食源性糖蛋白分離純化的研究進(jìn)展

趙文竹，張宏玲，陳月皎，于志鵬，*，張瑞雪，劉靜波，勵建榮，*

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧錦州121013；2.吉林大學(xué)營養(yǎng)與功能食品研究室，吉林長春130062）

食源性糖蛋白分離純化的研究進(jìn)展

趙文竹1，張宏玲1，陳月皎1，于志鵬1，*，張瑞雪1，劉靜波2，勵建榮1，*

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧錦州121013；2.吉林大學(xué)營養(yǎng)與功能食品研究室，吉林長春130062）

糖蛋白是由寡糖鏈與蛋白質(zhì)共價相連構(gòu)成的復(fù)合糖，具有多種生物活性，糖蛋白的分離純化與糖蛋白結(jié)構(gòu)解析和功能分析的研究有著密不可分的關(guān)系。對糖蛋白的分離純化方法進(jìn)行綜述，并對未來糖蛋白的分離純化進(jìn)行展望，旨在探索糖蛋白的高效分離純化方法，為糖蛋白的深入研究提供理論依據(jù)。

糖蛋白；分離；純化；結(jié)構(gòu)鑒定

Abstract：Glycoprotein is a glycoconjugate in which a protein carries one or more carbohydrate chains covalently attached to its polypeptide backbone.Glycoprotein has emerged as an important class of bioactive natural products extracted from natural resources.The purification of glycoprotein has intimate relation with the research of glycoprotein structure and function analysis.Reviewing the methods of purification of glycoprotein，in addition，the further study of purification of glycoprotein was addressed to find a novel approach for purification of glycoprotein，aiming to provide a theory basis for furthering research of glycoprotein.

Key words：glycoprotein；separation；purification；identification

糖蛋白是一種結(jié)合蛋白，是寡糖鏈與多肽以多種形式共價相連且具有生物活性的物質(zhì)，兼具多糖和蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。糖蛋白是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的產(chǎn)物，蛋白質(zhì)的許多生理功能均可以通過糖基化來實現(xiàn)[1]。糖蛋白具有抗氧化[2]，抗老年癡呆[3]，抗炎癥[4]，免疫調(diào)節(jié)[5]等生物活性，生物活性與糖鏈有著密不可分的關(guān)系，如糖脂糖鏈對血型、大腦及神經(jīng)組織的生命活動有決定作用[6]。糖鏈結(jié)構(gòu)對于糖蛋白功能活性有著直接的影響，高純度的糖基化蛋白是結(jié)構(gòu)解析的首要步驟，因此，糖蛋白的分離純化是結(jié)構(gòu)分析和功能性分析的前提基礎(chǔ)[1]。糖蛋白的純化是指除去粗糖蛋白中的雜質(zhì)，獲得單一糖蛋白組分的過程，對于糖蛋白的分離純化主要是參考蛋白質(zhì)和多糖的分離純化方法[7]，由于其糖鏈結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和多樣性，糖蛋白的分離純化在一定程度上增加了難度，因此純化的方法尤為重要。本文對目前常用的糖蛋白分離純化方法進(jìn)行介紹。

