離子液體超聲輔助提取磷脂酰肌醇

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(河南省農業科學院,農副產品加工研究中心,河南鄭州 450002)

離子液體超聲輔助提取磷脂酰肌醇

宋范范,張康逸*,楊妍,楊帆

(河南省農業科學院,農副產品加工研究中心,河南鄭州450002)

以大豆粉末磷脂為原料,采用離子液體超聲波輔助萃取的方法對磷脂酰肌醇進行了分離提取研究。考察了不同萃取次數、料液比、乙醇-離子液體(氫氧化1-丁基-3-甲基咪唑,[Bmim]OH)溶劑比、萃取溫度、萃取時間和萃取功率對磷脂酰肌醇純度和提取率的影響。結果表明:萃取次數3次,料液比1∶12 (w/v),溶劑乙醇-[Bmim]OH體積比100∶7 (v/v),萃取溫度35 ℃,萃取時間15 min,萃取功率360 W條件下磷脂酰肌醇的純度為79.53%±3.26%,提取率為68.26%±1.15%。

大豆粉末磷脂,磷脂酰肌醇,超聲波輔助萃取,離子液體

Abstract:The extraction methods of phosphatidylinositol from soybean lecithin powder by ionic liquid and ultrasonic wave were studied. The effects of extraction times,solid-liquid ratio,ehanol-[Bmim]OH ratio,extraction temperature,extraction time and ultrasonic power on the purity and extraction ratio of phosphatidylinositol were investigated. The purified phosphatidylinositol products were obtained at the conditions as follows:extraction times 3,solid-liquid ratio 1∶12,ehanol-[Bmim]OH ratio 100∶7,extraction temperature 35 ℃,extraction time 15 min and ultrasonic power 360 W. Under these conditions,the purity and extracting yield of phosphatidylinositol were 79.53%±3.26% and 68.26%±1.15%,respectively.

Keywords:soybean lecithin powder;phosphatidylinositol;ultrasonic assisted extraction;ionic liquid

磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)是磷脂的組分之一,大豆粉末磷脂中PI含量豐富,約占總磷脂的18%～21%。PI是細胞的信息分子,常作為細胞內信號傳導通路,對于維持中樞神經系統、調節鈣穩態方面有重要作用[1]。由于PI是一種重要的生理活性物質,且具有重要的生理功能和乳化特性,已被廣泛用于醫藥、保健品、化妝品及食品等行業。

很多學者對PI的制備方法進行了研究,包括溶劑萃取法[2]、柱層析法[3]、酶催化法[4]、化學合成法[5]等。劉代成等采用堿性乙醇抽提的方法首先去除大豆磷脂中的磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺,然后用非極性溶劑溶解粗品,再用含堿性的極性溶劑萃取PI,最后加入金屬鹽純化,但該種方法制備過程繁瑣、PI回收率過低且提取時間長(60 min)[6]。柱層析法所得到的PI產品純度較高,但是分離周期過長,負載量較低,不利于放大生產。酶催化法過程簡便,PI純度和得率較高,但是生產投入較大,仍未得到廣泛應用。化學合成法會用到吡啶、乙腈、DMF等有機溶劑,可能對產品的安全性造成影響。

離子液體作為新型的綠色環保溶劑,已廣泛應用于有機合成、催化及萃取領域[7]。作為萃取介質,離子液體可以替代傳統的有機溶劑,并可提高萃取的效率和選擇性,且在環境友好和回收利用方面具有很大的優勢和潛力,適用于對安全性要求高的醫藥及食品工業領域[8-9]。

