藜麥麩皮總皂苷的提取純化工藝研究

,,,,2,*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山西晉中 030801;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,山西晉中 030801)

藜麥麩皮總皂苷的提取純化工藝研究

許效群1,趙文婷1,苗玲香1,霍乃蕊1,2,*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山西晉中030801;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,山西晉中030801)

采用溶劑回流提取法對(duì)藜麥麩皮中的總皂苷進(jìn)行提取,以響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。以吸附率和解析率為指標(biāo),篩選適合用于藜麥麩皮總皂苷純化的大孔吸附樹脂,并對(duì)純化工藝進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化獲得的提取工藝為:料液比1∶20.8,以72%乙醇在72 ℃提取147 min,皂苷得率可達(dá)到1.685%。經(jīng)過比較,D101大孔吸附樹脂的吸附率和解析率都高于HPD600、S-8和AB-8,故選其用作純化研究,結(jié)果表明上樣濃度為4 mg/mL,上樣液pH6,上樣流速為2 BV/h時(shí)吸附率最大;用90%乙醇,以2 BV/h的流速洗脫時(shí),解析率最大,經(jīng)濃縮和凍干所得的皂苷,其純度達(dá)到43.6%。該研究結(jié)果為藜麥麩皮的高值利用及藜麥總皂苷生物活性研究和開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

藜麥麩皮,總皂苷,大孔吸附樹脂,溶劑回流提取

Abstract:Solvent reflux method was used for saponins extraction and the responsive surface methodology was used to optimize the related parameters. Adsorption rate and desorption rate were used as indicators for screening of proper resin for saponins purification and determining of purification techniques. The obtained optimal extraction technique with a ratio(bran to 72% ethanol)of 1∶20.8,carried out at 72 ℃ for 147 min,and the obtaining rate of saponins reached 1.685%. Compared with HPD600,S-8 and AB-8,the resin D101 showed the highest absorption rate and the highest desorption rate,so it was used for later purification studies. The results suggested that the highest absorption rate for D101 was obtained with a sample concentration of 4 mg/mL,the loading sample was adjusted to pH6 and loading at a velocity of 2 BV/h. The highest desorption rate was obtained when elute with 90% ethanol at a speed of 2 BV/h. The desorption fraction was condensed and freezing dried,the purity of resulted saponins powder reached 43.6%. The above results will facilitate the high-value application of quinoa bran and the related research work of quinoa saponins.

Keywords:quinoa bran;total saponins;macroporous adsorption resin;solvent reflux extraction

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld.)原產(chǎn)南美洲安第斯山區(qū),是藜科的一種雙子葉植物,距今已有5000～7000年的種植歷史[1]。我國首先在西藏引種成功[2],2010年山西靜樂縣推廣種植獲得成功,目前藜麥種植也主要集中在這兩個(gè)地區(qū)。藜麥營養(yǎng)豐富全面[3-4]含有幾乎完美的蛋白質(zhì)氨基酸組合,特別是賴氨酸Lys和Met含量較高[4],Ca(874 mg/kg)、Fe(81 mg/kg)、Zn、Mn、Cu等礦質(zhì)營養(yǎng)以及不飽和脂肪酸、纖維素、維生素、類黃酮等多種有益成分的含量也遠(yuǎn)高于其他谷物,享有 “營養(yǎng)黃金”、“超級(jí)谷物”以及“未來食品”的美稱[5]。國外尤其是歐美國家對(duì)藜麥的營養(yǎng)價(jià)值、功能成分的提取及功效研究已很豐富[6-8],國內(nèi)對(duì)藜麥的研究起步很晚,CNKI以藜麥為關(guān)鍵詞檢索,2011～2016年相關(guān)文獻(xiàn)僅有38篇,2015年居多(26篇),且主要集中在藜麥引種、栽培、品種選育、種植等方面,僅有個(gè)別研究者對(duì)藜麥中的營養(yǎng)成分、礦物元素進(jìn)行了測(cè)定[9],功能性成分方面,主要集中在藜麥總黃酮的提取、純化和抗氧化活性研究[10-12],關(guān)于藜麥皂苷也僅見于測(cè)定方法的報(bào)道[13]。目前國產(chǎn)藜麥主要被加工成藜麥米或藜麥粉,副產(chǎn)品麩皮含有較高的皂苷,藜麥皂苷具有抗菌[6]、抗氧化[7]、抗病毒、抗癌等多種生物活性[8],為了有效利用藜麥麩皮這一寶貴資源,挖掘藜麥的特殊功能價(jià)值,本文探討對(duì)藜麥麩皮總皂苷的提取純化工藝,為藜麥麩皮開發(fā)利用和藜麥麩皮總皂苷深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藜麥麩皮 由山西稼祺農(nóng)業(yè)科技有限公司山西靜樂藜麥種植基地提供(白藜麥采用干法脫皮拋光工藝加工獲得麩皮);齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC>98%) 北京索萊寶科技有限公司;無水乙醇、甲醇、石油醚、冰乙酸、高氯酸、香草醛等 均為分析純;D101、AB-8、S-8、HPD600大孔吸附樹脂 為天津歐瑞生物科技有限公司產(chǎn)品。

RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-Ⅲ型循環(huán)水式真空泵 上海亞榮生化儀器廠;723可見分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司;HL-1恒流泵、HL-2BS數(shù)顯恒流泵 上海青浦滬西儀器廠;層析柱 上海華美實(shí)驗(yàn)儀器廠;JDG-0.2真空凍干實(shí)驗(yàn)機(jī) 北京化玻聯(lián)醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程 藜麥麩皮→烘干(60 ℃)→粉碎(過60目篩)→石油醚索氏提取器回流脫脂2 h→60 ℃烘干→取3.000 g置于250 mL圓底燒瓶→按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入乙醇→水浴鍋加熱回流(考察乙醇濃度、料液比、溫度、時(shí)間對(duì)總皂苷提取得率的影響)→過濾→濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮成浸膏(轉(zhuǎn)速80 r/min,溫度60 ℃,真空度0.08 MPa)→真空冷凍干燥(冷阱溫度-45 ℃,干燥溫度50 ℃,真空度80 Pa)→總皂苷粗提物。

1.2.2 總皂苷測(cè)定 香草醛-高氯酸法:將待測(cè)液(0～1 mL)在10 mL試管中70 ℃水浴揮干,依次加入5%的香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL,試管加塞搖勻后60 ℃水浴加熱15 min,顯色后冰水冷卻5 min,加5 mL冰乙酸稀釋搖勻、靜置30 min,546 nm處測(cè)吸光值,測(cè)定時(shí)以甲醇等量替代待測(cè)液作空白[14]。

分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1 mg/mL,甲醇為溶劑)作為待測(cè)液,每組3個(gè)平行,按上述步驟進(jìn)行操作,以吸光度(A)為縱坐標(biāo),齊墩果酸濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并建立如下回歸方程A=52.746c-0.0077(R2=0.9996)。據(jù)此方程,可求出樣品吸光值A(chǔ)所對(duì)應(yīng)的濃度c(mg/mL),從而求出總皂苷含量。

1.2.3 提取得率測(cè)定 將粗提物用20 mL蒸餾水溶解,加等體積的水飽和正丁醇萃取3次,合并正丁醇相并旋轉(zhuǎn)蒸干,用甲醇溶解并定容于50 mL容量瓶中即得樣品液。取0.05 mL樣品溶液作為待測(cè)液,按照1.2.2的方法測(cè)定吸光值,計(jì)算皂苷濃度,利用以下公式計(jì)算藜麥麩皮總皂苷提取得率。

總皂苷提取得率(%)=c×V×120/(M×1000)×100

式中,c表示樣品液中皂苷的濃度(mg/mL);V為樣品液總體積;120為樣品液測(cè)定時(shí)的稀釋倍數(shù);M為藜麥麩皮的質(zhì)量(3.000 g)。

1.2.4 提取條件優(yōu)化

1.2.4.1 單因素實(shí)驗(yàn) 取6份3.000 g脫脂處理后的藜麥麩皮,按照1.2.1方法提取粗提物并計(jì)算提取得率,研究各個(gè)提取條件對(duì)藜麥麩皮總皂苷提取得率的影響。各因素取值分別為:乙醇濃度40%、50%、60%、70%、80%、90%;提取溫度40、50、60、70、80、90 ℃;提取時(shí)間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3;料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30。除變量外,其他各因素的固定條件分別為:乙醇濃度70%、料液比為1∶15(即45 mL)、提取溫度為60 ℃、回流提取2 h。