1 色譜法

色譜法是糖蛋白分離純化研究中一種常用手段，其應(yīng)用已較為成熟[8-17]，主要為離子交換色譜法、凝膠色譜法和凝集素親和色譜法。

1.1 離子交換色譜法

離子交換色譜法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)相結(jié)合，通過固定相上可電離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交換而達(dá)到分離的目的，主要用于分離離子或可解離化合物[18]。Braga等[19]將掌葉蘋婆種子純化組分用0.025 mol/L Tris-HCL緩沖液洗脫，將500 μL樣品裝樣到離子交換柱上進(jìn)行純化，對純化后的凝集素進(jìn)行檢測，其分子量為17 kDa，并對熱和酸穩(wěn)定，且有抗氧化活性、抗菌活性和低溶血性。Wang等[20]用DEAE-52 celloulus陰離子交換柱層析對大蒜糖蛋白進(jìn)行純化，用苯酚-硫酸法、凝膠滲透色譜法和SDS-PAGE電泳法對糖蛋白組分進(jìn)行檢測，證明糖蛋白是同一種糖蛋白且組分純度較高。Senthilkumar等[21]通過Q-Sepharose陰離子交換柱層析對綠色海藻進(jìn)行純化，用考馬斯亮藍(lán)染色（CBB）和碘酸雪夫氏染色（PAS）對SDS-PAGE電泳進(jìn)行染色，對純化得到的糖蛋白的化學(xué)成分、等電點(diǎn)、構(gòu)象、蛋白質(zhì)類型、抗癌活性進(jìn)行分析，表明經(jīng)純化得到了一種新型的糖蛋白。

1.2 凝膠色譜法

凝膠色譜的分離機(jī)理類似于分子篩效應(yīng)，按照分子尺寸與凝膠孔徑大小之間的相對關(guān)系來進(jìn)行分離，溶質(zhì)流出凝膠的速率取決于分子的大小和凝膠的阻礙作用。Su等[22]對黃海馬糖蛋白（HG）進(jìn)行純化，將經(jīng)過DEAE-52陰離子交換柱層析純化得到的兩個組分HG-1和HG-2，用Sephadex G-100凝膠柱層析進(jìn)行進(jìn)一步純化，進(jìn)一步純化后的HG-1和HG-2組分分別在20 min～115 min和15 min～75 min檢測發(fā)現(xiàn)為均一的糖蛋白組分，且糖含量分別為56.7975%和39.479%，蛋白質(zhì)含量分別為30.547 5%和51.747%。Dai等[23]對虎斑烏賊肌肉糖蛋白（SPMG）進(jìn)行純化，經(jīng)DEAE-52陰離子交換柱層析純化得到了兩個組分SPMG-A和SPMG-B，SPMG-A組分糖蛋白含量較少且難收集，將SPMG-B組分作為主要的研究對象，用Sephadex G-100凝膠柱層析對SPMG-B進(jìn)行進(jìn)一步的純化，得到兩個均一的糖蛋白組分SPMG-Ⅰ和SPMG-Ⅱ。Yang等[24]對銀杏核糖蛋白進(jìn)行純化，將經(jīng)過DEAE-52陰離子交換柱層析純化后分析得到的Ⅰ組分進(jìn)行Sephadex G-200凝膠柱層析純化，分析發(fā)現(xiàn)凝膠柱層析后的5組分是均一的銀杏核糖蛋白組分。

1.3 凝集素親和層析

凝集素親和層析是利用生物大分子所具有的專一親和力來進(jìn)行純化的技術(shù)。對于一些如酶、蛋白、抗體、核酸等生物大分子和帶電性質(zhì)相似，分子大小相近的糖鏈，親和色譜的選擇性最高。凝集素是一類蛋白質(zhì)或是糖蛋白[1]，由于凝集素能識別、結(jié)合特定單糖或糖鏈結(jié)構(gòu)的糖蛋白，因而凝集素親和層析是分離純化糖蛋白時最有效的工具[25]。常用的凝集素有伴刀豆凝集素（ConA）和麥胚凝集素（WGA）等，ConA能特異結(jié)合α-D-甘露糖基和α-D-葡萄糖基。不同糖蛋白的伴刀豆凝集素（ConA）和麥胚凝集素（WGA）的結(jié)合部位與雜環(huán)硼酸酯的反應(yīng)流程如圖1所示[26]，ConA能特異結(jié)合在C3、C4和C6有自由羥基的糖蛋白的甘露糖和葡萄糖殘基上，硼酸共價結(jié)合甘露糖、半乳糖和葡萄糖，WGA能結(jié)合含有末端N-乙酰葡萄糖胺、唾液酸或者殼二糖的低聚糖。

