí)別的線性片段.所以，準(zhǔn)確預(yù)測B細(xì)胞線性抗原表位，可為單克隆抗體的制備、羊乳抗原性的研究等奠定一定的基礎(chǔ).該研究首先采用SOPMA網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，DNAStar軟件對(duì)牛羊乳αs1-CN氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比分析，得出二者氨基酸序列同源性雖較高，但預(yù)測出二級(jí)結(jié)構(gòu)仍存在差異，其中羊乳αs1-CN β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的數(shù)量較多，如上述利用SOPMA網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器對(duì)牛乳αs1-CN二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測得到β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的數(shù)目為3.74%和38.32%，羊乳預(yù)測得到的數(shù)目為4.21%和44.39%，明顯大于牛乳.這些差異同牛羊乳αs1-CN氨基酸序列上個(gè)別氨基酸的不同存在一定的關(guān)系.其次采用DNAStar軟件對(duì)牛羊乳αs1-CN的親水性、抗原指數(shù)、表面可及性和柔韌性預(yù)測，由于在肽段1～200位個(gè)別氨基酸的不同，預(yù)測出的抗原表位在該位存在部分差異且有一定的包含關(guān)系，而在200～214肽位間的氨基酸幾乎無明顯差異，使得此區(qū)段預(yù)測出的牛乳αs1-CN抗原表位羊乳αs1-CN也同樣具有該表位.本研究僅采用了生物學(xué)軟件對(duì)牛羊乳αs1-CN的二級(jí)結(jié)構(gòu)，親水性，抗原指數(shù)，表面可及性和柔韌性等預(yù)測并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了所預(yù)測氨基酸序列的免疫反應(yīng)性，為深入研究羊乳過敏原提供一定的理論依據(jù).

在乳過敏性差異方面，該結(jié)果還不能全面的說明羊乳是否可作為低致敏產(chǎn)品代替牛乳作為牛乳過敏患者的直接乳源，還有待對(duì)主要過敏原αs2-CN和β-LG等對(duì)比分析.但該結(jié)果可初步判定羊乳αs1-CN抗原表位合成多肽具有免疫反應(yīng)性，后續(xù)進(jìn)一步通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其多肽是否具有免疫原性產(chǎn)生抗體.

4 結(jié)論

該研究綜合三種軟件預(yù)測參數(shù)得到牛乳αs1-CN可能抗原表位為22～26，86～87，99～102，118～120，148～149，185～186，189～210，羊乳αs1-CN可能抗原表位為18～19，27，30～31，83～84，99～103，117～119，140～142，205～210.分析比較牛羊乳αs1-CN B細(xì)胞線性抗原表位差異，與牛乳αs1-CN抗原表位相比，羊乳αs1-CN同樣具有相當(dāng)?shù)目乖砦粎^(qū)域.因此，可以初步確定羊乳中雖含有少量的αs1-CN但其仍具有一定的抗原性.通過間接ELISA檢測合成多肽的免疫性，實(shí)驗(yàn)表明合成多肽呈陽性反應(yīng)，與抗體發(fā)生反應(yīng)，具有免疫反應(yīng)性，其免疫原性及過敏原性有待驗(yàn)證.

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【責(zé)任編輯：蔣亞儒】

PredictionofBcellantigenepitopesofα-caseincowandgoatmilkanditsimmunoreactivityidentification

XUE Hai-yan, HAN Bo, LI Shan, CAO Ge

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

2017-08-11

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31301405)； 陜西省科技廳科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃項(xiàng)目(2013KTZB02-02-05(2))； 陜西省教育廳專項(xiàng)科研計(jì)劃項(xiàng)目(16JK1088)

薛海燕(1979-)，女，陜西興平人，副教授，博士，研究方向：食品營養(yǎng)與安全

2096-398X(2017)05-0133-06

Q518.1

A