濃香型大曲儲(chǔ)藏過(guò)程中細(xì)菌菌群差異性分析

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(1.五糧液股份有限公司,四川宜賓 644007;2.固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川宜賓 644007)

濃香型大曲儲(chǔ)藏過(guò)程中細(xì)菌菌群差異性分析

施思1,彭智輔1,喬宗偉1,2,劉多濤1,羅青春1,涂福明1

(1.五糧液股份有限公司,四川宜賓644007;2.固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川宜賓644007)

為了探究不同陳化曲庫(kù)中大曲細(xì)菌群落差異變化,采用高通量測(cè)序技術(shù)分析了細(xì)菌16S rDNA V3～V4區(qū),并結(jié)合主成分和判別效應(yīng)分析方法進(jìn)一步揭示不同大曲與細(xì)菌多樣性關(guān)系。實(shí)驗(yàn)選取A和B兩組大曲,由車(chē)間跟蹤數(shù)據(jù)所知,A組出庫(kù)曲糖化力平均值約為B組的二分之一,具有明顯差異。結(jié)果表明儲(chǔ)藏過(guò)程中大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)不斷調(diào)整,乳球菌和賽巴爾德氏菌成為A組大曲最終的優(yōu)勢(shì)菌群,而B(niǎo)組大曲的優(yōu)勢(shì)菌為芽孢桿菌;A組大曲樣品的細(xì)菌多樣性差異較大,高溫放線菌屬是差異最為顯著的微生物,而芽孢桿菌則是B組大曲樣品中的特征性細(xì)菌類(lèi)群。

濃香型大曲,儲(chǔ)藏,細(xì)菌,差異性

Abstract:To explore the change of bacterial communities of Daqu in different storage rooms,the V3 and V4 regions of bacterial 16S rDNA were analyzed by high-throughput sequencing,the relationship between different Daqu and bacterial diversity was revealed combining the methods of principal co-ordinates analysis and linear discriminant analysis. The groups of A and B were selected in this experiment,according to the tracking data of the department,the mean value of saccharifying power of group A was a half of group B,which indicated obvious difference. The results showed that bacterial community structure was constantly adjusted,LactococcusandSebaldellabecame the dominant genera of group A in the end of storage,while the dominant genera wasBacillusin group B. The bacterial diversity of Daqu had a great difference in group A,in whichThermoctinomyceswere the significantly different microbes,whileBacilluswere the specific bacterium in group B.

Keywords:Luzhou-flavor Daqu;storage;bacterium;difference

中溫制曲工藝是釀制濃香型白酒普遍采用的制曲方式。小麥經(jīng)粉碎加水拌合制成曲塊,先經(jīng)過(guò)30 d左右的發(fā)酵,其品溫達(dá)到55～58 ℃,然后經(jīng)過(guò)6個(gè)月左右的儲(chǔ)藏才能使用。而在長(zhǎng)達(dá)數(shù)月的儲(chǔ)藏過(guò)程中,大曲微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)發(fā)生相應(yīng)變化,發(fā)酵代謝產(chǎn)生部分風(fēng)味物質(zhì)或風(fēng)味前體物質(zhì),對(duì)白酒風(fēng)格的影響至關(guān)重要。在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中,車(chē)間陳化曲庫(kù)由于所處地勢(shì)高低不同,造成曲庫(kù)溫度、通風(fēng)情況等因素存在一定差異,而這些差異會(huì)在一定程度上影響微生物生長(zhǎng)變化,最終造成出庫(kù)曲質(zhì)量不一。因此,探討不同曲庫(kù)環(huán)境對(duì)大曲儲(chǔ)藏期微生物群落結(jié)構(gòu)變化影響,弄清微生物多樣性的構(gòu)成差異與不同曲庫(kù)環(huán)境大曲質(zhì)量的關(guān)系具有重要意義。