超聲波萃取利用超聲波空化效應,在液體中形成強大的沖擊波或高速射流,加快傳質速度,此外,超聲波的熱作用和機械作用也能促進超聲波的強化萃取[10-11],已有學者利用超聲來強化磷脂的提取[12-14]。余祥英等人以大豆粉末磷脂為原料,研究了超聲波輔助萃取制備大豆磷脂酰膽堿的過程[15]。劉玲娜用超聲輔助丙酮萃取粉末磷脂,與非超聲溶劑萃取相比,萃取時間少,磷脂含量高[16]。本文在前人的研究基礎上,選用無毒溶劑乙醇和綠色溶劑離子液體來萃取制備PI,借助了超聲波的空化效應來增加溶劑的穿透力,以此來提高PI的溶出速度和純度。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆粉末磷脂 純度≥96%,磷脂酰膽堿(PC)30%、磷脂酰乙醇胺(PE)25%、磷脂酰肌醇25%、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)0.5%,河南新百維食品科技有限公司;PI、PE、PC、溶血磷脂酰膽堿(LPC)(99%)標準品 Sigma公司(St. Louis,MO,USA);甲醇 色譜純,美國Honeywell公司;無水乙醇(純度≥99%)、氨水(NH3含量≥25%)、甲醇(純度≥99%) 國藥集團化學試劑有限公司;氯仿 分析純,煙臺市雙雙化工有限公司;離子液體[氫氧化1-丁基-3-甲基咪唑Bmim]OH、1-丁基-3-甲基咪唑鹽[Bmim]Im、1-丁基-3-甲基咪唑醋酸鹽[Bmim]OAc、氫氧化1-乙基-3-甲基咪唑[Emim]Im 上海成捷化學有限公司。

Agilent 1260型高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司;KQ-600DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;JW-1042低速離心機 安徽嘉文儀器裝備有限公司;D27-6050真空干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PI的制備方法 稱取一定量的粉末磷脂,加入一定比例的混合溶劑,置于超聲波清洗器中,按設定條件進行超聲提取,4000 r/min離心10 min分離出沉淀重復操作,將沉淀在真空度0.1 MPa,干燥溫度40 ℃條件下真空干燥即得到PI產品。

1.2.2 PI純度的測定

1.2.2.1 標準曲線的繪制 將PI標準品配成1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL不同濃度的標準溶液,用HPLC-ELSD測定峰面積,以峰面積對濃度做標準曲線。

1.2.2.2 HPLC-ELSD條件 色譜柱:ZORBAXRX-SIL(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱溫35 ℃,進樣量20 μL,漂移管溫度30 ℃;流動相:A為甲醇,B為甲醇∶水=8∶1 (v/v),流量1.0 mL/min;梯度洗脫程序:0～10.0 min,60%～40% A;10.0～20.0 min,40% A;20.0～20.1 min,40%～60% A;20.1～25.0 min,60% A。

1.2.2.3 樣品測定 PI產品溶解定容后進行HPLC-ELSD分析,由回歸方程計算出PI的濃度,按下式計算提取率和純度。

Y(%)=C×V×D×100/M

式中:Y為純度,%;C為待測溶液中PI的濃度,mg/mL;V為待測溶液的體積,mL;D為稀釋倍數;M為樣品質量,g。

1.2.3 單因素實驗 以萃取方式、離子液體種類、萃取次數、料液比、乙醇-[Bmim]OH混合溶劑比、萃取時間、萃取溫度及萃取功率為研究因素,以PI的純度和提取率為指標進行單因素實驗。

1.2.3.1 萃取方式對PI純度和提取率的影響 在料液比為1∶5 (w/v)、乙醇-[Bmim]OH溶劑比100∶3 (v/v)、萃取時間15 min、萃取3次,萃取溫度40 ℃的條件下,分別考察磁力攪拌(轉速500 r/min)和超聲輔助(功率480 W)萃取方式對PI純度和提取率的影響。

1.2.3.2 離子液體種類對PI純度和提取率的影響 在料液比1∶5 (w/v)、乙醇-離子液體溶劑比100∶3 (v/v)、萃取時間15 min、萃取3次,萃取溫度40 ℃、超聲波萃取功率480 W的條件下,分別考察四種常見堿性離子液體[Bmim]OH、[Bmim]Im、[Bmim]OAc、[Emim]Im及單一乙醇(空白)體系對PI純度和提取率的影響。