1.2.4.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,應(yīng)用Box-Behnken模型的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,進(jìn)行四因素三水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),因素水平見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels table

1.2.5 純化方法優(yōu)化

1.2.5.1 大孔吸附樹脂的選擇 稱取D101、AB-8、S-8、HPD600大孔吸附樹脂各2 g,分別加入50 mL上樣液(2.92 mg/mL),于25 ℃、120 r/min的恒溫振蕩水浴鍋中振蕩24 h,使其充分吸附飽和,過濾,用少量蒸餾水沖洗樹脂濾餅。洗液與濾液混勻計(jì)量其體積,并測(cè)定計(jì)算其中的總皂苷質(zhì)量M1(mg)和各種樹脂的吸附率。

吸附率(%)=(M0-M1)/M0×100

式中,M0為吸附前溶液中總皂苷的質(zhì)量(mg);M1為吸附后溶液中總皂苷的質(zhì)量(mg)。

將吸附了總皂苷的大孔吸附樹脂再裝入250 mL的具塞三角燒瓶中,加入70%乙醇,在25 ℃、120 r/min的恒溫振蕩水浴鍋中振蕩6 h,使其充分解吸達(dá)到平衡,過濾,用少量70%乙醇沖洗樹脂濾餅,與濾液混勻得解吸后溶液,記錄其體積,測(cè)定并計(jì)算解吸后溶液中總皂苷質(zhì)量M2(mg),計(jì)算各樹脂的解吸率,解吸率(%)=M2/(M0-M1)×100。

圖1 乙醇濃度、提取溫度、料液比以及提取時(shí)間對(duì)總皂苷得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration,tratio of solid to liquid,temperature and time on the acquiring rate of total saponins

1.2.5.2 各因素對(duì)吸附率的影響 將預(yù)處理好的D101大孔樹脂裝入洗凈的層析柱中(φ1.7 cm×20 cm),柱床體積約為30 mL,取2.92 mg/mL濃度的上樣液100 mL,調(diào)節(jié)pH分別至4、5、6、7、8,通過恒流泵將上樣流速控制在1.0 mL/min,收集過柱后樣液,測(cè)定其中皂苷的含量并計(jì)算吸附率,獲得較適上樣液pH。其他條件不變,上樣液pH7,確定上樣流速0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min(即為:1、2、3、4、5 BV/h)對(duì)吸附率的影響。同理配制濃度分別為2、3、4、5、6、7 mg/mL的上樣液(pH7.0),以1.0 mL/min的流速上柱,計(jì)算吸附率,得到較適上樣濃度。

1.2.5.3 洗脫流速和洗脫液濃度對(duì)解吸率的影響 按1.2.5.2獲得的較適上樣條件上樣90 mL,以90 mL 70%的乙醇洗脫,洗脫流速分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min,收集并測(cè)定解析液中的皂苷濃度,計(jì)算解吸率,獲得較適洗脫流速。以1.0 mL/min(2 BV/h)洗脫流速洗脫,乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%、90%,計(jì)算解吸率,獲得較適洗脫液濃度。

1.2.5.4 純度測(cè)定 按照優(yōu)化的純化工藝進(jìn)行純化,收集解析液,濃縮成浸膏并干燥為粉末,用甲醇溶解并定容,測(cè)定皂苷的含量,并計(jì)算純度,K(%)=(c×V)/m×100,式中,c皂苷濃度(mg/mL);V為樣品液體積(mL);m為皂苷粉質(zhì)量(mg)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design Expert 8.0和SigmaPlot 10.0進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、分析、制圖。所有實(shí)驗(yàn)三個(gè)平行,取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件優(yōu)化

