新疆南疆地區鏈格孢的分離鑒定及抗鏈格孢乳酸菌的篩選

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(塔里木大學生命科學學院,南疆特色農產品深加工兵團重點實驗室,新疆阿拉爾 843300)

新疆南疆地區鏈格孢的分離鑒定及抗鏈格孢乳酸菌的篩選

李明楊,謝婷婷,李建,張銳利*

(塔里木大學生命科學學院,南疆特色農產品深加工兵團重點實驗室,新疆阿拉爾843300)

鏈格孢是引起果實黑斑病的主要致病菌之一,嚴重危害果實的采后貯藏過程。從新疆南疆某果園患病果實分離鏈格孢,結合形態學特征和分子生物學方法對其進行鑒定,同時從分離自新疆特色乳制品的110株乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)中篩選具有抑制鏈格孢活性的乳酸菌,并采用固態菌餅、靜態發酵及搖床發酵3種方式探索最佳的發酵方式。結果表明共分離獲得2株鏈格孢,經鑒定分別為梨黑斑鏈格孢(Alternariagaisen)和細極鏈格孢(Alternariatenuissima);篩選獲得4株對相應鏈格孢具有抑制活性的乳酸菌,其中3株為戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus),1株為副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei),同時發現搖床發酵方式所產生的代謝產物抑制鏈格孢活性相對最強,抑菌圈直徑最大可達21.17 mm。這為將乳源乳酸菌用于水果采后防治鏈格孢引起的黑斑病提供了理論依據。

黑斑病,鏈格孢,乳酸菌,抑制,發酵方式

Abstract:Alternariais one of the main pathogenic bacteria of fruit black spot and severely impairs the postharvest storage process of fruit.Alternariawas isolated from the pear and apple of a orchard in south Xinjiang and identified by morphological characteristics and molecular biological methods. 110 strains of lactic acid bacteria(LAB)from Xinjiang dairy products were performed to detect the inhibitory activity onAlternariaand solid cake,stationary and shaker broth were used for fermentation. The results showed that 2 strains ofAlternarianamedAlternariagaisenandAlternariatenuissimawere obtained. 4 strains of LAB with inhibitory activity onAlternariawere screened out and 3 of them wereLactobacilluspentosus,the other one namedLactobacillusparacasei. At the same time,the highest inhibitory activity onAlternariawas from shaker fermentation broth and the diameter of the zone of inhibition was up to 21.17 mm. It provided a theoretical basis to apply LAB from dairy products to control the black spot disease caused byAlternariain the postharvest.

Keywords:black spot disease;Alternaria;lactic acid bacteria;inhibition;fermentation methods

黑斑病是梨、蘋果、紅棗、杏、柑橘等水果的一類重要病害,該病害主要由鏈格孢(Alternariaalternata)的侵染引起[1]。鏈格孢引起的黑斑病可導致葉斑和果實組織腐爛,對梨、蘋果、紅棗、芒果等果實貯藏危害較大[2],被侵染水果果實的表皮會形成黑色斑塊,凹陷,最終導致果實腐爛,對貯藏、運輸和銷售造成影響,嚴重影響水果的食用價值和商品價值,引起巨大經濟損失[3]。

目前主要采用化學農藥對該病原菌進行防治,但是隨著人們生活水平的逐步提高,對農藥殘留危害人類健康認識的逐步深入,迫切需要非化學的、無公害的殺菌劑來防治果蔬的采后病害。同時由于病原菌耐藥性的增強,使生物法防治果蔬采后病害得到越來越多的關注[4]。生物防治作為一種效果明顯、安全無毒且成本低廉的防治病害新途徑被人們接受和重視,并成為國內外學者的研究熱點。

表1 引物序列及其擴增ITS區域的相應位點[15]Table 1 Primer sequences and sites for ITS amplification region[15]

表2 PCR反應擴增體系(50 μL)Table 2 PCR reaction amplification system(50 μL)

趙超等[5]從芒果葉片及果實上分離采后主要病原菌及其拮抗菌,發現菌株A1菌液對芒果炭疽病和蒂腐病的平均防效達到77.12%;耿海峰等[6]從土壤中分離獲得11株對冬棗細交鏈格孢病菌、多隔鐮孢霉和美澳核果褐腐串珠霉具有較好抑制作用的拮抗菌,抑菌效果最顯著的B26的抑制率高達78.8%。乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是一類產乳酸細菌的統稱,是被國際公認為安全且被歐盟食品安全局所推薦的益生菌[7]。乳酸菌能夠產生多種代謝產物并廣泛應用于抑制病原性真菌相關研究[8]。但是對于將乳源乳酸菌應用于抑制黑斑病病原菌鏈格孢的相關研究鮮有報道。

