響應面法優化蓮子多糖提取工藝的研究

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(福建農林大學食品科學學院,福建福州 350002)

響應面法優化蓮子多糖提取工藝的研究

陳釧杰,陳培琳,陳麗,鄭寶東,曾紅亮*,張怡*

(福建農林大學食品科學學院,福建福州350002)

為優化蓮子多糖的提取工藝,以熱水浸提方法,考察浸提溫度、浸提時間、液料比三因素對蓮子多糖得率的影響,在此基礎上,設計響應面法Box-Benhnken中心組合實驗,對蓮子多糖熱水浸提工藝進行優化,得到蓮子多糖熱水浸提的最佳提取條件:浸提溫度為83 ℃、浸提時間為3 h、液料比為30∶1 mL/g,蓮子多糖得率為8.13%±0.04%,與理論預測值基本一致(相差百分比小于1%),響應面法能較好地應用在蓮子多糖熱水浸提工藝中。采用環境掃描電鏡觀察和分析浸提前后蓮子粉末的微觀形態,結果顯示:經熱水浸提,蓮子細胞完整性被破壞,粉末呈大小不一的片狀,且表面粗糙,呈不規則裂痕及溝壑狀紋路,浸提前后蓮子粉末微觀結構差異明顯。可見,所采用的熱水浸提工藝能較好地將蓮子細胞及細胞壁中可溶性多糖浸提出來。

蓮子,多糖,熱水浸提,響應面法,環境掃描電鏡

Abstract:In order to obtain the best condition of hot water extraction of lotus seed polysaccharides,the effects of three single factors(extraction temperature,extraction time,ratio of water volume to raw material weight(w/m ratio))on the yield of lotus seed polysaccharides were investigated. Based on the data of single factor experiments,the optimal extraction technology of lotus seed polysaccharides was obtained by response surface methodology was as follows.:extraction temperature was 83 ℃,extraction time was 3 h,the ratio of water volume to raw material weight(w/m)was 30∶1 mL/g. Under these conditions,the yield of polysaccharides was 8.13%±0.04%,which was consistent with the theoretical prediction value(difference value lower than 1%). Moreover,the microstructure of lotus seed powder before extraction and after extraction were observed and compared by environmental scanning electron microscopy. The results showed that:the whole cells of lotus seed powder were destroyed after hot-water extraction. The powder was different sizes,and its surface displayed schistose shapes,rough and irregular cracks. The microstructure of lotus seed powder before and after extraction was significantly different. It indicated that the soluble polysaccharides could be extracted greatly from lotus seed powder using the optimized hot water extraction process.

Keywords:lotus seed;polysaccharide;hot water extraction;response surface methodology;environmental scanning electron microscopy

蓮子為睡蓮科植物蓮(Nelumbonucifera)的干燥成熟種子。又名藕實、水芝丹、蓮實、蓮蓬子、蓮肉,我國南北均有分布,是重要的經濟作物。具有補脾止瀉,止帶,益腎澀精,養心安神之功效，是重要的經濟作物[1]。現代研究表明,蓮子中含有多種功效成分,包括多糖、總黃酮、多酚、低聚糖等[2]。其中,蓮子水溶性多糖在提高免疫、改善腸道菌群、抗衰老等方面有明顯功效[3-4]。

植物多糖分子量大,結構復雜。多糖由單糖通過各種鍵及分子間作用力連結而成,易因外界環境干擾而降解。植物體內的多糖根據存在部位可歸納為三類:細胞內多糖、細胞壁多糖和細胞外多糖。細胞內多糖一部分以顆粒狀的淀粉粒存在,另一部分以溶液或高度水合狀態存在于液泡中;細胞壁多糖主指半纖維素和果膠類;細胞外多糖主指樹膠和粘膠等[5]。另外多糖在植物中的存在形式往往是與蛋白質、脂質等結合成多糖復合物,給多糖的提取分離帶來了困難[6]。