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn) 由圖1可以看出,藜麥麩皮總皂苷得率在實(shí)驗(yàn)因素水平范圍內(nèi)隨著乙醇濃度、提取溫度的增高出現(xiàn)先增后減的變化規(guī)律。這可能與藜麥麩皮總皂苷的極性有關(guān),提取劑的極性由乙醇濃度決定,根據(jù)相似相容原理二者極性相似時(shí)提取效果最好;提取溫度的影響可從熱力學(xué)角度分析,增加反應(yīng)體系溫度,可加快皂苷分子向溶劑擴(kuò)散的速度,有利于浸出,但溫度過高時(shí)造成皂苷的氧化和熱敏性破壞。圖1顯示,料液比和提取時(shí)間對(duì)總皂苷得率的影響是先增高后維持在一定水平,這可能是由于增加溶劑可增大物料與溶劑接觸面,降低物料結(jié)構(gòu)內(nèi)外皂苷濃度差,當(dāng)料液比加大到一定程度時(shí),這種效應(yīng)逐漸消失;隨著時(shí)間的增加,皂苷不斷溶出,一段時(shí)間后已基本溶出,物料結(jié)構(gòu)內(nèi)外達(dá)到平衡。結(jié)果表明,達(dá)到相應(yīng)峰值時(shí)對(duì)應(yīng)的乙醇濃度為70%,料液比為1∶20、提取溫度為70 ℃、提取時(shí)間2.5 h。

2.1.2 Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 通過軟件Design Expert 8.05b對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析,得到藜麥麩皮總皂苷得率(Y)與X1、X2、X3、X4之間的二次多元回歸模型方程:Y=1.662+0.18417X1+0.0475X2+0.11X3+0.00166667X4-0.0675X1X2+0.02X1X3+0.075X1X4-0.0225X2X3-0.0025X2X4-0.0075X3X4-0.23475X12-0.03725X22-0.161X32-0.106X42。

表2 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

表3 響應(yīng)面方差分析表Table 3 Variance analysis of response surface methodology

基于二次回歸模型進(jìn)行兩因素響應(yīng)面及等高線繪圖,分析乙醇濃度(X1)與提取溫度(X2)二因素對(duì)總皂苷得率的影響和乙醇濃度(X1)與提取時(shí)間(X4)二因素對(duì)總皂苷得率的影響(圖2),圖中顯示,二因素均出現(xiàn)先增高后降低的變化趨勢(shì),二因素響應(yīng)曲面在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)出現(xiàn)凸面最高點(diǎn),說明存在最優(yōu)水平組合,且等高線圖呈橢圓形,長軸、短軸與坐標(biāo)軸明顯不平行,說明X1X2、X1X4交互相作用顯著。

圖2 各因素間交互影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.2 Responsive surfaces and contours between factors

2.1.3 最佳工藝條件的確定與驗(yàn)證 通過Design-Expert軟件對(duì)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,得出藜麥麩皮總皂苷提取的最佳工藝參數(shù)為:乙醇濃度71.5%、提取溫度71.5 ℃、料液比1∶20.75、時(shí)間2.45 h,總皂苷得率的預(yù)測(cè)值為1.699%。

考慮到實(shí)際操作情況,將工藝參數(shù)調(diào)整為乙醇濃度72%、提取溫度72 ℃、料液比1∶20.8、時(shí)間147 min,在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),重復(fù)三次取平均值得到藜麥麩皮總皂苷的得率為1.685%,RSD=0.82%,與軟件預(yù)測(cè)值很接近,說明所建立的響應(yīng)面模型對(duì)藜麥麩皮總皂苷提取工藝具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.2 藜麥麩皮總皂苷的純化

2.2.1 大孔吸附樹脂的篩選 表4列舉了四種不同型號(hào)樹脂的靜態(tài)吸附率和靜態(tài)解吸率,可知D101大孔吸附樹脂對(duì)藜麥麩皮總皂苷的吸附率和解析率均最大,故選擇此型號(hào)的樹脂用于純化研究。

表4 不同型號(hào)樹脂對(duì)皂苷的吸附率及解吸率Table 4 Adsorption and desorption rate of saponins of 4 types of resin