圖1 不同N-糖鏈結(jié)構(gòu)的凝集素結(jié)合部位與雜環(huán)硼酸酯的反應(yīng)Fig.1 The binding motifs for the lectins of different N-glycan structures and the reaction scheme for the formation of the heterocyclic boronic acid diester

王艷等[27]在分離純化玉竹糖蛋白時，通過ConA親和層析，將經(jīng)Sephadex G-100凝膠過濾的粗糖蛋白進(jìn)一步純化，得到兩種糖蛋白PDG1和PDG3，其分子量分別為186 kD和28.3 kD，且具有一定抗氧化能力。Jana等[28]利用ConA親和層析分離純化出核糖核酸酶B及辣根過氧化物酶，用MALDI-MS對含有0.2 mol/L甲基-α-D-吡喃甘露糖苷溶液進(jìn)行洗脫的洗脫液和洗滌液進(jìn)行測定，結(jié)果證明糖蛋白純化效果很好。Lee等[29]用Con A-Sepharose 4B分離純化梔子花糖蛋白并進(jìn)行洗脫，得到分子量為27 kDa的糖蛋白。

2 膜分離法

膜分離作為一種新型的分離技術(shù)，具有收率高、耗能低的特點(diǎn)，還極少破壞被純化物質(zhì)的生物活性，適用于熱敏性物質(zhì)（多糖、蛋白質(zhì)等）等活性物質(zhì)的分離純化[30]，包括超濾、納濾等[31]。膜分離法在蛋白質(zhì)分離純化中的應(yīng)用較多，對于糖蛋白的分離純化應(yīng)用的還較少，膜分離法是根據(jù)膜的孔徑大小對不同分子量物質(zhì)進(jìn)行截留，但只能達(dá)到粗略地對糖蛋白進(jìn)行分級的目的，要想進(jìn)一步純化，還要結(jié)合色譜法或者電泳法。劉棟[32]在制備甘薯糖蛋白的過程中，將膜分離技術(shù)與Sephadex G-150結(jié)合使用，分離純化得到了兩種組分，并且具有抗突變和抗腫瘤活性。

超濾是利用膜的選擇性，將膜兩側(cè)的壓力差作為推動力，根據(jù)溶液中各個組分與孔徑大小之間的關(guān)系，導(dǎo)致通過膜的遷移速率不同，進(jìn)而實現(xiàn)分級分離[33-34]。超濾技術(shù)具有不會發(fā)生相變、耗能低、在常溫下可操作等特點(diǎn)。使用超濾對產(chǎn)品進(jìn)行純化，提高純度的同時，還可節(jié)約試劑的使用量，且由于分離純化的連續(xù)性，可以縮短生產(chǎn)的周期。任國艷等[35]采用多步分離純化，通過超濾濃縮、分級沉淀、陰離子交換柱層析和凝膠柱層析對海蜇頭糖蛋白分離純化后，得到組成均一的JGP-Ⅲ糖蛋白，其中既有O-糖肽鍵，又有N-糖肽鍵。

納濾與超濾相同，是利用膜兩側(cè)的能量差作為推動力，根據(jù)組分與孔徑大小間的關(guān)系實現(xiàn)分級分離[30，33]。納濾是介于反滲透和超濾之間的一種壓力驅(qū)動型膜分離技術(shù)，納濾膜的截留分子量為150 u～1 000 u[30]。納濾技術(shù)不需加熱，不發(fā)生相變，沒有化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生，不破壞生物活性，不改變風(fēng)味，節(jié)能，分離效率高，污染小，被廣泛地應(yīng)用于食品中的分離純化等過程[30]。

透析是利用小分子經(jīng)過半透膜擴(kuò)散到水溶液的原理，將小分子與生物大分子分開的一種分離純化技術(shù)，透析常用于除去小分子物質(zhì)。范勇等[36]將Sephadex G-100凝膠過濾柱層析和DEAE-52纖維素柱層析分離純化得到的兩種巨大型蒲公英糖蛋白組分，用透析法純化得到巨大型蒲公英小分子量糖蛋白。