目前,植物多糖提取主要有水提法、酸提法、堿提法、酶提法、超聲波法、微波法等方法。其中,酸提法、堿提法需要在酸性或堿性條件下進行,需要加入化學試劑,不僅成本消耗相對較大,且若廢液處理不當,可能會對環境造成破壞[7-8]。而在酶解法中,溫度、pH、時間和底物量等都會影響酶的活性,條件過高或過低都會造成酶失活,加之酶制劑用量大且成本高,限制了大規模的應用[9]。在超聲波法、微波法提取多糖過程中,若超聲或微波作用的強度過大或者處理時間過長,則多糖結構可能受到破壞[10-11]。另外,由于超聲波及微波本身的傳播特性,作用強度隨距離遞減,使得作用強度分布不均勻,這使得在使用大直徑設備提取過程中,近超聲(微波)源范圍多糖破壞率與遠超聲(微波)源范圍多糖溶出率之間難以平衡[12-13]。而水提取[14]具有無需添加任何化學試劑、不污染環境、設備要求低、成本低等優點,適合大批量工業化生產。

為了盡可能充分地從蓮子中提取出多糖,改善多糖提取工藝。本研究以蓮子為原料,采用更適合工業化生產的水提法提取蓮子多糖,優化其工藝參數,以期提高蓮子多糖得率,為蓮子多糖分離純化、結構表征和功能活性等進一步研究提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

去心干蓮 產于福建建寧;無水乙醇等試劑 分析純;實驗用水 二次蒸餾水。

RE-52A型旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;FZ102植物粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;AL104型精密分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;L530型臺式低速離心機 長沙高新技術產業開發區湘儀離心機儀器有限公司;XL30 ESEM-TMP環境掃描電鏡 荷蘭Philips-FEI公司;丹瑞HH-6型數顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;101-1A 型數顯電熱鼓風恒溫干燥箱 上海陽光實驗儀器有限公司;LG-1.0型真空冷凍干燥機 新陽速凍設備制造有限公司;鹵素快速水分測定儀 深圳市冠亞電子科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 取適量去心干蓮子于植物粉碎機中粉碎1 min,倒出過40目篩,得蓮子粉末樣品。取5 g蓮子粉末,置于鹵素快速水分測定儀中測定粉末樣品的水分含量,所制得蓮子粉末的水分含量小于3%。

1.2.2 提取工藝流程 取定量1.2.1所制得蓮子粉末樣品于錐形瓶,加定量二次蒸餾水,置于預熱后的水浴鍋中水浴,樣品浸提液離心(4000 r/min,20 min)得濾液,加入4倍體積的常溫無水乙醇,室溫下靜置沉降20 h后,再次離心(4000 r/min,20 min)。棄上清液,取沉淀,用二次蒸餾水溶解沉淀后冷凍干燥,得蓮子多糖(lotus seed polysaccharides,LSP),稱重記錄。

1.2.3 多糖得率的測定 將1.2.2中冷凍干燥后蓮子多糖于分析天平上,測量重量,重復3次取平均值。

多糖得率計算公式如下:

式(1)

1.2.4 單因素實驗 取5.00 g實驗樣品,以蓮子多糖得率為指標,固定浸提時間為2.0 h,液料比為40∶1 mL/g,考察浸提溫度為50、60、70、80、90、100 ℃對蓮子多糖提取得率的影響;固定浸提溫度為80 ℃,液料比40∶1 mL/g,考察浸提時間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h對蓮子多糖提取得率的影響;固定浸提時間為2.0 h,浸提溫度為80 ℃,考察液料比為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1 mL/g對蓮子多糖提取得率的影響。每次實驗重復3次。

1.2.5 響應面實驗 根據單因素實驗結果,采用響應面分析法研究浸提溫度、浸提時間和液料比對多糖得率的影響,計算得到二次回歸方程,通過分析預測最佳工藝參數。各實驗因素和水平見表1。

表1 中心組合設計的因素和水平表Table 1 Factors and levels table of Box-Behnken Design(BBD)

1.2.6 浸取前后蓮子粉末形態觀察 分別取一定量的提取前蓮子粉末及提取后蓮子粉末,將樣品粘著于樣品臺上,置真空噴鍍儀內鍍導電層鉑(Pt),厚度10 nm,采用掃描電鏡觀察,電子槍加速電壓:5 keV。

