乙?；蹦径嗵堑闹苽浼捌淇寡趸钚匝芯?/h1>
2017-10-16 04:22:21,,,
食品工業科技 2017年18期 關鍵詞：實驗
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(連云港師范高等?？茖W校生命科學系,江蘇連云港 222006)
乙?；蹦径嗵堑闹苽浼捌淇寡趸钚匝芯?/p>
馬波,朱建國,邵世光,王薇
(連云港師范高等?？茖W校生命科學系,江蘇連云港222006)
以辣木為原料,采用水提醇沉法制備辣木多糖。利用乙酸酐為乙酰化試劑,對辣木多糖進行乙?；揎?。通過單因素實驗和正交實驗,確定了辣木多糖乙酰化修飾的最佳工藝條件。在此基礎上,對乙酰化辣木多糖進行抗氧化性實驗。結果表明,制備乙酰化辣木多糖的最優實驗條件為反應時間6 h,反應溫度60 ℃,乙酸酐用量5 mL?？寡趸钚匝芯拷Y果顯示,辣木多糖乙酰化改性后清除羥自由基和超氧陰離子自由基的能力顯著增加。表明乙酰化修飾可顯著提高辣木多糖的抗氧化性。
辣木,多糖,乙?；?抗氧化
Abstract:TakingMoringaoleiferaas the material,the polysaccharides were obtained by water extraction and alcohol precipitation. The acetylatedMoringaoleiferapolysaccharide derivatives were prepared by using acetic anhydride as acetylating agent. The technical conditions of acetylated modification were optimized with single factor experiment and orthogonal experiments,and the antioxidant activity was studied at the same time. The results indicated that the preparation optimal acetylated conditions forMoringaoleiferapolysaccharides were as follows:reaction time 6 h,reaction temperature 60 ℃,acetylating reagent dosage 5 mL. The oxidation resistance research showed that the ability of removal hydroxyl free radicals and remove super oxide anion free radical ability were significantly enhanced. Acetylation could significantly improve the antioxidant activities ofMoringaoleifera.
Keywords:Moringaoleifera;polysaccharide;acetylated;antioxidant
辣木(Moringaoleifera)又稱鼓槌樹,是辣木科(Moringaceae)辣木屬(Moringa)熱帶落葉喬木。辣木含有豐富的氨基酸、維生素、礦物質等營養成分,具有抗氧化、降血壓、血糖和膽固醇、消炎抑菌作用,已被歐美國家視為新興的健康食品[1]。辣木多糖是辣木中重要的有效成分之一,有明顯抗氧化等生物活性等[2]。目前對于辣木多糖的研究主要局限于粗提物上[3-4],而對其進行衍生化方面的研究尚未見報道。
利用化學的方法對多糖的分子結構進行修飾,可能會使其具有一些新的理化性質或生物活性[5-6]。多糖的乙酰化是一種重要的多糖結構修飾方法。楊春瑜等對黑木耳多糖進行乙?；揎椇?其抗氧化活性增加[7]。李淑琴等研究發現，乙酰化烏龍茶多糖溶解性增強,多糖活性明顯升高[8]。劉瑩等研究表明,金針菇多糖經乙?；揎椇缶哂休^強的抗氧化活性[9]。本文對辣木多糖進行乙?；揎?并對其體外抗氧化活性進行比較,為拓寬辣木的應用范圍提供一定的理論依據。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
辣木葉 產于云南保山,購于云南滿澤生物科技有限公司;硫酸亞鐵、鄰苯三酚、乙醇、TCA(三氯乙酸)、甲酰胺、乙酸酐(含1%NBS)、水楊酸、過氧化氫、鹽酸等 均為國產分析純。