3 電泳法

電泳是利用分子大小、形狀、負(fù)載電荷不同的糖蛋白在電場作用下遷移速率不同而達(dá)到分離的方法。常用的分離純化方法有凝膠電泳和毛細(xì)管電泳等。

在糖蛋白的研究中，與其它分離技術(shù)相比，凝膠電泳可以同時分離多個復(fù)雜混合物，凝膠電泳常用的有聚丙烯酰胺凝膠電泳和瓊脂糖凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳常用于蛋白質(zhì)的分離，無法分離大分子的糖蛋白；而瓊脂糖凝膠孔徑大，致使小分子糖蛋白直接透過，因此對小分子糖蛋白達(dá)不到篩選的效果或者效果不明顯，主要用于分離大分子的DNA。程玉祥[37]對茶樹葉糖蛋白進(jìn)行了純化研究，利用SDS-PAGE凝膠電泳和ConA-sapharose親和層析對茶樹葉糖蛋白進(jìn)行純化，對在SDS膠上快速純化的糖蛋白用被動擴(kuò)散的方式進(jìn)行回收，結(jié)果表明回收率為50%。

毛細(xì)管電泳是以毛細(xì)管為分離通道、以高壓電場為驅(qū)動力，依據(jù)樣品中各組分帶電粒子在毛細(xì)管溶液中遷移速度不同而實現(xiàn)分離的一類液相分離技術(shù)。毛細(xì)管電泳具有簡單、高效、快速、微量、易于自動化、一機(jī)多用和環(huán)境污染少等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于分離多種化合物。陳義[38]以聚丙烯酰胺涂層毛細(xì)管為分離通道對雞卵白蛋白分離出25個以上的峰，使轉(zhuǎn)鐵蛋白分離出10個左右的峰。目前，電泳多用于分離后的純度鑒定和分子量的確定。

4 展望

目前，糖蛋白分離純化的方法大多是沿用蛋白質(zhì)的方法，對于糖蛋白的分離純化應(yīng)用較多且較為成熟的還是凝膠色譜法和離子交換色譜法，凝集素親和色譜也時常用到。由于糖蛋白具有微觀不均一性，結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，致其測定較為困難，糖蛋白的分離純化與糖蛋白的結(jié)構(gòu)有著密不可分的關(guān)系，找到更好的分離純化糖蛋白的方法對于糖蛋白結(jié)構(gòu)的分析也有一定的幫助。糖蛋白的復(fù)雜性，可能致使使用單一的純化方法，不能達(dá)到理想的純化效果，在未來糖蛋白的分離純化中，可以從以下幾方面進(jìn)行：一是沿用現(xiàn)有較為成熟的色譜法之外，將目前的方法相結(jié)合，如將膜分離法與電泳法等結(jié)合使用；二是將更多分離純化蛋白質(zhì)或多糖的方法應(yīng)用在糖蛋白中，與分離純化糖蛋白的成熟方法相比較，以期找到更有效的分離純化方法，為糖蛋白的分離純化提供新思路，也為糖蛋白的進(jìn)一步研究提供良好的基礎(chǔ)。

[1]王冬宇,鄭喜群.Con A親和層析法在純化糖蛋白中的應(yīng)用[J].齊齊哈爾大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2016,32(5):46-49

[2]Rafiquzzaman S M,Kim E Y,Kima Y R,et al.Antioxidant activity of glycoprotein purified from Undaria pinnatifida measured by an in vitro digestion model[J].International Journal of Biological Macromolecules,2013,62:265-272

[3]Rafiquzzaman S M,Kim E Y,Lee J M,et al.Anti-Alzheimers and anti-inflammatory activities of a glycoprotein purified from edible brown alga Undaria pinnatifida[J].Food Research International,2015,77:118-124