1.2.3.3 萃取次數對PI純度和提取率的影響 在料液比1∶5 (w/v)、乙醇-[Bmim]OH溶劑比100∶3 (v/v)、萃取時間15 min、萃取溫度40 ℃、萃取功率480 W的條件下,分別考察萃取次數1、2、3、4次對PI純度和提取率的影響。

1.2.3.4 料液比對PI純度和提取率的影響 在萃取次數3次、乙醇-[Bmim]OH溶劑比100∶3 (v/v),萃取時間15 min、萃取溫度40 ℃、萃取功率480 W的條件下,分別考察料液比1∶3、1∶5、1∶9、1∶12、1∶18 (w/v)對PI純度和提取率的影響。

1.2.3.5 溶劑比對PI純度和提取率的影響 在萃取次數3次,料液比1∶5 (w/v)、萃取時間15 min、萃取溫度40 ℃、萃取功率480 W的條件下,分別考察乙醇-[Bmim]OH溶劑比100∶1、100∶3、100∶5、100∶7、100∶9 (v/v)對PI純度和提取率的影響。

1.2.3.6 萃取時間對PI純度和提取率的影響 在萃取次數3次、料液比1∶5 (w/v)、乙醇-[Bmim]OH溶劑比100∶3 (v/v)、萃取溫度40 ℃、萃取功率480 W的條件下,分別考察萃取時間3、5、10、15、30 min對PI純度和提取率的影響。

1.2.3.7 萃取溫度對PI純度和提取率的影響 在萃取次數3次、料液比1∶5 (w/v)、乙醇-[Bmim]OH溶劑比100∶3 (v/v)、萃取時間15 min、萃取功率480 W的條件下,分別考察溫度20、30、35、40、50 ℃對PI純度和提取率的影響。

1.2.3.8 萃取功率對PI純度和提取率的影響 在萃取次數3次、料液比1∶5 (w/v)、乙醇-[Bmim]OH溶劑比100∶3 (v/v)、萃取時間15 min、萃取溫度40 ℃的條件下,分別考察超聲功率240、300、360、480、600 W對PI純度和提取率的影響。

1.3 數據處理

數據采用Origin 9.0軟件作圖,并用SPSS 17.0單因素方差、多因素方差分析進行處理。

2 結果與討論

2.1 PI標準曲線的繪制

PI標準曲線方程為Y=9.2739X-8.3799(R2=0.9910),二者呈良好的線性關系,見圖1。

圖1 PI標準曲線Fig.1 The standard curve of PI

2.2 單因素實驗

2.2.1 萃取方式對PI純度和提取率的影響 磷脂作為一種混合物,其主要成分有磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)及PI三種[17]。由圖2可以看出,采用超聲輔助萃取得到的PI的純度和提取率較高,磁力攪拌萃取3次后粗PI純度為49.12%,超聲輔助萃取后粗PI純度為68.35%,PI提取率也較高,這主要與超聲波所產生的強烈機械振蕩及空化效應等作用有關,這些作用力能夠使溶劑體系與磷脂之間接觸面積增大,使磷脂中的PC和PE更易被浸提到溶劑中,從而使不溶物中的PI含量增加,故PI純度升高。因此,選擇超聲輔助的萃取方法。

圖2 萃取方式對PI純度和提取率的影響Fig.2 Effect of extraction technology on PI purity and extraction ratio

2.2.2 離子液體種類對PI純度和提取率的影響 PC易溶解于乙醇中,PE的溶解度在堿性乙醇中要高于乙醇,故利用堿性乙醇能有效去除磷脂中的PC和PE組分,進而可得到純度較高的PI。文獻中向乙醇中添加的堿性物質主要為氫氧化鈉、氨水、碳酸鈉等堿性試劑[6],這些物質的存在對產品和生產環境的安全性會存在一定的影響,且不利于反應溶劑的回收利用。結合離子液體作為萃取介質的優勢,本研究選擇了幾種堿性離子液體來替代之前所用到的堿性物質,以此解決產品和生產環境的安全性及溶劑回收利用等問題。由圖3看出,[Bmim]OH存在的溶劑體系比其他離子液體溶劑體系所得到的PI純度較高,可能由于該離子液體與乙醇可形成分子間氫鍵、互溶性好,同時二者組成的溶劑體系對磷脂的溶解能力較強,能夠形成均一穩定的體系[18]。此外,乙醇-[Bmim]OH溶劑體系下的提取率高于其他幾種離子液體存在的溶劑體系。在單一乙醇體系下PI的純度為53.96%,提取率為73%,雖然提取率高于有離子液體存在的溶劑體系,但考慮到PI的純度并不高,故選擇乙醇-[Bmim]OH作為堿性提取溶劑。