CPA225D分析天平 賽多利斯科學儀器北京有限公司;島津UV2550分光光度計 日本島津;30B型萬能粉碎機 無錫市中銀機械制造有限公司;LD5-10臺式離心機 北京醫用離心機廠;ALPHA1-4型真空冷凍干燥機 德國CHRIST公司;VERTEX 70紅外光譜儀 德國BRUKER。
1.2 實驗方法
1.2.1 辣木多糖的提取及純化 將辣木葉在70 ℃下干燥、粉碎后過60目篩,加20倍蒸餾水(w/w)于80 ℃水浴上提取2次,1.5 h/次,合并提取液。采用真空濃縮,濃縮至原體積的1/5,采用TCA法除蛋白后醇沉過夜,離心取沉淀干燥后研磨成粉末備用[10]。
1.2.2 辣木多糖的乙酰化 稱取0.2 g多糖溶解于8 mL甲酰胺中,加入一定量的乙酸酐(含1% NBS),恒溫攪拌反應。結束后用95%的乙醇沉淀,將沉淀溶于100～200 mL的蒸餾水中,透析8 h,95%乙醇沉淀過夜,離心取沉淀干燥即得乙?；蹦径嗵浅善穂7]。
1.2.3 抗氧化活性研究
1.2.3.1 羥基自由基(·OH)的清除率測定 取干凈的10 mL納氏比色管,依次向其中加入1 mL樣品液(對照以蒸餾水代替樣品液),1 mL的6 mmoL/L FeSO4,1 mL的6 mmoL/L水楊酸,最后加入1 mL的6 mmoL/L H2O2啟動反應,搖勻置于37 ℃水浴下反應1 h。在波長510 nm處測定吸光度。對照組吸光度值記為A0,樣品吸光度值記為AX。
羥基自由基的清除率(%)=[(A0-Ax)/A0]×100[11]
式中,A0:空白對照組的吸光度值;Ax:樣品溶液的吸光度值。
式中,A0:空白對照組的吸光度值;Ax:樣品溶液的吸光度值。
1.2.4 總糖及乙?；康臏y定 以D-葡萄糖為標準品,采用苯酚-硫酸法測定總糖含量[12];采用酸堿滴定法測定乙?；縖13],將20 g乙?；蹦径嗵羌尤氲?0 mL 0.01 mol/L NaOH溶液中,50 ℃加熱2 h。以酚酞作為指示劑,用0.01 mol/L HCl溶液滴定至紅色消失。
乙?；?%)=(V0C0- V1C1)×0.043×100/m
式中,V0:消耗NaOH溶液體積;C0:消耗的NaOH溶液濃度;V1:消耗的鹽酸溶液體積;C1:消耗的鹽酸溶液濃度;m:樣品質量。
1.2.5.1 乙酸酐用量對辣木多糖乙酰化的抗氧化活性影響 將0.2 g辣木多糖溶于8 mL甲酰胺中,分別加入1.5、3、5、7 mL的乙酸酐(含1% NBS),在60 ℃下分別反應2 h。反應結束后,分別測定不同濃度乙?；蹦径嗵堑目寡趸钚浴?/p>
1.2.5.2 反應溫度對辣木多糖乙?；目寡趸钚杂绊?將0.2 g辣木多糖溶于8 mL甲酰胺中,加入5 mL乙酸酐(含1% NBS),在40、60、80、100 ℃下,分別反應2 h。反應結束后,分別測定不同濃度乙?；蹦径嗵堑目寡趸钚?。
1.2.5.3 反應時間對辣木多糖乙酰化的抗氧化活性影響 將0.2 g辣木多糖溶于8 mL甲酰胺中,加入5 mL乙酸酐(含1% NBS),在60 ℃下分別反應2、4、6、8 h。反應結束后,分別測定不同濃度乙?；蹦径嗵堑目寡趸钚?。
1.2.6 辣木多糖乙?；に囌粌灮瘜嶒?根據單因素實驗結果,以時間(A)、溫度(B)、乙酸酐用量(C)為自變量,以羥自由基清除率為指標,進行正交實驗,同時測定實驗中每個樣品的總糖含量和乙?；?。因素水平表見表1。
表1 因素水平表Table 1 The factors and levels table
1.2.7 紅外光譜檢測 利用正交實驗得到的最優實驗方案,制備乙酰化辣木多糖。取10 mg左右的辣木多糖、乙?；蹦径嗵?用KBr研磨壓片后,在4000～500 cm-1范圍內進行掃描。
1.3 數據處理
采用SPSS數據處理軟件,對結果進行分析。
2 結果與分析
2.1 辣木多糖乙?；に噯我蛩貙嶒?/h3>
2.1.1 乙酸酐試劑用量對乙?；蹦径嗵堑目寡趸缘挠绊?如圖1(A、B)所示,乙?；蹦径嗵菍αu自由基和超氧陰離子自由基的清除能力均明顯高于辣木多糖。多糖的結構影響多糖的生物學活性[14],辣木多糖經乙?；揎椇?可能其空間構象發生變化,使其更易于提供羥基,從而有利于捕捉自由基,提高抗氧化活性[15]。隨乙酸酐用量的增加,乙酰化辣木多糖對羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除率逐漸升高,當乙酸酐試劑用量增加到5 mL時,升高趨勢趨于平緩。