[4]Hicks A E R,Nolan S L,Ridger V C,et al.Recombinant P-selectin glycoprotein ligand-1 directly inhibits leukocyte rolling by all 3 selectins in vivo:complete inhibition of rolling is not required for anti-inflammatory effect[J].Blood,2003,101(8):3249-3256

[5]Xia X J,Li G N,Zheng J,et al.Immune activity of swaleet potato(Ipomoeabatatas L.)glycoprotein after enzymatic and chemical modifications[J].Food&Function,2015,6:2026-2032

[6]Jun Y,Keiko M,Rebecca L S,et al．Altered sphingolipid metabolism induced by tumor hypoxia-new vistas in glycolipid tumor markers[J]．FEBS Letters,2010,584(9):1872-1878

[7 李婷婷.油茶籽糖蛋白的分離純化及其功能活性研究[D].無錫:江南大學(xué),2014

[8]Patel T,Bruce J,Merry A,et al.Use of hydrazine to release in intact and unreduced from both N-and O-linked oligosaccharides from glycoproteins[J].Biochemistry,1993,32(2):679-693

[9]White C A,Kennedy J F.Carbohydrate Analysis:A Practical Approach[M].Oxford:IRL,1986,37

[10]Misevic G N.Immunoblotting and immunoblinding of acidic polysaccharides separated by gel electrophoresis[J].Methods Enzymol,1989,179:95-104

[11]Pelkonen S,Finne J.Polyacrylamide gel electrophoresis of capsular polysaccharides of bacteria[J].Methods Enzymol,1989,179:104-110

[12]Cummings R D,Merkle R K,Stuits N L.Separation and analysis of glycoprotein oligosaccharides[J].Methods Cell Biol,1989,32:141-183

[13]Honda S,Suzuki S,Zaiki S,et al.Analysis of N-and O-glycosidically bound sialooligosaccharides in glycoproteins by high-performance liquid chromatography with pulsed amperometric detection[J].J Chromatoger,1990,523:189-200

[14]Townsend R R,Hardy M R,Lee Y C.Separation of oligosaccharides using high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection[J].Methods Enzymol,1989,179:65-76

[15]Yamashita K,Mizuochi T,Kobata A.Analysis od oligosaccharides by gel filtration[J].Methods Enzymol,1982,83:105-126

[16]Kakehi K,Ueda M,Suzuki S,et al.Determination of hyalurnic acid by high-performance liquid chromatography of the oligosaccharides derived therefrom as 1-(4-methoxy)phenyl-3-methyl-5-pyrazolone derivatives[J].J Chromatoger,1993,630(1/2):141-146

[17]Taverna M,Baillet A,Boiu D,et al.Analysis of carbohydrate-mediated heterogeneity and characterization of N-linkd oligosaccharides of glycoproteins by high performance capillary electrophoresis[J].Electrophoresis,1992,13(6):359-366

[18]Wang X C,Liang S P.Chromatographic behavior and purification of synthetic Hawentoxin I.Chinese[J].Chromatogr,2001,19(2):101-104

[19]Braga A A,Lacerda R R V,Medeiros G K V D V,et al.Antibacterial and Hemolytic Activity of a new Lectin Purified from the Seeds of Sterculia Foetida L.[J].Applied Biochemistry and Biotechnology,2015,175:1689-1699

[20]Wang Y,Zou T T,Xiang M H,et al.Purification and characterization of a soluble glycoprotein from garlic(allium sativum)and its in vitro bioactivity[J].Preparative Biochemistry and Biotechnology,2016,46(7):709-716

[21]Senthilkumar D,Jayanthi S.Partial characterization and anticancer act ivities of purified glycoprotein extracted from green seaweed Codium decorticatum[J].Journal of Functional Foods,2016,25:323-332

[22]Su Y T,Xu Y J.Study on the extraction and purification of glycoprotein from the yellow seahorse,Hippocampus kuda Bleeker[J].Food Science&Nutrition,2015,3(4):302-312