本研究從新疆南疆地區阿拉爾市某果園中的黑斑病香梨及蘋果中分離鏈格孢,同時將分離自新疆特色乳制品中的乳酸菌用于抗鏈格孢活性篩選,以期為果蔬采后保鮮提供新的技術途徑,并為無公害防治黑斑病奠定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

發病香梨和蘋果 均來自新疆南疆阿拉爾市周邊某果園;細極鏈格孢(Alternariatenuissima)CGMCC3.3546 購自中國普通微生物菌種保藏管理中心;乳酸菌 本課題組前期從新疆傳統乳制品中分離獲得的110株乳酸菌(均已鑒定)[9];MRS肉湯培養基及PDA固體培養基 北京奧博星生物技術有限公司;PCR相關試劑 均購自Takara公司;其他實驗相關試劑均為國產分析純。

Chem Doc XRS+凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司;PCR儀 德國SensoQuest;Leica DM1000顯微鏡 德國徠卡微系統有限公司;ZW-CJ-2FD無菌工作臺 博訊實業公司醫療設備廠;DNP-9082A電熱恒溫培養箱 揚州鴻都電子有限公司;PC2002電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 病原菌的分離 參照郭東起[10]及范瑛閣[11]等的方法對具有典型黑斑病癥狀的香梨和蘋果的鏈格孢進行分離。果實表皮清洗干凈后置于75%的酒精中浸泡60 s,無菌水沖洗5次,取病健接壤處組織,切成5 mm3組織放在PDA平板上,28 ℃恒溫培養5～7 d,以點植法接種分離至菌落單一。

1.2.2 病原菌的鑒定

1.2.2.1 病原菌細胞形態觀察 將分離純化獲得的病原菌接種于PDA培養基,28 ℃培養5～7 d,觀察菌落特征并于顯微鏡下觀察菌絲和孢子形態。鑒定標準參照文獻[12-13]的方法。

1.2.2.2 病原菌DNA的提取 參照白逢彥等[14]的方法并略作修改,對所分離病原菌提取總DNA,具體如下:活化所分離的病原菌至PDA平板培養基,28 ℃恒溫培養5～7 d;挑取少量菌絲體至無菌離心管,加入100 μL裂解液(100 mmol/L Tris,30 mmol/L EDTA,0.5% SDS,pH8.0),劇烈振蕩后100 ℃水浴15 min;加入100 μL、2.5 mol/L的醋酸鉀,冰浴0.5～1 h;4 ℃、13000 r/min離心5 min,上清加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1),12000 r/min離心15 min;上清加入等體積預冷的異丙醇,-20 ℃靜置15 min;12000 r/min離心15 min,收集DNA沉淀,100 μL 70%的乙醇洗滌沉淀后自然晾干;加入50 μL TE溶解DNA,-20 ℃冷藏備用。

1.2.2.3 PCR擴增及鑒定 rDNA-ITS序列擴增的引物序列(表1)及PCR反應體系(表2)如下。

PCR反應程序:第一步,95 ℃預變性4 min;第二步,94 ℃變性30 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,共35個循環;第三步,72 ℃延伸10 min后,4 ℃保存。

PCR擴增結束后,120 V電泳30 min,EB染色,凝膠成像系統成像,將擴增出較亮目的條帶的菌株送上海生工測序分析,測序結果用DNAMAN進行編輯,然后將所獲得的基因序列提交至NCBI,與Genebank中的序列進行同源性比對(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/),將比對結果作為菌株最終的鑒定結果,同時采用MEGA建立系統進化樹,對所用鏈格孢進行系統發育分析。

1.2.3 乳酸菌的活化及不同發酵方式對乳酸菌抗鏈格孢活性的影響 將110株乳酸菌分別接種至MRS培養基進行活化,37 ℃培養48 h至MRS平板長出單菌落,挑取單菌落接入MRS液體培養基,37 ℃過夜培養,為乳酸菌母液。分別采用固態菌餅、靜態發酵及搖床發酵3種發酵方式,獲取發酵產物,從中篩選具有抗鏈格孢活性的乳酸菌。