目前,針對(duì)不同大曲微生物差異性比較分析,許多科研工作者也做了不少探索。葉光斌等人通過(guò)構(gòu)建細(xì)菌16S rRNA基因文庫(kù)、RFLP指紋圖譜分析了清香型三類(lèi)大曲的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),初步弄清了清茬曲、后火曲和紅心曲的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌群[1]。王曉丹等人利用454FLX+平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序,比較分析了遵義地區(qū)3個(gè)醬香型大曲細(xì)菌群落,并且通過(guò)主成分分析探討了棒狀桿菌屬,魏斯氏菌屬與三類(lèi)大曲樣品的關(guān)系遠(yuǎn)近[2]。炊偉強(qiáng)等人通過(guò)傳統(tǒng)微生物學(xué)方法探討了瀘州老窖普通大曲、優(yōu)質(zhì)大曲的感官指標(biāo)與微生物、理化指標(biāo)等的關(guān)系,揭示了優(yōu)質(zhì)大曲中細(xì)菌、芽孢桿菌、霉菌和酵母菌的總數(shù)均高于普通大曲[3]。此外,潭映月[4]、黃小寧[5]、王海燕[6]及李艷[7]等人利用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)不同類(lèi)型的大曲微生物多樣性進(jìn)行了相關(guān)比較分析及探討。趙金松則利用磷脂脂肪酸技術(shù)(PLAF)對(duì)清香型、濃香型和醬香型大曲微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較研究[8]。隨著測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展,測(cè)序結(jié)果中往往包含大量序列數(shù)據(jù)需要分析處理,以便直觀明了地揭示其中規(guī)律所在。梁晨等人將大曲中已知屬的微生物進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析,并且利用SPSS軟件解析微生物與風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性,為大曲儲(chǔ)存的科學(xué)合理性提供了一定依據(jù)[9]。作為中國(guó)傳統(tǒng)濃香型白酒大曲,需要運(yùn)用更為高效直觀的技術(shù)方法去探索大曲中極為豐富的微生物菌群,并且結(jié)合相關(guān)數(shù)據(jù)分析技術(shù)直觀展示大曲樣品以及復(fù)雜的微生物群落關(guān)系,抓住主要矛盾進(jìn)行分析,使復(fù)雜的問(wèn)題簡(jiǎn)單化。

本研究立足生產(chǎn)實(shí)際,選取不同工段里兩個(gè)陳化曲庫(kù)中的10個(gè)大曲樣本進(jìn)行針對(duì)16S rDNA V3～V4區(qū)高通量測(cè)序,并結(jié)合PCoA(主成分分析,principal co-ordinates analysis)及LEfSe(線性判別分析及影響因子,Linear discriminant analysis effect size)分析方法,揭示儲(chǔ)藏過(guò)程中大曲樣本間細(xì)菌結(jié)構(gòu)變化差異,探討不同大曲與微生物群落關(guān)系,并對(duì)相關(guān)差異顯著的細(xì)菌微生物給予確認(rèn)。希望能夠從微生物的角度提供一些分析思路,不斷完善濃香型大曲制曲工藝?yán)碚摗?/p>

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

曲樣 根據(jù)生產(chǎn)提供的跟蹤數(shù)據(jù)顯示,A組所在的曲房出庫(kù)曲糖化力平均值僅為B組出庫(kù)曲的相應(yīng)指標(biāo)的二分之一，結(jié)合車(chē)間要求,選取A和B兩組樣本進(jìn)行分析；細(xì)菌宏基因組DNA抽提試劑盒 上海生工;Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒 Thermo ScientificTM;341F引物：CCCT ACACGACGCTCTTCCGATCTGCC TACGGGNGGCWGCAG;805R引物：GACTGGAGTT CCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATC TAATCC 上海生工;UNIVERSAL 320R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Hettich;HWS26型電熱恒溫?cái)?shù)字水浴鍋 上海一恒科技;T100TMThermal Cyeler PCR儀 BIO-RAD;DYCZ-21電泳槽 北京六一儀器;凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)UVP。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 取樣 在儲(chǔ)存過(guò)程中定點(diǎn)跟蹤取樣,每月一次,共計(jì)兩組10個(gè)樣品。樣品破碎成粉后用無(wú)菌袋密封,樣品按組及時(shí)間順序分別標(biāo)記為A組:1、2、3、4、5;B組:6、7、8、9、10。

