流動注射熒光法測定植物油中脂肪醛

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(1.新疆維吾爾自治區產品質量監督檢驗研究院,新疆烏魯木齊 830001;2.濟寧醫學院藥學院,山東日照 276800；3.中國科學院蘭州化學物理研究所,甘肅蘭州 730000)

流動注射熒光法測定植物油中脂肪醛

龍澤榮1,王利濤2,劉莉1,趙建勇1,鹿毅1,*,趙亮3,董樹清3,李輝3

(1.新疆維吾爾自治區產品質量監督檢驗研究院,新疆烏魯木齊830001;2.濟寧醫學院藥學院,山東日照276800；3.中國科學院蘭州化學物理研究所,甘肅蘭州730000)

建立了流動注射熒光法測定食用植物油中脂肪醛化合物的方法。利用2-萘肼和脂肪醛化合物在酸催化作用下生成在400 nm波長處有強熒光發射的2-萘腙化合物的原理,在自制的流動注射分析儀中,以混合醛(甲醛、乙醛、正丙醛、正丁醛、正戊醛、正己醛、正庚醛、正辛醛、正壬醛)為標準物質,對催化劑、溫度、時間、溶劑、2-萘肼的濃度和載流流速進行了條件優化,確定了最佳的流動注射熒光法檢測食用植物油中脂肪醛化合物的方法。在該優化條件下,脂肪醛化合物測定的線性工作曲線為y=26.8x+42,相關系數0.997;該方法的相對標準偏差(RSD)在1.18%～1.89%之間,回收率在92%～113%之間,最低檢出限為0.02 mmol/L(S/N=3)。因此,流動注射化學發光法具有方法簡單、檢測快速、數據準確等特點,可用于實際食用油樣品中醛類物質的在線快速檢測。

流動注射分析,熒光法,食用植物油,脂肪醛化合物

Abstract:A flow injection spectrophotometry method for the determination of aldehydes content in vegetable oil was built. The standard substance was adopted by mixed equal-molar nine aldehydes(formaldehyde,acetaldehyde,n-propanal,n-butanal,n-pentanal,n-hexaldehyde,n-heptaldehyde,n-octanal and n-nonanal). The optimal condition for aldehydes determination was obtained by adjusting catalysts,temperature,time,solvents,flow rate,and dosage of reagent,which was suitable to the reaction of aldehydes and 2-naphthylhydrazine to produce the 2-naphthalene hydrazone derivatives under the acid action by self-made flow injection equipment with strong fluorescence-emission at 400 nm. As a result,the linear equation of aliphatic aldehydes was y=26.8x+42(r=0.997),with 1.18%～1.89% of relative standard deviation(RSD)and 92%～113% of recovery rate. The limit of detection(LOD)for this method was 0.02 mmol/L(S/N=3). The method can be applied successfully to the determination of aliphatic aldehydes in plant oils with much simple way,high speed and accuracy.

Keywords:flow injection analysis;fluorescence method;edible plant oils;aliphatic aldehydes

食用油在高溫烹飪或者地溝油精煉過程中脂肪酸酯會發生不同程度的降解,其主要降解產物有脂肪醛或酮等多種極性化合物[1-3]。現有的檢測技術如高效液相色譜法[4-5]、熒光光譜法[6]、原子吸收光譜法[7]、離子色譜法[8]以及固相萃取結合GC-MS法[9]等均可用于食用油中脂肪醛的檢測。趙亮等[4-5]提出了脂肪醛或酮可作為鑒別偽劣食用油的特征指標,通過高效液相色譜成功實現了合格食用油和精煉地溝油的鑒別。肖瑩等[10]通過柱前衍生化-高效液相色譜法發現精制地溝油中的甲醛和乙醛的含量均顯著增加。迄今報道的檢測食用油中脂肪醛的方法均需要借助于昂貴的儀器與復雜的前處理過程,導致檢測耗時長、檢測成本高以及不能實現現場檢測等諸多缺點。流動注射分析技術是一種自動快速的化學分析技術,具有操作簡便、快速、靈敏以及可實現在線監測等諸多優點[11-12],被廣泛應用于大氣、土壤和食品中的痕量金屬離子[13]、陰離子[14-15]、生物分子[16]和致癌物質的檢測[17]。趙小青[18]采用5,5′-二甲基-1,3-環己二酮與甲醛可生成強熒光衍生物,流動注射分析食品和飲料樣品中的甲醛,但這一技術對油脂中單一或混合脂肪醛的檢測研究幾乎還是空白。