1.2.3.1 固態發酵 取30 μL乳酸菌母液至MRS固體平板中,涂布均勻,37 ℃培養48 h。

1.2.3.2 靜態發酵 取相同乳酸菌母液按1∶100比例加入裝有10 mL MRS液體培養基的三角瓶中,37 ℃靜置培養48 h。

1.2.3.3 搖床發酵 取相同乳酸菌母液按1∶100比例加入裝有10 mL MRS液體培養基的三角瓶中,37 ℃,185 r/min搖床培養48 h。

1.2.3.4 乳酸菌抗鏈格孢活性研究 無菌條件下挑取新鮮鏈格孢孢子至無菌水中,鏡檢懸浮液中孢子情況,制成106個孢子/mL的孢子懸浮液,移取100 μL孢子懸浮液至PDA平板,涂布均勻后用打孔器打孔(直徑6 mm);分別移取乳酸菌固態發酵菌餅、100 μL乳酸菌靜態發酵產物及100 μL乳酸菌搖床發酵產物至PDA平板相應孔中,PDA平板置于28 ℃恒溫培養4～5 d,觀察鏈格孢長勢及抑菌圈的形成情況,測量各組抑菌圈直徑。每組實驗設置重復平行3個,設置空培養基為空白對照。

1.2.4 數據分析 對所得實驗結果采用SPSS 22進行單因素ANOVA統計分析。

2 結果與分析

2.1 鏈格孢的分離及顯微觀察

果實黑斑病發病癥狀:黑斑病是香梨或蘋果等水果在貯藏6個月左右開始發病的。發病期持續時間較長,發病較緩慢。癥狀:首先是果皮出現黑褐色斑點和表皮組織開始褐變硬化并收縮,從果皮蔓延到核心,最后呈現黑色棕色凹形。

致病菌菌落形態:黑斑病病原菌在PDA培養基上菌絲生長較慢,28 ℃培養5～7 d,菌落形態為黑色橢圓狀,菌絲灰色至黑色(圖1,兩株鏈格孢菌落形態相同),菌落底部為黑色。

圖1 香梨鏈格孢Ap1菌落形態Fig.1 The colony morphology of the Alternaria(Ap1)from pear

共分離獲得2株病原菌,根據來源分別暫命名為香梨鏈格孢(Ap1)和蘋果鏈格孢(Am1),對所分離獲得致病菌進行光學顯微鏡觀察,結果如圖2。可以明顯看出其孢子呈卵形、手榴彈狀,單生或簇生等形態。

圖2 香梨鏈格孢Ap1(A)和蘋果鏈格孢Am1(B)微觀結構觀察Fig.2 The micro structure of the Alternaria from pear(Ap1,A)and apple(Am1,B)

2.2 鏈格孢的分子生物學鑒定

分別對所分離獲得的2株鏈格孢進行分子生物學鑒定,采用A.tenuissimaCGMCC3.3546作為對照。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測,3株鏈格孢的rDNA-ITS序列大小在600 bp左右,結果如圖3所示。

圖3 3株鏈格孢rDNA-ITS序列擴增結果Fig.3 The rDNA-ITS sequence amplification results of 3 Alternaria strains注:1:A. Tenuissima CGMCC3.3546 rDNA-ITS序列條帶;2:蘋果鏈格孢Am1 rDNA-ITS序列條帶;3:香梨鏈格孢Ap1 rDNA-ITS序列條帶；M：marker。

將分離獲得的Ap1及Am1的ITS區rDNA基因部分序列與NCBI基因數據庫進行比對分析,序列通過Clustal X軟件進行排列,利用MEGA 6.0以及Neighbor-Joining法構建系統發育進化樹(圖4)。從圖4所示系統發育分析結果中可以看出,菌株Ap1與梨黑斑鏈格孢(Alternariagaisen)在同一分支,而Am1與A.tenuissimaCGMCC3.3546及細極鏈格孢(Alternariatenuissima)在同一分支,結合序列比對結果,Ap1與梨黑斑鏈格孢、Am1與細極鏈格孢相似性均在99%以上。

圖4 所分離鏈格孢的系統發育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of isolated Alternaria

表3 不同發酵方式對乳酸菌(LAB)抗鏈格孢效果的影響Table 3 Effects of different fermentation methods on the resistance of LAB against Alternaria

注:結果表示為平均值±標準差;同行字母不同表示差異顯著(p<0.05)。真菌鑒定的主要方法為形態學鑒定和分子生物學鑒定[16],從以上形態學和分子生物學結果均表明:Ap1為梨黑斑鏈格孢(A.gaisen),Am1為細極鏈格孢(A.tenuissima)。所分離2株鏈格孢分別代表不同的鏈格孢菌種,實驗具有一定的實際指導意義。