1.2.2 宏基因組提取 采用差速離心法收集微生物細(xì)胞沉淀,采取反復(fù)凍融[9]與試劑盒相結(jié)合的方法,收集DNA,置于-20 ℃保存。利用Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)基因組DNA精確定量,以確定PCR反應(yīng)加入的DNA量。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 利用引物341F和805R對(duì)大曲細(xì)菌基因組16S rDNA V3～V4進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系(50 μL):10×PCR buffer 5μL,dNTP(10 mmol/L each)0.5 μL,DNA 10 ng,引物F(50 μmol/L)0.5 μL,引物R(50 μmol/L)0.5 μL,Plantium Taq(5 U/μL)0.5 μL。

擴(kuò)增程序:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,45 ℃ 20 s,65 ℃ 30 s,共5個(gè)循環(huán);94 ℃ 20 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s,共20個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。

1.2.4 DNA純化及Miseq高通量測(cè)序 DNA純化及高通量測(cè)序由上海生工有限公司完成。利用Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)回收的DNA精確定量,以方便按照1∶1的等量混合后測(cè)序。等量混合時(shí),每個(gè)樣品DNA量取10 ng,最終上機(jī)測(cè)序濃度為20 pmol。對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾,最終獲得可供分析的優(yōu)質(zhì)序列。利用Usearch(Version 5.2.236)按照97%的相似度聚類(lèi)生成OTU(操作分類(lèi)單元,operational taxonomic)[10],與RDP(核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)項(xiàng)目,ribosomal database project)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)得到物種分類(lèi)信息,并計(jì)算每個(gè)樣品的香濃指數(shù)(Shannon index)等。利用R(Version 3.2)繪制稀釋曲線,制作群落結(jié)構(gòu)組分圖。

1.2.5 基于UniFrac的主成分(PCoA)分析 使用MUSCLE(Version 3.8.31)對(duì)所有OTU代表序列進(jìn)行多序列比對(duì)得到alignment文件,使用Mothur(Version 1.30.1)得到樣品間距離矩陣。利用UniFrac分析得到的距離矩陣可用于PCoA分析,使用R的vegan包對(duì)大曲樣品進(jìn)行PCoA分析[11-12]。

1.2.6 線性判別及影響因子(LEfSe)分析 采用軟件LEfSe(Version 1.1.0)使用非參數(shù)系數(shù)的Kruskal-Wallis sum-rank test檢測(cè)組間豐度顯著差異的特征,運(yùn)用LDA(線性判別分析,Linear discriminant analysis)估計(jì)這些差異特征對(duì)組間區(qū)別的影響大小[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序序列數(shù)目和多樣性指數(shù)分析

覆蓋率越高,則樣本中序列沒(méi)有被檢出的概率越低。由圖1及表1可知,取樣覆蓋率均超過(guò)90%以上,樣品隨著測(cè)序序列數(shù)的增加,多樣性指數(shù)(基于香濃指數(shù))曲線趨于平坦,說(shuō)明本次實(shí)驗(yàn)取樣合理,結(jié)果能代表樣本的真實(shí)情況,更多的取樣僅會(huì)產(chǎn)生少量的OTU。

表1 OTU和多樣性指數(shù)分析Table 1 OTU and diversity indexes

圖1 樣品稀釋曲線(基于香濃指數(shù))Fig.1 Rarefaction curve of samples(based on Shannon index)

根據(jù)barcode將序列按照樣品來(lái)源進(jìn)行分揀,對(duì)各樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾、去嵌合后,得到有效數(shù)據(jù)如表1所示。A組樣本測(cè)序共得到114762條序列,聚類(lèi)分析產(chǎn)生12345個(gè)分類(lèi)單元;B組樣本測(cè)序共得到74418條序列,聚類(lèi)分析產(chǎn)生7559個(gè)分類(lèi)單元。A組香濃指數(shù)普遍高于B組,不過(guò)兩組多樣性指數(shù)變化規(guī)律一致。在中期,兩組樣品細(xì)菌多樣性(基于香濃指數(shù))降到最低,而后又同時(shí)達(dá)到最大值。