本文利用2-萘肼與脂肪醛類化合物在酸作用下發生高度特異性化學反應生成具有強烈熒光萘腙衍生物的原理,建立流動注射熒光法檢測食用植物油中脂肪醛化合物的分析方法,在實際食用油樣品中進行測試。將化學發光分析與流動注射分析技術相結合,與現有的檢測方法相比,該法具有操作簡便、檢測快速和準確的特點,在食用油油品質量控制方面具有極高的實用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醛、乙醛、正丙醛、正丁醛、正戊醛、正己醛、正庚醛、正辛醛、正壬醛、乙醇、硫酸、鹽酸、冰醋酸、三氯乙酸、三氟乙酸 均為分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司;2-萘肼鹽酸鹽 購自百靈威科技試劑公司;乙腈 色譜純,購自山東禹王實業有限公司;食用植物油樣品:金利胡麻油、金龍魚一級菜籽油、金龍魚三級菜籽油、金龍魚一級大豆油和金龍魚調和油 超市購買;精煉地溝油樣品 實驗室制備。

自組裝流動分析儀如圖1所示；蠕動泵 中國雷弗流體科技有限公司;7725i手動進樣閥 美國羅丹尼公司;Waters-474熒光檢測器 美國沃特斯,其附件包括:20 μL定量環和反應管(φ=0.7 mm,長度為0.5 m,材質為聚四氟乙烯管);恒溫水浴槽 鄭州市亞榮儀器有限公司;電子分析天平 德國賽多利斯公司。

圖1 流動注射化學發光分析測定醛類化合物工作流程示意圖Fig.1 Schematic diagram of flow injection chemiluminiscence to measure aldehydes注:1.蠕動泵，控制流速,以mL/min計;2.進樣閥;3.反應管,0.5 m;4.熒光檢測器。

1.2 實驗方法

1.2.1 配制標準溶液 取0.1 mmol三氯乙酸于10 mL容量瓶中,乙腈定容配成10 mmol/L三氯乙酸標準溶液;取0.1 mmol 2-萘肼鹽酸鹽溶于10 mL乙腈,再取1 mL溶液于10 mL容量瓶中,乙腈定容配成2 mmol/L萘肼標準溶液;分別取0.1 mmol的甲醛、乙醛、正丙醛、正丁醛、正戊醛、正己醛、正庚醛、正辛醛和正壬醛溶于5 mL乙腈,再取1 mL溶液于10 mL容量瓶中,乙腈定容配成2 mmol/L混合醛標準溶液;取2 mmol/L混合醛標準溶液,分別配制成0.05、0.10、0.15、0.20、0.30 mmol/L標準溶液,4 ℃冰箱中儲存。

1.2.2 供試樣品的制備 取5 mL乙腈于試管中,再加入5 mL食用油,搖勻,靜置5 min分層,由于乙腈與食用油不互溶,上層清液即為食用油的乙腈萃取液;取0.25 mL萃取液于試管中,再加入0.5 mL三氯乙酸溶液(10 mmol/L),加入0.5 mL 2-萘肼溶液(2 mmol/L),再加入0.75 mL乙腈使總體積為2 mL,搖勻,即為反應前供試樣品的待測溶液;在水浴槽中60 ℃加熱10 min,反應完成后,冷卻10 min,即為反應后供試樣品的待測溶液。