2.3 抗鏈格孢乳酸菌的篩選及不同發酵方式對乳酸菌抗鏈格孢活性的影響

分別以A.tenuissimaCGMCC 3.3546、A.gaisenAp1及A.tenuissimaAm1為靶標,采用固體發酵、靜態發酵及搖床發酵3種不同的發酵方式對110株乳酸菌發酵產物抑制鏈格孢活性檢測。共獲得4株對不同靶標菌株有抑制活性的乳酸菌(表3),乳酸菌68(LAB 68)、乳酸菌86(LAB 86)、乳酸菌91(LAB 91)對A.tenuissimaCGMCC 3.3546具有較好的抑菌活性,結果如圖5所示。LAB 68、乳酸菌37(LAB 37)對A.tenuissimaAm1具有較好的活性,結果如圖6所示。LAB 86對A.gaisenAp1具有明顯的抑菌活性,結果如圖7所示。其中LAB 68、LAB 86、LAB 91為戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus),LAB 37為副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)。以上結果說明不同的乳酸菌代謝產物對不同的鏈格孢菌株的抑菌活性各不相同。同時,分別對比固態發酵、靜態發酵及搖床發酵的發酵產物活性,從表3中可以看出,不同的發酵方式對乳酸菌的抗鏈格孢活性有顯著影響(p<0.05)。固態發酵菌餅的抗鏈格孢活性顯著低于靜態發酵組和搖床發酵組(p<0.05),并且靜態發酵組的抑菌圈直徑顯著低于搖床發酵組(p<0.05),搖床發酵組的抑菌圈直徑最大為21.17 mm。圖5～圖7中可以明顯看出搖床發酵組(3)的抑菌圈直徑明顯大于其他兩組。PDA平板上的鏈格孢長勢均勻,抑菌圈明顯(白色部分即為抑菌圈)。

圖5 不同發酵方式及不同乳酸菌發酵產物的抗A. tenuissima CGMCC3.3546活性Fig.5 The inhibitory activity on A. tenuissima CGMCC3.3546 of fermentation products from different lactic acid bacteria with different fermentation methods注:1:固態發酵菌餅,2:靜態發酵液,3:搖床發酵液,圖6、圖7同;A:LAB 86;B:LAB 91;C:LAB 68。

圖6 不同發酵方式及不同乳酸菌發酵產物的抗A.tenuissima Am1活性Fig.6 The inhibitory activity on A.tenuissima Am1 of fermentation products from different lactic acid bacteria with different fermentation methods注:A:LAB 68;B:LAB 37。

圖7 不同發酵方式對LAB 86發酵產物的抗A. gaisen Ap1活性的影響Fig.7 The inhibitory activity on A. gaisen Ap1 of fermentation products from lactic acid bacteria 86 with different fermentation methods

3 討論

許多學者對鏈格孢的致病性進行了報道研究。郝莉花等[17]對紅棗干果貯藏期間的真菌病害進行了深入研究,指出紅棗因真菌病害侵染而導致的腐爛率達到30%以上,鏈格孢(Alternariaspp.)是紅棗干果貯藏期的優勢病原菌,也是引起紅棗鮮果病害的主要病原菌。常有宏等[18]采用噴霧及涂抹法對梨接種黑斑病病原菌,得出此病原菌很容易使梨患病的結論,同時獲得了病原菌侵染的最適條件并指出梨黑斑病病原菌致病性的強弱可能與其產生色素有關。本研究分別從新疆南疆本地區果園采集的香梨和蘋果上分離獲得了一株鏈格孢,并鑒定為梨黑斑鏈格孢(A.gaisen)和細極鏈格孢(A.tenuissima),這對于本地區的針對性防治黑斑病病害起到了一定的指導和鑒別作用。