2.2 大曲儲(chǔ)藏過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化分析

對(duì)樣品中物種多樣性進(jìn)行分類(lèi)分析,可以得到以下兩個(gè)信息:樣品中含有何種微生物;各微生物的相對(duì)豐度。為了展示效果,一般只顯示相對(duì)豐度前50的物種分類(lèi),剩余物種合并為“其它”。如圖2所示,在屬水平上大曲儲(chǔ)藏過(guò)程中細(xì)菌多樣性有較為明顯的差異。A組大曲儲(chǔ)藏初始階段,芽孢桿菌屬(Bacillus)及魏斯氏屬(Weissella)為優(yōu)勢(shì)菌,占比分別為29.86%和26.83%;隨著時(shí)間的推移,Bacillus和Weissella逐漸減少,比例分別降至2.25%和2.6%,而與此同時(shí)高溫放線菌屬(Thermoctinomyces)相對(duì)數(shù)量增至最大,占比為38.73%;儲(chǔ)藏末期,細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)一步調(diào)整,物種分布相對(duì)均勻,乳球菌(Lactococcus)和賽巴爾德氏菌(Sebaldella)成為主要優(yōu)勢(shì)菌,比例分別為21.54%和18.15%。其次,芽孢桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、高溫放線菌屬及Kroppenstedtia依次檢測(cè)到的比例為11.03%、8.43%、7.18%和6.17%。

圖2 各樣本在屬水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)柱狀圖Fig.2 The histogram of bacterial communities structure of all samples in the genus level

與A組相比,B組大曲儲(chǔ)藏過(guò)程中最顯而易見(jiàn)的不同是高溫放線菌一直沒(méi)有被檢測(cè)到。在該儲(chǔ)存期中,芽孢桿菌屬一直處于主要優(yōu)勢(shì)地位,儲(chǔ)藏最后階段的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為芽孢桿菌屬和乳球菌屬,占比分別是40.86%和16.68%。

2.3 基于UniFrac的主成分(PCoA)分析

如圖3所示,通過(guò)對(duì)UniFrac距離的聚類(lèi),A、B兩組樣品基本分散在了不同區(qū)域,分布規(guī)律不明顯。從儲(chǔ)藏時(shí)間推移來(lái)看,A組中大曲儲(chǔ)藏初期樣品1與樣品2距離較遠(yuǎn),說(shuō)明在這段時(shí)期內(nèi)細(xì)菌菌群變化較大,而中期樣品2和3分布在了同一象限,表明這兩個(gè)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差別不大,中期儲(chǔ)存過(guò)程相對(duì)穩(wěn)定,向后期過(guò)渡時(shí),群落結(jié)構(gòu)波動(dòng)明顯增大;B組中大曲儲(chǔ)藏前期樣品6和7距離較近,說(shuō)明這兩個(gè)群落中細(xì)菌物種獨(dú)立進(jìn)化較少,前期儲(chǔ)存過(guò)程相對(duì)穩(wěn)定,而中后期波動(dòng)較大。

圖3 不同大曲樣品細(xì)菌群落PCoA分析Fig.3 PCoA analysis of different bacterial communities based on the weighted UniFrac

2.4 線性判別及影響因子(LEfSe)分析

LEfSe分析的目的是找出對(duì)A組與B組劃分產(chǎn)生顯著性差異影響的特定微生物,它不僅注重統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,還注重生物相關(guān)性分析[14-15]。圖4中,LEfSe分析結(jié)果用LDA值(Linear Discriminant Analysis)做分布柱狀圖,其中橫軸的長(zhǎng)度代表差異物種的影響值大小,縱軸標(biāo)記的為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的細(xì)菌物種。結(jié)果顯示,共有13個(gè)差異顯著的細(xì)菌類(lèi)群。與A組大曲微生物相比,B組中差異顯著的細(xì)菌微生物分別是Cytophagales、Cytophagia、Xanthomonadales、Xanthomonadaceae、Paenibacillaceae_1、Brevibacillus、Kroppenstedtia、Thermoctinomyces和Thermoctinomycetaceae,其中高溫放線菌影響值最大;而A組中差異顯著的細(xì)菌微生物有Bacillaceae_1、Bacillus、Allobacillus和Bacillaceae_2共4類(lèi),芽孢桿菌影響值最大。