1.2.7 數據處理 采用Design-Expert 8.0.6和SPSS 13.0軟件對熱水提取數據進行分析。SPSS分析方法采用單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 浸提溫度對蓮子多糖得率的影響 浸提溫度對蓮子多糖得率的影響如圖1所示,在50～80 ℃之間,蓮子多糖得率隨著浸提溫度的升高而增大;在80 ℃之后多糖得率隨著浸提溫度的升高而減小。這可能是因為50～80 ℃之間,隨著溫度的升高,浸提液的粘度降低,多糖分子擴散過程中阻力變小,分子運動速率加快,分子擴散系數增大,使此階段多糖的溶出率升高[15];80 ℃之后,由于熱作用程度增強,過高溫度使較多多糖分子結構受到破壞,導致多糖得率降低[16]。因此,本實驗所設定溫度梯度中,選擇80 ℃進行下一步的優化實驗。

圖1 浸提溫度對蓮子多糖得率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield of LSPs

2.1.2 浸提時間對蓮子多糖得率的影響 浸提時間對蓮子多糖得率的影響如圖2所示。0.5～3.0 h內,蓮子多糖得率隨浸提時間延長而增大;3.0～3.5 h內,多糖得率隨浸提時間延長而下降。這可能是因為熱水浸提過程中,熱作用及細胞吸水膨脹導致細胞破裂,多糖溶出;浸提時間增加,細胞受破壞數量及程度隨之增加,使細胞中多糖更易溶出,溶出量增加[17]。多糖受熱時間過長,分子亦會降解,且程度及數量隨受熱時間延長而增加[18]。當降解速率快于溶出速率時,多糖得率則呈下降趨勢。本實驗所設定時間梯度中,選擇3 h進行下一步的優化實驗。

圖2 浸提時間對蓮子多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield of LSPs

2.1.3 液料比對蓮子多糖得率的影響 液料比對蓮子多糖得率的影響如圖3所示。蓮子多糖得率在液料比在10∶1～30∶1 mL/g范圍內隨液料比增大而增大;當液料比在30∶1～70∶1 mL/g范圍內,多糖得率隨液料比增大而下降。這可能是因為液料比在10∶1～30∶1之間時,水量增多使得其能溶解的多糖量也隨之變多,則多糖得率增高。料液比在30∶1～70∶1時,提取液整體處于較低濃度水平,溶液中的多糖較少。理論上多糖的溶出量將增多,實際上過多液料將對熱傳播造成一定的阻礙作用,熱擴散距離增大使提取容器中心溫度偏低,對多糖溶出不利[19]。另外一種原因可能是:本實驗中多糖浸提后期需要通過旋轉蒸發器進行加熱濃縮,由于液料比的增加,加熱濃縮的時間也需延長,導致多糖降解率增加,最終得率也會減少[20]。因此,本實驗所設定液料比梯度中,選擇30∶1 mL/g進行下一步的優化實驗。

圖3 液料比對蓮子多糖得率的影響Fig.3 Effect of liquid/material ratio on the yield of LSPs

2.2 響應面實驗設計和結果

根據單因素實驗結果,選取A：浸提溫度(℃)、B：浸提時間(h)和C：液料比(mL/g)為自變量,采用中心組合設計進行3因素3水平的實驗設計,以蓮子多糖得率(%)為響應值,進行響應面分析。

實驗設計及結果見表2。實驗1～12是析因實驗點,實驗13～19是中心實驗點。

表2 實驗設計和結果Table 2 Experimental design and results

各因素經二次多項式回歸擬合后,得到蓮子多糖得率對浸提溫度、浸提時間和液料比3個因素的二次多項回歸方程為:

Y=8.0371+0.3988A+0.4338B+0.6750C+0.1025AB-0.0950AC-0.1800BC-0.7434A2-1.0023B2-0.5348C2

式(2)