圖3 離子液體種類對PI純度和提取率的影響Fig.3 Effect of type of ionic liquid on PI purity and extraction ratio

2.2.3 萃取次數對PI純度和提取率的影響 隨著萃取次數的增加,產品中PI的純度先增加后趨于穩定。萃取次數越多,大豆粉末磷脂中的PC和PE會被萃取到溶劑體系中,產品中的PI純度逐漸增加,但隨著萃取次數的再增加,PC和PE在溶劑體系中的溶解趨于飽和,PI的純度趨于穩定。由圖4可知,當萃取次數為3次時,PI的純度及提取率基本已趨于穩定,再增加萃取次數,PI提取率會下降,同時為了避免造成溶劑的浪費,選擇3次為最佳萃取次數。

圖4 萃取次數對PI純度和提取率的影響Fig.4 Effect of extraction times on PI purity and extraction ratio

2.2.4 料液比對PI純度和提取率的影響 由圖5可知,隨著料液比的增加,PI純度呈逐漸增加的趨勢,當料液比為1∶12時PI的純度最大,提取率也比較高,這是因為料液比的增加會導致體系粘度降低,PC和PE的溶出速度增大;繼續增大料液比,純度反而開始下降,這種現象的產生主要是因為磷脂中的PI組分也開始溶解到溶劑體系中,故導致不溶物中的PI含量下降,純度和提取率均降低。綜合以上因素,選擇1∶12為最佳料液比。

圖5 液料比對PI純度和提取率的影響Fig.5 Effect of the ratio of liquid to solid on PI purity and extraction ratio

2.2.5 溶劑比對PI純度和提取率的影響 隨著乙醇-[Bmim]OH溶劑比的增大,產品中PI的純度先增加后降低,同時PI提取率呈下降趨勢。當溶劑比為100∶7時PI純度最大。隨著溶劑中[Bmim]OH量的增加,溶劑體系的黏度加大,當溶劑比為100∶9時,體系中磷脂顏色嚴重結塊呈膠狀,不利于傳質,這是因為隨著溶劑中離子液體含量的增加,體系變的黏稠,磷脂不能充分溶解在溶劑體系中,也就不利于溶劑對PC和PE的溶出,故PI純度降低,此外,體系流動性變差也導致PI的提取率下降的原因。綜合以上因素,選擇100∶7為最佳溶劑比。

圖6 溶劑比對PI純度和提取率的影響Fig.6 Effect of solvent ratio on PI purity and extraction ratio

2.2.6 萃取時間對PI純度和提取率的影響 隨著萃取時間的延長,產品中的PI純度先升高后降低。超聲波萃取5 min就可提取到純度為61.00%的PI,適當延長萃取時間有利于溶質的溶解和擴散,PC和PE越易被萃取出來,PI的純度越高,但是隨著萃取時間的繼續延長,原料磷脂中的PI等其他組分也會被提取到溶劑體系中,使得產品中PI純度降低。堿性離子液體[Bmim]OH在很多類型的催化反應中表現出較高的催化活性[19-21],因此當萃取時間過長時，[Bmim]OH有可能會對少量的磷脂或PI進行催化,使其轉化為其他的物質,故而導致PI的提取率和純度降低。當萃取時間為15 min時,PI的純度達到最大值。故選擇15 min為最佳萃取時間。

圖7 萃取時間對PI純度和提取率的影響Fig.7 Effect of extraction time on phosphatidylinositol purity and extraction ratio