圖4 A、B兩組大曲樣品中差異特定微生物L(fēng)EfSe分析Fig.4 LEfSe analysis of differently specific microorganisms for A and B groups

3 結(jié)論

本研究采用MiSeq測(cè)序方法,對(duì)大曲樣品中細(xì)菌16S rDNA(V3～V4)進(jìn)行測(cè)序,將優(yōu)質(zhì)序列按照97%的相似度進(jìn)行聚類(lèi)分析,計(jì)算細(xì)菌類(lèi)群的相對(duì)含量,通過(guò)群落結(jié)構(gòu)柱狀圖發(fā)現(xiàn),來(lái)源于不同陳化曲庫(kù)的大曲細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)變化差異較為明顯。B組大曲中的主要優(yōu)勢(shì)菌為芽孢桿菌,它可以降解蛋白質(zhì)、淀粉等大分子物質(zhì),是濃香型大曲中不可或缺的功能細(xì)菌[16-18];B組大曲中一直未被檢測(cè)到的高溫放線菌是A組大曲儲(chǔ)藏中期的主要優(yōu)勢(shì)菌,該菌屬在系統(tǒng)進(jìn)化中接近芽孢桿菌[19],具有較強(qiáng)的耐高溫能力,常在高溫醬曲或中高溫大曲中被檢測(cè)出[20-22]。

對(duì)兩組樣本的10個(gè)樣品進(jìn)行主成分分析,可以反映不同大曲樣品在物種多樣性方面存在的差異大小,在生態(tài)學(xué)研究中具有重要意義。目前,UniFrac分析方法中,加權(quán)(weighted UniFrac)與非加權(quán)(unweighted UniFrac)的應(yīng)用非常廣泛,其中加權(quán)考慮了物種豐度,而非加權(quán)則沒(méi)有考慮物種豐度[23]。本研究采用加權(quán)計(jì)算方式分析了不同大曲細(xì)菌多樣性差異大小,發(fā)現(xiàn)與B組相比,A組樣品分布較為離散,進(jìn)行獨(dú)立進(jìn)化的細(xì)菌物種相對(duì)較多。

LEfSe分析中,LDA分布柱狀圖展現(xiàn)了兩組大曲樣品中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的微生物標(biāo)記。結(jié)合PCoA分析,由于A組大曲細(xì)菌多樣性較之B組差異較大,因此,A組中具有特征差異的細(xì)菌微生物種類(lèi)也較B組多出一半有余。其中,高溫放線菌是A組大曲儲(chǔ)存過(guò)程中的特征性微生物,芽孢桿菌則是B組大曲儲(chǔ)藏期內(nèi)的特征微生物。

綜上所述,初步推斷B組大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與生產(chǎn)工藝要求較為吻合,A組大曲在儲(chǔ)藏過(guò)程中由于受到高溫放線菌屬的活動(dòng)影響,使得芽孢桿菌的生長(zhǎng)繁殖受到了一定抑制,可能是造成其出庫(kù)曲指標(biāo)長(zhǎng)期低于A組的原因之一。車(chē)間可根據(jù)班組操作記錄,比較兩個(gè)工段的品溫及室溫變化情況,及時(shí)調(diào)整通風(fēng)排潮,為微生物的生長(zhǎng)代謝提供更為有利的環(huán)境條件。

[1]葉光斌,王彩虹,王毅,等. 清香型大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的比較分析[J]. 食品與機(jī)械,2015,31(3):11-15.

[2]王曉丹,班世棟,周鴻翔,等. 貴州省遵義地區(qū)3個(gè)醬香型大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的比較分析[J].食品科學(xué),2016,37(7):110-115.

[3]炊偉強(qiáng),敖宗華,張春林,等. 瀘州老窖大曲感官特征與微生物、理化指標(biāo)和生化性能的關(guān)聯(lián)研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2011,30(5):761-766.

[4]譚映月,胡萍,謝和. 應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)分析醬香型白酒酒曲細(xì)菌多樣性[J]. 釀酒科技,2012(10):107-111.

[5]黃曉寧,黃晶晶,李兆杰,等. 濃香型和醬香型大曲微生物多樣性分析[J]. 中國(guó)釀造,2016,35(9):33-37.