1.2.3 樣品測定條件的單因素實驗 初步確定了測定條件,分別以單個因素作為變量,考察反應前后電壓峰值的變化,從而得出最佳的流動注射測定條件。流動相為乙腈,蠕動泵的流速為1 mL/min,激發波長為350 nm,發射波長為400 nm,進樣量20 μL,恒溫水浴的溫度為60 ℃。同樣在保持萘肼濃度為0.5 mmol/L,三氯乙酸的濃度為0.5 mmol/L,混合醛濃度為0.2 mmol/L,反應時間為10 min。在蠕動泵的作用下，分別將反應前和反應后供試樣品的待測溶液，通過進樣針注入進樣閥，通過熒光檢測器，測得萘肼反應前和反應后熒光強度的變化(反應前后熒光的變化即為實際參與反應的醛化合物與萘肼生成萘腙的熒光增強)，通過標準工作曲線，即可測得脂肪醛類化合物的含量。其單因素考察的條件如下:

1.2.3.1 酸催化劑的選擇 分別以硫酸、鹽酸、醋酸、三氯乙酸、三氟乙酸為反應催化劑,濃度均為0.5 mmol/L,其它條件保持不變,考察反應前后峰值的變化。

1.2.3.2 反應溫度的選擇 分別以10 ℃為間隔,在40、50、60、70和80 ℃,其它條件保持不變,考察反應前后峰值的變化。

1.2.3.3 反應時間的選擇 反應時間分別為3、6、10、15、20 min,其它條件保持不變,考察反應前后峰值的變化。

1.2.3.4 反應溶劑的選擇 分別在甲醇、乙醇、異丙醇和乙腈中,其它條件保持不變,考察反應前后峰值的變化。

1.2.3.5 萘肼濃度的選擇 萘肼的濃度分別為0.12、0.25、0.35、0.50、1.0 mmol/L,其它條件保持不變,考察反應產物前后峰值的變化。

1.2.3.6 三氯乙酸濃度的選擇 三氯乙酸的濃度分別為0.05、0.25、0.50、1.5、5.0 mmol/L,其它條件保持不變,考察反應前后峰值的變化。

1.2.3.7 流速的選擇 流速分別為0.50、0.75、1.0、1.25、1.5 mL/min,其它條件保持不變,考察反應前后峰值的變化。

1.2.4 體系方法評價

1.2.4.1 線性范圍及檢出限 按1.2.3確定的條件,利用流動注射方法獲得了測定混合醛標準工作曲線的線性方程。

1.2.4.2 方法精密度 取混合醛溶液的濃度分別為0.15、0.3 和0.5 mmol/L,按1.2.3確定的條件,分別測定8次,計算混合醛的平均相對標準偏差。

1.2.4.3 方法準確度 采用1.2.2的方法,將2份金龍魚一級大豆油的待測樣品用乙腈稀釋10倍,混合醛的加標濃度分別為0.10、0.15和0.20 mmol/L。以建立的流動注射熒光法進行測定,計算混合醛的平均加標回收率。

1.3 數據處理

本實驗所有樣品除特別注明外,均重復3次測試,實驗結果為三次測定結果的平均值。儀器信噪比(S/N)的3倍確定為脂肪醛物質的最低檢出限。

2 結果與分析

2.1 流動注射條件的選擇

食用植物油中可能含有甲醛、乙醛、正丙醛、正丁醛、正戊醛、正己醛等多種脂肪醛,其食用油質量的好與壞,與這些小分子脂肪醛的含量密切相關[4]。本文通過單因素實驗,得到了流動注射化學發光法檢測脂肪醛類化合物的方法。

2.1.1 酸性催化劑的選擇 考察萘肼與混合醛反應過程中酸的催化效率。如圖2所示,三氯乙酸得到的產物峰值最大,與其他酸比較,三氯乙酸的加入,有利于促進萘肼和脂肪醛化合物的化學反應。

圖2 流動注射酸性催化劑的選擇Fig.2 The conversion of aliphatic aldehydes under different acidic catalysts by using flow injection