圖1 乙酰化試劑用量對辣木多糖乙?；挠绊慒ig.1 Effect of acetylated reagent addition on the polysaccharide acetylated of Moringa oleifera
圖2 反應溫度對辣木多糖乙酰化的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on the polysaccharide acetylated of Moringa oleifera
2.1.2 反應溫度對乙酰化辣木多糖的抗氧化性的影響 如圖2(A、B)所示,隨著反應溫度的升高,多糖的抗氧化活性先增加后減弱,當溫度為60 ℃時,對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除率都達到最高。在較高的溫度條件下,多糖的活性可能受到破壞[16],導致羥自由基和超氧陰離子自由基的清除率降低。
2.1.3 反應時間對乙酰化辣木多糖的抗氧化性的影響 如圖3(A、B)所示,當反應時間在2～6 h,乙酰化辣木多糖對羥自由基清除率和超氧陰離子自由基的清除率均逐步增大,6 h時達到最大。隨著時間的進一步延長,抗氧化性開始下降,原因可能是反應時間過長導致多糖的結構改變,產生其他的副產物,引起抗氧化活性的下降[17]。
圖3 反應時間對辣木多糖乙?；挠绊慒ig.3 Effect of reaction time on the polysaccharide acetylated of Moringa oleifera
由圖1～圖3均可見,辣木多糖與乙?；蹦径嗵菍αu自由基和超氧陰離子自由基清除率均隨著質量濃度的增加而增加,呈一定的劑量關系。同時羥自由基和超氧陰離子自由基的清除率隨反應因素變化趨勢是一致的。因此在后續的實驗中,以羥自由基的清除率為指標來探索最適反應條件
2.2 辣木多糖乙?；铣晒に嚄l件優化
按照表1進行正交實驗,實驗結果見表2。
表2 正交實驗結果Table 2 Orthogonal experiment results
由極差分析結果可以看出,各因素作用主次順序排序如下:C>B>A,即乙酸酐用量影響最大,其次依次是溫度和時間。由K值可知最佳組合為A2B2C2,即乙酸酐5 mL,溫度為60 ℃時,時間6 h。此條件下羥自由基清除率最高,達99.7%,超氧陰離子自由基的清除率87.4%,略低于同濃度下VC的清除能力(99.8%)。
表3 不同實驗組樣品中總糖含量和乙?；?%)Table 3 The contents of total sugar and acetyl group of different test samples(%)
表3是上述不同實驗組樣品中總糖和乙?；?。由表3可知,隨著乙酰基含量的增大,羥自由基清除率上升。實驗結果說明在實驗范圍內乙?；颗c抗氧化正相關。乙?；娜〈恢?、空間構象等均影響生物活性[18],目前其構效關系和作用規律尚不清楚,仍有待深入探討。
2.3 辣木多糖與乙?；蹦径嗵堑募t外光譜分析結果
如圖4所示,與辣木多糖的IR譜圖相比,乙酰化的辣木多糖在1723 cm-1出現了C=O的雙鍵伸縮振動峰,1260 cm-1處有酯基C-O的伸縮振動,這表明樣品的乙酰化是成功的[19]。
圖4 辣木多糖和乙酰化辣木多糖的紅外譜圖Fig.4 IR spectrum of Moringa oleifera polysaccharide and acetylated Moringa oleifera polysaccharide
3 結論
采用乙酸酐對辣木多糖進行乙酰化修飾,并使用正交實驗得到了最適的反應條件,即反應時間6 h,反應溫度60 ℃,乙酸酐用量5 mL。經過乙?；揎椇蟮睦蹦径嗵菍αu自由基(99.7%)和超氧陰離子自由基(87.4%)清除能力均顯著提高,本研究表明乙?；揎椷m用于辣木多糖的結構改性,為其構效關系研究提供新的思路。
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PreparationandantioxidantactivityofacetylatedpolysaccharidefromMoringaoleifera
MABo,ZHUJian-guo,SHAOShi-guang,WANGWei
(Department of Life Sciences of Lianyungang Teacher’s College,Lianyungang 222006,China)