[6]王海燕. PCR-DGGE技術(shù)對(duì)清香型汾酒微生物群落結(jié)構(gòu)演變規(guī)律的研究[D]. 無(wú)錫:江南大學(xué),2014:58-78.

[7]李艷,董振玲,李佳,等.PCR-DGGE技術(shù)檢測(cè)羊羔美酒大曲中細(xì)菌多樣性[J]. 食品科學(xué),2015,36(12):142-147.

[8]趙金松,鄭佳,沈才洪,等. 基于磷脂脂肪酸分析技術(shù)的大曲微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性研究[J]. 食品工業(yè)科技,2017(1):160-164.

[9]梁晨,杜海,徐巖. 大曲貯存過(guò)程中原核微生物群落結(jié)構(gòu)及風(fēng)味成分演替規(guī)律研究[J]. 微生物學(xué)通報(bào),2017(2):384-393.

[10]EDGAR RC. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST[J].Bioinformatics，2010，26(19):2460-2461.

[11]SCHLOSS PD,WESTCOTT SL,RVABIN T,et al. Introducing mothur:Open-Source,Platform-Independent-Supported Software for Describing and Comparing Microbial Communities[J].Applied and Environmental Microbiology,2009,75(23):7537-7541.

[12]EDGAR RC. MUSCLE:multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput[J]. Nucleic Acids Research,2004,32(5):1792-1797.

[13]SEGAT N,IZARD J,WALDRON L,et al. Metagenomic biomarker discovery and explanation[J]. Genome Biology,2011,12(6):1-18.

[14]ZHANG C,LI S,YANG L,et al. Structural modulation of gut microbiota in life-long calorie-restricted mice[J]. Nat Commun,2013(4):2163.

[15]李紅梅. 基于16SrDNA高通量測(cè)序的豬舍空氣微生物檢測(cè)及其污染傳播研究[M]. 四川:四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2014:20-30.

[16]吳生文,張志剛,李旭輝. 大曲微生物在大曲酒生產(chǎn)中的研究開(kāi)發(fā)現(xiàn)狀及發(fā)展前景[J]. 中國(guó)釀造,2011(5):8-13.

[17]陳曉旭,明紅梅,羅惠波,等. 濃香型大曲中1株高液化力功能細(xì)菌的篩選與鑒定[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43(7):110-113.

[18]袁先鈴,黃丹,衛(wèi)春會(huì). 濃香型大曲中蛋白酶產(chǎn)生細(xì)菌的分離鑒定[J]. 釀酒科技,2012(9):51-53.

[19]YOON JH,PARK YH. Phylogenetic analysis of the genusThermoactinomycesbased on 16S rDNA sequences[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2000(50):1081-1086.

[20]姚粟. 芝麻香型白酒高溫大曲細(xì)菌群落多樣性研究[D].北京:北京林業(yè)大學(xué),2013:33-40.

[21]劉洋,趙婷,姚粟,等. 一株芝麻香型白酒高溫大曲嗜熱放線菌的分離與鑒定[J]. 生物技術(shù)通報(bào),2012(10):210-216.

[22]葉廣斌,王彩虹,喬曉艷,等. 超高溫大曲細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)的研究[J]. 釀酒科技,2014(4):5-7.

[23]CHANG Q,LUAN Y,SUN F. Variance adjusted weighted UniFrac:a powerful beta diversity measure for comparing communities based on phylogeny[J]. BMC Bioinformatics,2011,12(1):1-14.

Differenceanalysisofbacterialcommunity
forLuzhou-flavorDaquduringstorage

SHISi1,PENGZhi-fu1,QIAOZong-wei1,2,LIUDuo-tao1,LUOQing-chun1,TUFu-ming1

(1.Wuliangye Group Co.,Ltd.,Yibin 644007,China;2.Solid-state Fermentation Resource Utilization Key Laboratory of Sichuan Province,Yibin 644007,China)

TS262.3+1

A

1002-0306(2017)18-0151-05

2017-01-09

施思(1986-)，女，碩士，工程師，研究方向：釀酒微生物，E-mail：sstype@sina.com。

固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目(2015GTJ004)。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.029