2.1.2 反應溫度的選擇 萘肼與脂肪醛類化合物反應是吸熱反應,為提高該反應速度,本實驗通過升高溫度來促進萘肼與脂肪醛的反應速度。反應后產物峰值變化如圖3所示：從40 ℃升至50 ℃時,峰值沒有提升;從50 ℃升高到60 ℃時,峰值迅速提高,60 ℃達到峰值;繼續升高溫度,反應的產率迅速降低,表明在高溫條件下生成的產物可能又發生了分解。綜合以上因素,確定本實驗最佳反應溫度為60 ℃。

圖3 流動注射反應溫度的選擇Fig.3 The conversion of aliphatic aldehydes under different reaction temperature by using flow injection

2.1.3 反應時間的選擇 萘肼與脂肪醛化合物需要在一定溫度和時間內完成化學反應,反應時間也是影響醛類物質與萘肼之間反應主要因素之一。本文分別考察了不同反應時間對反應過程的影響。如圖4所示,在3～10 min時間段內,隨著反應時間的延長,反應產物峰值達到了最高;而延長反應時間,其產物峰值又快速的下降。推測可能是由于反應時間的延長,發生了一些副反應,導致了峰值的降低。綜合以上因素,本實驗選擇確定了最佳反應時間為10 min。

圖4 流動注射反應時間的選擇Fig.4 The conversion of aliphatic aldehydes at different reaction time by using flow injection

2.1.4 反應溶劑的選擇 萘肼與脂肪醛化合物反應,除了受到溫度和反應時間的影響之外,其發生反應所需要的溶劑也是影響反應主要因素之一。在保持上述條件下,本實驗分別考察了不同反應溶劑對反應過程的影響。如圖5所示,在甲醇、乙醇和異丙醇中該反應峰值的變化很小,表明質子性溶劑的溶劑化效應抑制了萘肼與醛的反應;而在乙腈溶劑中,反應前后的峰值變化最大,可能是由于非質子性的乙腈溶劑促進了萘肼與醛的縮合反應,本實驗選用的載流試劑為乙腈。

圖5 流動注射條件下反應溶劑的選擇Fig.5 The conversion of aliphatic aldehydes under different reaction solvents by using flow injection

2.1.5 萘肼濃度、三氯乙酸濃度和流速的選擇 通過以上反應條件的優化,確定了萘肼與脂肪醛化合物反應所用的催化劑、反應溫度和反應時間。但是所用萘肼、脂肪醛化合物和三氯乙酸試劑的量和流動注射的流速,需要進一步的實驗。本文分別將萘肼、三氯乙酸和流速作為單因素考察的對象,實驗結果如圖6和圖7所示。當萘肼和三氯乙酸的濃度分別為0.50 mmol/L時,達到了最大的峰值變化(如圖6),這也證實了萘肼和三氯乙酸是按照1∶1的摩爾比進行化學反應的;此外,流速的考察實驗結果如圖7所示,當載流試劑流速為1 mL/min,檢測得到的產物濃度信號最強,以此確定了最佳的流速。

圖6 流動注射試劑濃度的選擇Fig.6 The conversion of aliphatic aldehydes by using different reagent dose under flow injection

圖7 流動注射流速的選擇Fig.7 The conversion of aliphatic aldehydes under different flow rate by using flow injection

2.2 體系方法評價

2.2.1 線性范圍及檢出限 在最優化的條件下，利用流動注射方法獲得了測定混合醛標準工作曲線的線性方程為y=26.8x+ 42(式中y為峰高，x為混合醛摩爾濃度，mmol/L)，相關系數0.997，得出最低檢出限為0.02 mmol/L(S/N=3)。

2.2.2 方法精密度 取混合醛溶液的濃度分別為0.15、0.3和0.5 mmol/L，分別測定8次，其平均相對標準偏差分別為1.41%、1.18%和1.89%，表明該流動注射化學發光儀器檢測脂肪醛化合物的精密度方法良好。

2.2.3 方法準確度 采用1.2.3的方法，將2份金龍魚一級大豆油的待測樣品用乙腈稀釋10倍，混合醛的加標濃度分別為0.10、0.15和0.20 mmol/L。以建立的流動注射熒光法進行測定，其平均加標回收率分別為92%、113%和103%，表明實驗方法的準確度很好，符合食用油中脂肪醛化合物的檢測要求。