2.3 模型的建立及顯著性分析

采用Design-Expert 8.0.6對表2中的實驗數據進行多元回歸擬合,對回歸系數和回歸模型進行方差分析,分析結果如表3所示。

表3 方差分析表Table 3 The table of variance analysis

在一次項中,A和B對多糖得率的影響達到極顯著水平;在交互項中,BC達到極顯著水平;在二次項中,A2、B2和C2對多糖得率的影響達到極顯著水平;在所選取的各因素水平范圍內,各因素對蓮子心多糖得率的影響程度依次為:浸提時間>浸提溫度>液料比。

2.4 響應面分析

A、B和C二次項系數均為負值,方程表示的拋物面開口向下有極大值點。響應面3D圖分析如下。

2.4.1 浸提溫度和浸提時間交互作用對蓮子多糖得率的影響 由圖4可知,當液料比為30∶1 mL/g時,當浸提溫度在70～95 ℃之間,浸提時間在1.7～2.9 h的范圍內,蓮子多糖的得率最高。浸提時間軸向等高線分布密集,說明在浸提多糖過程中,浸提時間對多糖得率的影響較浸提溫度顯著。

圖4 浸提溫度和浸提時間交互作用對多糖得率影響的響應面圖Fig.4 Response surface of extraction temperature and time on the yield of polysaccharide

2.4.2 浸提溫度和液料比交互作用對蓮子多糖得率的影響 由圖5可知,當浸提時間為3.0 h時,浸提溫度在72.5～92.5 ℃之間,液料比在28∶1～52∶1 mL/g范圍內,蓮子多糖的得率最高。兩個軸向上的等高線分布都較為稀疏,浸提溫度軸向上的密度較液料比稍高,說明浸提溫度對多糖得率的影響較液料比顯著。

圖5 浸提溫度和液料比交互作用對多糖得率影響的響應面圖Fig.5 Response surface of extraction temperature and liquid/material ratio on the yield of polysaccharide

2.4.3 浸提時間和液料比交互作用對蓮子多糖得率的影響 由圖6可知,當浸提溫度為80 ℃時。浸提時間在1.85～2.9 mL/g之間,液料比在28∶1～52∶1 mL/g范圍內,蓮子多糖的得率最高。等高線在兩個軸向上的分布都較為稀疏,浸提時間軸向上的等高線密度較液料比稍高,說明浸提時間對多糖得率的影響較液料比顯著。

圖6 浸提時間和液料比交互作用對多糖得率影響的響應面圖Fig.6 Response surfaceof extraction time and liquid/material ratio on the yield of polysaccharide

2.5 提取工藝的確定

結合回歸模型,由Design-Expert 8.0.6軟件分析得到蓮子多糖最佳的熱水浸提工藝條件為:浸提溫度為82.56 ℃、浸提時間為3.12 h、液料比為29.47∶1 mL/g,在此條件下,蓮子多糖的理論得率為8.14%。考慮到實際操作條件,將最佳工藝條件修正為:浸提溫度為83 ℃、浸提時間為3 h、液料比為30∶1 mL/g。在此條件下重復3次實驗,蓮子心多糖得率分別為8.09%、8.16%、8.14%,平均值為8.13%±0.04%,與理論預測值基本一致(相差百分比不超過1%),說明回歸模型可靠。蓮子心多糖實際值與預測值的線性關系見圖7,其實際值與回歸模型預測值呈現良好的線性關系,說明模型的預測值能較好地反映熱水浸提法的實際蓮子多糖得率。

圖7 實際值與預測值的線性關系圖Fig.7 Linearity plot of the predicted and actual values

2.6 提取前后蓮子粉末形態觀察

水提前的蓮子粉末在環境掃描電鏡下的形態如下圖8所示。

圖8 水提前蓮子粉末在不同放大倍數下的環境掃描電鏡圖Fig.8 The picture of sample(before extraction)in different multiples by environmental scanning electron microscopy注:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ的放大倍數分別為500、1000、5000、5000、5000。