TS201.2
B
1002-0306(2017)18-0207-04
2017-02-23
馬波(1975-)，男，碩士,講師，研究方向：植物多糖的研究與開發，E-mail:mabo7512@163.com。
10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.039
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辣木,多糖,乙?；?抗氧化
Abstract:TakingMoringaoleiferaas the material,the polysaccharides were obtained by water extraction and alcohol precipitation. The acetylatedMoringaoleiferapolysaccharide derivatives were prepared by using acetic anhydride as acetylating agent. The technical conditions of acetylated modification were optimized with single factor experiment and orthogonal experiments,and the antioxidant activity was studied at the same time. The results indicated that the preparation optimal acetylated conditions forMoringaoleiferapolysaccharides were as follows:reaction time 6 h,reaction temperature 60 ℃,acetylating reagent dosage 5 mL. The oxidation resistance research showed that the ability of removal hydroxyl free radicals and remove super oxide anion free radical ability were significantly enhanced. Acetylation could significantly improve the antioxidant activities ofMoringaoleifera.
Keywords:Moringaoleifera;polysaccharide;acetylated;antioxidant
辣木(Moringaoleifera)又稱鼓槌樹,是辣木科(Moringaceae)辣木屬(Moringa)熱帶落葉喬木。辣木含有豐富的氨基酸、維生素、礦物質等營養成分,具有抗氧化、降血壓、血糖和膽固醇、消炎抑菌作用,已被歐美國家視為新興的健康食品[1]。辣木多糖是辣木中重要的有效成分之一,有明顯抗氧化等生物活性等[2]。目前對于辣木多糖的研究主要局限于粗提物上[3-4],而對其進行衍生化方面的研究尚未見報道。
利用化學的方法對多糖的分子結構進行修飾,可能會使其具有一些新的理化性質或生物活性[5-6]。多糖的乙酰化是一種重要的多糖結構修飾方法。楊春瑜等對黑木耳多糖進行乙?；揎椇?其抗氧化活性增加[7]。李淑琴等研究發現，乙酰化烏龍茶多糖溶解性增強,多糖活性明顯升高[8]。劉瑩等研究表明,金針菇多糖經乙?；揎椇缶哂休^強的抗氧化活性[9]。本文對辣木多糖進行乙?；揎?并對其體外抗氧化活性進行比較,為拓寬辣木的應用范圍提供一定的理論依據。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
辣木葉 產于云南保山,購于云南滿澤生物科技有限公司;硫酸亞鐵、鄰苯三酚、乙醇、TCA(三氯乙酸)、甲酰胺、乙酸酐(含1%NBS)、水楊酸、過氧化氫、鹽酸等 均為國產分析純。
CPA225D分析天平 賽多利斯科學儀器北京有限公司;島津UV2550分光光度計 日本島津;30B型萬能粉碎機 無錫市中銀機械制造有限公司;LD5-10臺式離心機 北京醫用離心機廠;ALPHA1-4型真空冷凍干燥機 德國CHRIST公司;VERTEX 70紅外光譜儀 德國BRUKER。
1.2 實驗方法