[23]Dai H J,Sun Y L,Zheng X L,et al.Extraction Optimization,Preliminary Characterization and Antioxidant Activity of Glycoproteins from the Muscle of Sepia pharaonis[J].Food Science and Technology Research,2016,22(1):39-52

[24]Yang J T,Wu C E,Li Y Y,et al.Identification and Purification of an Allergic Glycoprotein from Ginkgo biloba Kernel[J].Agricultural Sciences in China,2011,10(4):631-641

[25]丁璇子,王岸娜,吳立根,等.糖蛋白結(jié)構(gòu)鑒定研究現(xiàn)狀[J].糧食與油脂,2015,28(7):9-13

[26]Katrin Sparbier,Thomas Wenzel,Markus Kostrzewa.Exploring the binding profiles of ConA,boronic acid and WGA by MALDI-TOF/TOF MS and magnetic particles[J].Journal of Chromatography B,2006,840:29-36

[27]王艷,胡一鴻,陳秋志,等.玉竹糖蛋白分離純化及其體外抗氧化能力[J].食品科學(xué),2015,36(2):52-56

[28]Krenkova J,Cesla P,Foret F.Macroporous cryogel based spin column with immobilized concanavalin A for isolation of glycoproteins[J].2015,36(11-12):1344-1348

[29]Lee J,Lim K T.Inhibitory effect of plant-originated glycoprotein(27 kDa)on expression of matrix metalloproteinase-9 in cadmium chloride-inducedBNLCL.2cells[J].JournalofTraceElementsinMedicine and Biology,2011,25(4):239-246

[30]張艷,杜先鋒.膜技術(shù)分離純化茶多糖的工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2015,42(1):12-17

[31]Jiao B,Cassano A,Drioli E.Recent advances on membrane processes for the concentration of fruit juices:a review[J].Journal of Food Engineering,2004,63:303-324

[32]劉棟.甘薯功能性成份研究[D].揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué),2004

[33]葉燕軍,陳俊,翁武銀.超濾膜分離鮑魚內(nèi)臟酶解物及其體外抗氧化活性的研究[J].現(xiàn)代食品科技,2015,31(5):130-136,284

[34]王元秀,蔣竹青,李萍,等.生物活性肽分離純化技術(shù)研究進(jìn)展[J].濟(jì)南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2014,28(5):321-325

[35]任國艷,李八方,侯玉澤,等.海蜇頭糖蛋白基本組成及結(jié)構(gòu)[J].食品研究與研發(fā),2009,30(7):121-125

[36]范勇,李寶寶,毛葦,等.巨大型蒲公英小分子量糖蛋白的制備及抗氧化活性分析[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報,2015,46(3):486-491

[37]程玉祥.茶樹葉糖蛋白的純化研究[D].合肥:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué),2002

[38]陳義.糖蛋白微觀不均一組分的毛細(xì)管電泳分離[J].中國科學(xué)(B輯),1998,28(1):78-84

Progress on the Purification of the Food-derived Glycoproteins

ZHAO Wen-zhu1，ZHANG Hong-ling1，CHEN Yue-jiao1，YU Zhi-peng1，*，ZHANG Rui-xue1，LIU Jing-bo2，LI Jian-rong1，*
（1.College of Food Science and Engineering，Bohai University，National&Local Joint Engineering Research Center of Storage Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products，Jinzhou 121013，Liaoning，China；2.Lab of Nutrition and Functional Food，Jilin University，Changchun 130062，Jilin，China）

2017-02-25

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.20.040

國家自然科學(xué)基金項目（31601479）；渤海大學(xué)博士啟動項目（0515bs020）

趙文竹（1986—），女（漢），講師，博士，研究方向：植物活性成分研究。

*通信作者：于志鵬（1984—），男，講師，博士，研究方向：蛋白質(zhì)及活性肽；勵建榮（1964—），男，教授，博士，研究方向：水產(chǎn)品加工。