2.2.7 萃取溫度對PI純度和提取率的影響 由圖8看出,適當升溫有利于提高溶質的傳質速率,隨著溫度的升高,產物中的PI純度逐漸增加,在40 ℃的萃取溫度下產物中PI純度最高,隨后PI純度開始減少。升高溫度有利于PC和PE的浸出,但當溫度超過40 ℃時,部分PI也會溶解到溶劑體系中,導致PI的純度降低,這種現象的產生也有可能與[Bmim]OH的催化活性有關,因為[Bmim]OH可能會對部分的PI進行催化[22]。由于35 ℃和40 ℃的純度差別很小,且35 ℃時的提取率較高,綜合以上因素,選擇35 ℃為最佳萃取溫度。

圖8 溫度對PI純度和提取率的影響Fig.8 Effect of temperature on phosphatidylinositol purity and extraction ratio

2.2.8 萃取功率對PI純度和提取率的影響 由圖9看出,隨功率的升高,產物中PI的純度先增加后減少,當萃取功率360 W時PI純度最高。提高超聲功率有利于提高溶質的運動頻率和速度,增加溶劑的穿透力,加速溶質的溶解,因此,提高功率有利于PC和PE的浸出。當功率為360 W時,繼續增大功率會導致溶劑體系溫度升高,從而使部分PI進入溶劑體系,導致PI的含量降低。綜合以上因素,選擇360 W為最佳萃取功率。

圖9 功率對PI純度和提取率的影響Fig.9 Effect of power on PI purity and extraction ratio

2.2.9 最佳條件驗證 在萃取次數3次,料液比1∶12 (w/v),乙醇-[Bmim]OH溶劑體積比100∶7 (v/v),萃取溫度35 ℃,萃取時間15 min,萃取功率360 W的條件下,PI的純度為79.53%±3.26%,提取率為68.26%±1.15%,PI的液相色譜圖如圖10所示。

圖10 粉末磷脂(A)和PI(B)的色譜圖Fig.10 Chromatograms of soybean lecithin powder(A)and PI(B)

3 結論與討論

本文采用新型離子液體[Bmim]OH替代了傳統的堿性試劑,降低了溶劑體系的毒性,并且提高了產品PI的純度及安全性。[Bmim]OH和乙醇能夠形成均一穩定的體系,在提高對原料粉末磷脂中PI的選擇性的同時還能最大限度的降低乙醇的揮發。此外,超聲波輔助下5 min就可提取到純度為61.00%的PI,與傳統的溶劑萃取法(提取時間60 min)[6]相比,節約了大量的提取時間。

實驗結果表明最佳工藝條件為萃取次數3次,料液比1∶12 (w/v),溶劑乙醇-[Bmim]OH體積比100∶7 (v/v),萃取溫度35 ℃,萃取時間15 min,萃取功率360 W,在此條件件下PI的純度為79.53%±3.26%,提取率為68.26%±1.15%。與單一的乙醇體系(53.96%)相比,PI的純度提高了將近25%。此外,溶劑體系經過簡單的蒸餾就可實現分離和循環利用。但實驗過程中發現長時間或稍高溫度下萃取會使PI的純度下降,這種現象可能與[Bmim]OH的催化活性有關,故使產品純度降低。因此,后續實驗會考察[Bmim]OH對磷脂的催化性能,而這一方面的研究還未見報道。

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Extractionofphosphatidylinositolbyionicliquidandultrasonicwavemethod

SONGFan-fan,ZHANGKang-yi*,YANGYan,YANGFan

(Institute of Agricultural Products Processing,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China)

TS229

B

1002-0306(2017)18-0155-05

2017-03-01

宋范范(1988-)，女，碩士，研究方向：脂質化學，E-mail：495536703@qq.com。

*通訊作者:張康逸(1981-)，男，博士，副研究員，研究方向：脂質化學，E-mail：kangyiz@163.com。

河南省農業科學院科研發展專項資金項目(YCY20167822)；河南省科技開放合作項目(152106000054)。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.030