蔡文韜等[4]從柿子椒中分離獲得了一株黏質紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)具有較好的抑制鏈格孢的活性,該菌株發酵液的75%乙醇沉淀物和乙酸乙酯提取物對鏈格孢產孢、萌發和菌絲的生長等方面都具有較好的抑菌效果,并且發現將其應用于辣椒和番茄采后防腐保鮮方面也具有一定的效果,能夠大大降低果蔬的腐爛率。郭東起等[10]對新疆南疆地區引起駿棗黑斑病的病原菌進行了分離鑒定,并篩選出10株具有較好抑制鏈格孢的酵母菌,為防治紅棗黑斑病提供了理論依據。乳酸菌的抗真菌活性也已被多位學者證實,如副干酪乳桿菌(L.paracasei)能夠抑制層生鐮刀菌(Fusariumproliferatum)和禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)[19];Rouse S等[20]從麥芽中分離的戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)可抑制擴展青霉(Penicilliumexpansum)等。本研究中所篩選出的4株乳酸菌分別為戊糖乳桿菌(L.pentosus)和副干酪乳桿菌(L.paracasei),均分離自新疆傳統乳制品,并且LAB 86對A.tenuissimaCGMCC3.3546的抑菌圈直徑為21.17 mm,明顯高于耿海峰等[6]所分離獲得的抗鏈格孢乳酸菌的抑菌活性,表明新疆牧區極為豐富的民族特色乳制品蘊藏著眾多的乳酸菌資源,這為乳酸菌防治鏈格孢提供了物質基礎。

乳酸菌抗真菌活性物質種類繁多,不同乳酸菌產生的抗菌物質不同,即使同一株乳酸菌在不同的發酵條件下所產生的活性物質種類也有明顯差異。從本研究中即可看出,對于同一株乳酸菌,搖床發酵組的抗鏈格孢活性相對最強,推測可能原因是抗鏈格孢活性產物的產生與乳酸菌培養過程中的氧供應有密切聯系,搖床發酵使乳酸菌與氧氣的接觸面積增大,這為乳酸菌的生長和活性產物的產生提供足量的氧氣供應。對于乳酸菌的抗真菌活性物質,有多位學者對現已知的不同乳酸菌產生的主要抗真菌物質進行了系統闡述[8,21],這類物質主要包括有機酸(例如乳酸及醋酸等)、雙乙酰、過氧化氫、苯乳酸、蛋白類物質、羅伊氏菌素、羥基脂肪酸、環狀肽等。關于乳酸菌對真菌毒素的抑制機制目前主要集中在3個方面:一是乳酸菌的代謝產物對真菌菌株的抑制;二是乳酸菌在生長過程中產生了抑制復合物,可抑制毒素的合成,同時降解已產生的毒素;三是真菌毒素與乳酸菌細胞壁之間的物理結合效果[22-23]。但是由于不同活性物質之間存在著普通而復雜的協同作用關系,因此很難精確地闡明乳酸菌的抗菌作用機制,目前的研究主要是在生物體外直接分離鑒定具有抗菌作用的活性物質。這也將是本研究后續的主要研究內容,探明所篩選4株乳酸菌體外抑制鏈格孢的活性物質并對其進行分離鑒定,為進一步實現生物防治鏈格孢引起的果實黑斑病提供技術支持。

4 結論

從新疆南疆阿拉爾市某果園的黑斑病香梨和蘋果上分離獲得2株鏈格孢病原菌,經形態觀察及分子生物學鑒定分別為梨黑斑鏈格孢(A.gaisen)和細極鏈格孢(A.tenuissima),這也再次證明鏈格孢是引發水果黑斑病的主要致病菌之一。

以所分離的2株鏈格孢及1株鏈格孢標準菌株為靶標,從課題組前期分離自新疆傳統民族特色乳制品的110株乳酸菌中篩選抑制鏈格孢活性的乳酸菌,結果獲得了4株對相應鏈格孢有抑制活性的乳酸菌,分別為戊糖乳桿菌(LAB 68、LAB 86和LAB 91)和副干酪乳桿菌(LAB 37),可作為后續乳酸菌抗真菌活性物質的深入研究的菌株材料。

搖床發酵所獲得的發酵產物具有更好的抑菌活性,為后續相關活性菌株發酵條件的優化提供前期研究基礎。

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IdentificationoftheAlternariaandscreeningofthelacticacidbacteriaagainstAlternariainsouthXinjiang

LIMing-yang,XIETing-ting,LIJian,ZHANGRui-li*

(College of Life Sciences of Tarim University,Production & Construction Group Key Laboratory of Special Agricultural Products Further Processing in Southern Xinjiang,Tarim University,Alar 843300,China)

TS201.3

A

1002-0306(2017)18-0145-06

2017-02-27

李明楊(1986-)，女，碩士研究生，研究方向：農產品貯藏與加工，E-mail：lmy564181@163.com。

*通訊作者:張銳利(1975-)，男，碩士，副教授，研究方向：農產品貯藏與加工，E-mail：zrl_p@sina.com。

新疆生產建設兵團應用基礎研究計劃(2015AG003)；新疆維吾爾族自治區科技攻關計劃(2016AB009)。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.028