1.2.1 辣木多糖的提取及純化 將辣木葉在70 ℃下干燥、粉碎后過60目篩,加20倍蒸餾水(w/w)于80 ℃水浴上提取2次,1.5 h/次,合并提取液。采用真空濃縮,濃縮至原體積的1/5,采用TCA法除蛋白后醇沉過夜,離心取沉淀干燥后研磨成粉末備用[10]。
1.2.2 辣木多糖的乙酰化 稱取0.2 g多糖溶解于8 mL甲酰胺中,加入一定量的乙酸酐(含1% NBS),恒溫攪拌反應。結束后用95%的乙醇沉淀,將沉淀溶于100～200 mL的蒸餾水中,透析8 h,95%乙醇沉淀過夜,離心取沉淀干燥即得乙?；蹦径嗵浅善穂7]。
1.2.3 抗氧化活性研究
1.2.3.1 羥基自由基(·OH)的清除率測定 取干凈的10 mL納氏比色管,依次向其中加入1 mL樣品液(對照以蒸餾水代替樣品液),1 mL的6 mmoL/L FeSO4,1 mL的6 mmoL/L水楊酸,最后加入1 mL的6 mmoL/L H2O2啟動反應,搖勻置于37 ℃水浴下反應1 h。在波長510 nm處測定吸光度。對照組吸光度值記為A0,樣品吸光度值記為AX。
羥基自由基的清除率(%)=[(A0-Ax)/A0]×100[11]
式中,A0:空白對照組的吸光度值;Ax:樣品溶液的吸光度值。
式中,A0:空白對照組的吸光度值;Ax:樣品溶液的吸光度值。
1.2.4 總糖及乙?；康臏y定 以D-葡萄糖為標準品,采用苯酚-硫酸法測定總糖含量[12];采用酸堿滴定法測定乙?；縖13],將20 g乙?；蹦径嗵羌尤氲?0 mL 0.01 mol/L NaOH溶液中,50 ℃加熱2 h。以酚酞作為指示劑,用0.01 mol/L HCl溶液滴定至紅色消失。
乙?；?%)=(V0C0- V1C1)×0.043×100/m
式中,V0:消耗NaOH溶液體積;C0:消耗的NaOH溶液濃度;V1:消耗的鹽酸溶液體積;C1:消耗的鹽酸溶液濃度;m:樣品質量。
1.2.5.1 乙酸酐用量對辣木多糖乙酰化的抗氧化活性影響 將0.2 g辣木多糖溶于8 mL甲酰胺中,分別加入1.5、3、5、7 mL的乙酸酐(含1% NBS),在60 ℃下分別反應2 h。反應結束后,分別測定不同濃度乙?；蹦径嗵堑目寡趸钚浴?/p>
1.2.5.2 反應溫度對辣木多糖乙?；目寡趸钚杂绊?將0.2 g辣木多糖溶于8 mL甲酰胺中,加入5 mL乙酸酐(含1% NBS),在40、60、80、100 ℃下,分別反應2 h。反應結束后,分別測定不同濃度乙?；蹦径嗵堑目寡趸钚?。
1.2.5.3 反應時間對辣木多糖乙酰化的抗氧化活性影響 將0.2 g辣木多糖溶于8 mL甲酰胺中,加入5 mL乙酸酐(含1% NBS),在60 ℃下分別反應2、4、6、8 h。反應結束后,分別測定不同濃度乙?；蹦径嗵堑目寡趸钚?。
1.2.6 辣木多糖乙?；に囌粌灮瘜嶒?根據單因素實驗結果,以時間(A)、溫度(B)、乙酸酐用量(C)為自變量,以羥自由基清除率為指標,進行正交實驗,同時測定實驗中每個樣品的總糖含量和乙?；?。因素水平表見表1。
表1 因素水平表Table 1 The factors and levels table
1.2.7 紅外光譜檢測 利用正交實驗得到的最優實驗方案,制備乙酰化辣木多糖。取10 mg左右的辣木多糖、乙?；蹦径嗵?用KBr研磨壓片后,在4000～500 cm-1范圍內進行掃描。
1.3 數據處理
采用SPSS數據處理軟件,對結果進行分析。
2 結果與分析
2.1 辣木多糖乙?；に噯我蛩貙嶒?/h3>
2.1.1 乙酸酐試劑用量對乙?；蹦径嗵堑目寡趸缘挠绊?如圖1(A、B)所示,乙?；蹦径嗵菍αu自由基和超氧陰離子自由基的清除能力均明顯高于辣木多糖。多糖的結構影響多糖的生物學活性[14],辣木多糖經乙?；揎椇?可能其空間構象發生變化,使其更易于提供羥基,從而有利于捕捉自由基,提高抗氧化活性[15]。隨乙酸酐用量的增加,乙酰化辣木多糖對羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除率逐漸升高,當乙酸酐試劑用量增加到5 mL時,升高趨勢趨于平緩。
圖1 乙酰化試劑用量對辣木多糖乙?；挠绊慒ig.1 Effect of acetylated reagent addition on the polysaccharide acetylated of Moringa oleifera
圖2 反應溫度對辣木多糖乙酰化的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on the polysaccharide acetylated of Moringa oleifera