2.3 實際樣品測定

圖8 流動注射熒光法測定脂肪醛化合物Fig.8 The determination of aliphatic aldehydes in different edible oil samples by using flow injection

采用前方建立方法對混合醛標準物質、市購的菜籽油和自制的精煉地溝油分別進行了脂肪醛化合物含量的分析測定,結果如圖8所示。結果表明各樣品均顯示了極好的響應信號,并且所有樣品在0.2 min內就完成了脂肪醛含量測定,充分發揮了流動注射化學發光法快速檢測的特點。接著采用本文建立的測試方法,分別對市購的5種植物油樣品進行測定,結果見表1。與其他植物油相比,調和油中的脂肪醛含量較高,達到4.41 mmol/L;胡麻油中脂肪醛化合物的含量最低為0.94 mmol/L;一級大豆油和一級菜籽油中脂肪醛的含量相對較低,含量分別為1.92、1.84 mmol/L,而三級菜籽油的含量達到了3.93 mmol/L;由此可以看出,食用植物油品的質量越高,脂肪醛的含量相對較低。總體來看,食用油中醛的含量在0.94～4.41 mmol/L之間,而精煉地溝油中的脂肪醛化合物的含量最高,達到了27.85 mmol/L,其相對偏差為0.43%～1.21%。表明市場上流通的各種食用油中脂肪醛化合物的含量是遠遠低于精煉地溝油脂肪的含量,地溝油中脂肪醛的含量約為合格食用油樣品的6～30倍,通過油中脂肪醛的含量比較,可以明顯鑒別出地溝油。正常食用油中的脂肪醛化合物主要來自一些不飽和脂肪酸的脂質過氧化反應,因此食用油在制備、貯存過程中也會進行緩慢的脂質過氧化反應,產生少量的脂肪醛,因而也能夠被少量檢測到。而地溝油在精煉過程中,經過高溫加熱、酸洗會產生大量的脂肪醛物質,而后續脫色、脫臭等處理過程不能有效除去脂肪醛物質,因此地溝油中含有較大量的脂肪醛物質。本方法測定的合格食用植物油樣品的脂肪醛含量與文獻報道的結果基本一致[4,10]。

表1 不同油樣品中醛類物質的測定結果Table 1 Analysis results of aldehydes in edible oil samples

3 結論

食用油的成分非常復雜,其中的脂肪醛類物質難以快速的準確定量測定,本研究優化了流動注射的檢測條件,建立了食用植物油中脂肪醛化合物的流動注射快速測定方法。在優化條件下,流動注射熒光法測定脂肪醛化合物的標準工作曲線方程為y=26.8x+42,相關系數0.997,最低檢出限為0.02 mmol/L(S/N=3),相對偏差為1.18%～1.89%，回收率為92%～113%。本文建立的流動注射熒光法可用于在線快速檢測食用植物油中的脂肪醛化合物,操作簡便,靈敏度高,重復性好,為監管部門提供脂肪醛的檢測依據,有一定的推廣應用價值。

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Determinationofaliphaticaldehydesinplantoils
byflowinjectionfluorescencemethod

LONGZe-rong1,WANGLi-tao2,LIULi1,ZHAOJian-yong1,LUYi1,*,ZHAOLiang3,DONGShu-qing3,LIHui3

(1.Xinjiang Uugur Autonomous Region Product Quality Supervision and Inspection Institute,Urumqi 830001,China;2.College of Pharmacy,Jining Medical University,Rizhao 276800,China;3.Lanzhou Institute of Chemical Physics of the Chinese Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China)

TS227

A

1002-0306(2017)18-0275-05

2017-02-07

龍澤榮(1974-)，女， 博士，提高待遇高級工程師, 研究方向:食品質量與安全,E-mail:long8326rong@163.com。

*通訊作者:鹿毅(1966-)，男，大學本科，提高待遇高級工程師,研究方向:食品分析和精細化學,E-mail:luyi_xjzjy@163.com。

烏魯木齊市科技局重點項目(Y141320007)。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.052