2.2.2 上樣液pH、濃度及上樣流速對(duì)吸附率的影響 由圖3可以看出,隨著樣液pH和上樣液濃度的增大,吸附率呈先上升后下降的趨勢(shì),在pH為6,上樣液濃度為4 mg/mL時(shí),吸附率最大。整體上吸附率隨著上樣流速的增大而逐漸降低。皂苷的吸附主要是從溶液中向樹脂表面擴(kuò)散并與樹脂空隙中的水分充分交換,這個(gè)過程需要一定的時(shí)間,如果流速過快,皂苷還來不及擴(kuò)散,就會(huì)發(fā)生泄漏,造成樣品的流失,因此必須保持一定的上樣流速才可以達(dá)到最佳效果,流速為0.5 mL/min和1.0 mL/min時(shí)吸附率變化并不大,但是流速太低,延長了操作時(shí)間,因此綜合考慮選擇1.0 mL/min(2 BV/h)的流速上樣較為適宜。

圖3 上樣液pH、濃度及上樣流速對(duì)D101大孔吸附樹脂吸附率的影響Fig.3 Effect of pH,saponin concentration and sample velocity on the adsorption rate of D101 resin

2.2.3 洗脫流速和洗脫液濃度對(duì)解吸率的影響 由圖4可以看出,大孔樹脂的解吸率隨著洗脫流速的增大逐漸降低,流速過快,洗脫性能差,導(dǎo)致洗脫不完全。流速在0.5～1.0 mL/min時(shí)解吸率變化很小,從實(shí)際情況出發(fā),流速太低,會(huì)延長操作時(shí)間,因此選擇1.0 mL/min(2 BV/h)為最佳洗脫流速。解吸率隨著乙醇濃度的增大而逐漸增加,選擇濃度為90%的乙醇作為洗脫液進(jìn)行洗脫。

圖4 洗脫流速和洗脫液濃度對(duì)解吸率的影響Fig.4 Effect of elution velocity and ionic strength on the desorption rate of saponin

2.2.4 純化效果 以D101大孔吸附樹脂純化藜麥麩皮總皂苷的粗提物,調(diào)節(jié)上樣液pH為6,上樣液中總皂苷濃度為4 mg/mL,上樣流速為2 BV/h,上樣完成后于洗脫前用蒸餾水洗去水溶性雜質(zhì),用90%的乙醇進(jìn)行洗脫,控制洗脫流速為2 BV/h,收集洗脫液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮成浸膏后真空干燥為粉末,測(cè)定皂苷純度。計(jì)算得出純化后皂苷的純度為43.6%,約為純化前皂苷純度的2.7倍。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化得到了藜麥麩皮總皂苷的溶劑回流法提取工藝:乙醇濃度72%、提取溫度72 ℃、料液比1∶20.8、時(shí)間147 min,在此條件下,皂苷得率達(dá)到1.685%。從HPD600、D101、S-8、AB-8 4種大孔吸附樹脂中篩選出適合于藜麥麩皮總皂苷純化的D101型樹脂,并對(duì)純化工藝進(jìn)行了優(yōu)化,確定了上樣濃度4 mg/mL、上樣pH6、上樣流速2 BV/h、洗脫液乙醇濃度90%、洗脫流速2 BV/h為較優(yōu)條件,所得總皂苷純度達(dá)到43.6%。上述提取純化工藝是在實(shí)驗(yàn)室條件下獲得,工業(yè)化應(yīng)用還有待進(jìn)行擴(kuò)大實(shí)驗(yàn),中試條件下如果能采用超聲波助溶,提取得率可能會(huì)進(jìn)一步提高,提取時(shí)間可能會(huì)進(jìn)一步縮短,另外,對(duì)麩皮的處理也很重要,比如采用纖維素酶處理、擠壓膨化處理、超微粉碎處理是否會(huì)進(jìn)一步提高提取率還有待于深入研究。

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Extractionandpurificationoftotalsaponinsfromquinoabran

XUXiao-qun1,ZHAOWen-ting1,MIAOLing-xiang1,HUONai-rui1,2,*

(1.College of Food Science & Engineering,Shanxi Agricultural University,Jinzhong 030801,China;2. College of Animal Science & Veterinary Medicine,Shanxi Agricultural University,Jinzhong 030801,China)

TS210.1

B

1002-0306(2017)18-0215-06

2017-02-27

許效群(1963-)，男，本科，副教授,研究方向：糧油加工，E-mail:13935447190@163.com。

*通訊作者:霍乃蕊(1972-)，女，博士，教授，研究方向：生物技術(shù)與食品安全，E-mail:tgnrhuo@163.com。

山西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(201603D21102)。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.041