2.1.2 反應溫度對乙酰化辣木多糖的抗氧化性的影響 如圖2(A、B)所示,隨著反應溫度的升高,多糖的抗氧化活性先增加后減弱,當溫度為60 ℃時,對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除率都達到最高。在較高的溫度條件下,多糖的活性可能受到破壞[16],導致羥自由基和超氧陰離子自由基的清除率降低。
2.1.3 反應時間對乙酰化辣木多糖的抗氧化性的影響 如圖3(A、B)所示,當反應時間在2～6 h,乙酰化辣木多糖對羥自由基清除率和超氧陰離子自由基的清除率均逐步增大,6 h時達到最大。隨著時間的進一步延長,抗氧化性開始下降,原因可能是反應時間過長導致多糖的結構改變,產生其他的副產物,引起抗氧化活性的下降[17]。
圖3 反應時間對辣木多糖乙?；挠绊慒ig.3 Effect of reaction time on the polysaccharide acetylated of Moringa oleifera
由圖1～圖3均可見,辣木多糖與乙?；蹦径嗵菍αu自由基和超氧陰離子自由基清除率均隨著質量濃度的增加而增加,呈一定的劑量關系。同時羥自由基和超氧陰離子自由基的清除率隨反應因素變化趨勢是一致的。因此在后續的實驗中,以羥自由基的清除率為指標來探索最適反應條件
2.2 辣木多糖乙?；铣晒に嚄l件優化
按照表1進行正交實驗,實驗結果見表2。
表2 正交實驗結果Table 2 Orthogonal experiment results
由極差分析結果可以看出,各因素作用主次順序排序如下:C>B>A,即乙酸酐用量影響最大,其次依次是溫度和時間。由K值可知最佳組合為A2B2C2,即乙酸酐5 mL,溫度為60 ℃時,時間6 h。此條件下羥自由基清除率最高,達99.7%,超氧陰離子自由基的清除率87.4%,略低于同濃度下VC的清除能力(99.8%)。
表3 不同實驗組樣品中總糖含量和乙?；?%)Table 3 The contents of total sugar and acetyl group of different test samples(%)
表3是上述不同實驗組樣品中總糖和乙?；?。由表3可知,隨著乙酰基含量的增大,羥自由基清除率上升。實驗結果說明在實驗范圍內乙?；颗c抗氧化正相關。乙?；娜〈恢?、空間構象等均影響生物活性[18],目前其構效關系和作用規律尚不清楚,仍有待深入探討。
2.3 辣木多糖與乙?；蹦径嗵堑募t外光譜分析結果
如圖4所示,與辣木多糖的IR譜圖相比,乙酰化的辣木多糖在1723 cm-1出現了C=O的雙鍵伸縮振動峰,1260 cm-1處有酯基C-O的伸縮振動,這表明樣品的乙酰化是成功的[19]。
圖4 辣木多糖和乙酰化辣木多糖的紅外譜圖Fig.4 IR spectrum of Moringa oleifera polysaccharide and acetylated Moringa oleifera polysaccharide
3 結論
采用乙酸酐對辣木多糖進行乙酰化修飾,并使用正交實驗得到了最適的反應條件,即反應時間6 h,反應溫度60 ℃,乙酸酐用量5 mL。經過乙?；揎椇蟮睦蹦径嗵菍αu自由基(99.7%)和超氧陰離子自由基(87.4%)清除能力均顯著提高,本研究表明乙?；揎椷m用于辣木多糖的結構改性,為其構效關系研究提供新的思路。
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PreparationandantioxidantactivityofacetylatedpolysaccharidefromMoringaoleifera
MABo,ZHUJian-guo,SHAOShi-guang,WANGWei
(Department of Life Sciences of Lianyungang Teacher’s College,Lianyungang 222006,China)
TS201.2
B
1002-0306(2017)18-0207-04
2017-02-23
馬波(1975-)，男，碩士,講師，研究方向：植物多糖的研究與開發，E-mail:mabo7512@163.com。
10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.039
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