從圖8中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ觀察可知:Ⅰ中可明顯看到大量粒徑在10～20 μm之間的橢球狀顆粒物質(如Ⅲ所示),以及部分粒徑在40～60之間的不規則團塊(如Ⅴ所示),還有分散在顆粒間的無規則疊放的薄膜狀物質(如圖Ⅳ所示),通過對比前人對蓮子淀粉及細胞的研究,推測Ⅲ中橢球狀物質為蓮子淀粉[21],Ⅴ中團塊為被物質包埋的蓮子細胞[22],Ⅳ中膜狀物質可能是部分蓮子細胞在粉碎過程中剪切破碎,內容物流失后殘留下的細胞壁、細胞膜、細胞器膜等物質[23]。這說明蓮子粉末經粉碎后,有大量細胞被機械力破壞,導致內容物流出。但是,粉末中還有較多細胞顆粒還保持完整狀態,內容物還處于被包埋狀態。而薄膜狀物質表面光滑,無明顯孔狀。

水提后的蓮子粉末形態在環境掃描電鏡下的顆粒形態如圖9所示。a、b、c經過熱水浸提多糖之后的蓮子粉末,由圖9a中可以看出粉末中原本數量眾多的橢球狀顆粒已被破壞,呈大小不一的片狀,且表面粗糙,有明顯不規則裂痕及溝壑狀紋路,可能是部分淀粉遇熱水后不完全糊化形成片狀(圖9c)[24]。從圖9a觀察整體樣品,提取前的團塊狀(如圖Ⅴ所示)已消失不見,薄膜狀物質已基本消失,但可觀察到部分表面有不規則孔狀的薄片。說明前文所推測的細胞顆粒完整性已被破壞,且膜狀結構等被破壞。出現該現象主要是由于熱水浸提時,細胞內外的濃度差引起的細胞吸水和在加熱的條件下細胞表面受熱發生扭曲的共同作用,細胞漲破,細胞的內容物被釋放出來,出現不規則褶皺,使細胞發生潰陷[25]。而細胞壁中可溶性物質溶解到提取液中,細胞壁中不溶于水的組分留下形成與糊化淀粉一樣的片狀,也會可能被糊化淀粉包埋。通過對比分析蓮子粉末在熱水浸提前后的掃描電鏡圖,熱水浸提前后蓮子粉末微觀結構差異明顯,這表明所采用的經響應面優化后的熱水浸提條件對蓮子多糖的提取具有較好的效果。

圖9 水提后蓮子粉末在不同放大倍數下的環境掃描電鏡圖Fig.9 The picture of sample(after extraction)in different multiples by environmental scanning electron microscopy注:a、b、c的放大倍數分別為500、1000、5000。

3 結論

蓮子多糖熱水浸提的最佳工藝條件為:浸提溫度為83 ℃、浸提時間為3 h、液料比為30∶1 mL/g。在此條件下,蓮子多糖得率為8.13%±0.04%,與理論預測值基本一致(相差百分比不超過1%)。

環境掃描電鏡觀察結果表明,熱水浸提多糖前后的蓮子粉末微觀結構有明顯變化。可觀察到浸提前較為完整的細胞在經過長時間浸泡和熱作用后,細胞壁破裂,細胞的完整性被破壞,細胞的內容物流入浸提液,細胞形狀完全改變。浸提后觀察到的薄片狀為破裂后的細胞壁等非水溶性組織。這表明,響應面分析法所得到的熱水浸提條件用于蓮子多糖的浸提可獲得較好效果。

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Optimizationofextractionprocessofpolysaccharidesfromlotusseedbyresponsesurfacemethodology

CHENChuan-jie,CHENPei-lin,CHENLi,ZHENGBao-dong,ZENGHong-liang*,ZHANGYi*

(College of Food Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)

TS244.4

B

1002-0306(2017)18-0177-06

2017-03-20

陳釧杰(1994-)，男，在讀碩士研究生，研究方向：食品化學與營養，E-mail：1352572587@qq.com。

*通訊作者:曾紅亮(1986-)，男，博士，講師，研究方向：食品科學與工程，E-mail：zhlfst@163.com。 張怡(1975-)，女，博士，教授，研究方向：食品科學與工程，E-mail：zyifst@163.com。

福建省科技創新領軍人才項目(KRC16002A)；福建省高等學校科技創新團隊支持計劃(閩教科[2012]03號)；福建農林大學科技發展資金使用計劃項目(KF2015101)。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.034