抑菌活性乳酸菌的篩選及其抑菌物質的提取條件優化

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(內蒙古農業大學食品科學與工程學院,內蒙古呼和浩特 010018)

抑菌活性乳酸菌的篩選及其抑菌物質的提取條件優化

雙全,折米娜,薄禮娟

(內蒙古農業大學食品科學與工程學院,內蒙古呼和浩特010018)

從內蒙古東部地區發酵酸菜中分離的乳酸菌為供試菌株,以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌進行了抑菌活性篩選,并檢測其抑菌譜。通過單因素和L9(34)正交實驗確定抑菌活性物質的最佳提取條件,并應用于市售牛飼料中檢測其抑菌效果。結果表明,在發酵酸菜中分離的14株供試乳酸菌中獲得了1株抑菌活性較強且穩定的菌株S1-4,該菌株對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別達(19.69±0.71) mm和(20.59±0.26) mm,并呈現出較廣的抑菌譜。菌株S1-4產抑菌活性物質的最佳提取條件:沉淀pH為5.0,乙醇濃度95%,沉淀時間8 h,料液比為1∶4 (v∶v),在此條件下,抑菌圈直徑為39.53 mm,提高了23.18%。菌株S1-4發酵液添加到牛飼料中,可抑制飼料中細菌和霉菌的生長,并且隨添加量的增加,抑菌效果明顯增加。

乳酸菌,抑菌活性,抑菌物質,提取,飼料

Abstract:Screening on lactic acid bacteria with antibacterial activity,isolated from fermented pickle in eastern Inner Mongolia,was tested forEscherichiacoliandStaphylococcusaureusas the indicator,and its antibacterial spectrum was tested. The optimum separation conditions of antibacterial substances were determined by single factor and L9(34)orthogonal test,and detected antibacterial effect in commercial cattle feed. The result showed that the strain S1-4 had strong and stable antibacterial activity in 14 strains of lactic acid bacteria,and the diameter of inhibition zone of strain S1-4 toEscherichiacoliandStaphylococcusaureuswas(19.69±0.71) mm and(20.59±0.26) mm,respectively,and showed broad antimicrobial spectrum. The optimal extraction conditions for the antibacterial substances from strain S1-4 were as follows:the precipitation of pH was 5,the concentration of ethanol was 95%,the settling time was 8 h,and the ratio of material to liquid was 1∶4 (v∶v). In these conditions,the diameter of the inhibition zone was 39.53 mm,and increased by 23.18%. The fermentation broth of strain S1-4 was added to the cattle feed,which could inhibit the growth of bacteria and mould in feed,and with the increase of the dosage,the inhibitory effect increased obviously.

Keywords:lactic acid bacteria;antibacterial activity;antimicrobial substances;extract;feed

乳酸菌是動物胃腸道的益生菌群,代謝可產生細菌素、有機酸、雙乙酰、過氧化氫等多種天然抑菌活性物質[1-2]。這些抑菌物質不但不會破壞食品的風味和口味,而且可以抑制病原菌和腐敗菌的生長,延長保質期和貨架期。其中,起主要作用的是乳酸菌所產生的細菌素,具有一定的熱穩定性,易被人體消化道的部分蛋白酶分解,而且不能在人和動物的體內蓄積引發不良發應,能有效抑制大腸桿菌和沙門氏菌的生長[3],被認為是一種具有廣闊應用前景的天然飼料添加劑和食品防腐劑[4]。

因乳酸菌細菌素是具有蛋白質特性的一種蛋白質類或是小分子的多肽類物質。所以,可以采用分離蛋白質方法對細菌素進行提取分離[5]。常用的方法有:有機溶劑沉淀法、鹽析法、選擇性沉淀法[6-8]和pH吸附釋放法[9]。一般還可以采用硫酸銨逐級鹽析法[10],從而達到更好的分離效果。Enterocin P[11]、Bacteriocin L23[12]和Lacticin NK34[13]等細菌素都是以硫酸銨沉淀開始,最后得到成分較為均一的細菌素純品。李亞玲等[14]利用pH吸附方法對乳酸片球菌產生的細菌素進行了分離純化。Janes等[15]比較用吸附劑稻殼灰(RHA)和硅酸(SA)吸附包括nisin、leucocinBC2等細菌素的效果。

在國內外關于細菌素特性研究的報道較多[16-19],但關于細菌素及其在飼料貯藏中的具體應用研究實例報道較少見。陳秀金[20]等從自制酸奶、市售散裝腌菜和袋裝榨菜中分離篩選出5株具有較高抑菌活性的乳酸菌菌株,劉陽[21]等以泡菜為原材料,經稀釋涂布平板法分離、平板劃線法純化、牛津杯法篩選得到4株有較好抑菌性能的乳酸菌。本文從內蒙古東部地區傳統發酵食品中分離的乳酸菌為供試菌,篩選出具有抑菌活性的乳酸菌,并通過單因素和正交實驗確定乳酸菌產抑菌物質的最佳提取條件。再探討該菌株在牛飼料貯藏中的抑菌效果,為今后天然防腐劑的開發拓寬思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試菌株:14株乳酸菌 分離自內蒙古東部地區傳統發酵酸菜汁中[21];指示菌株:大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC25922,沙門氏菌(Salmonella)CMCC50115,鼠傷沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)NBRC12529,綠膿假單胞桿菌(Pesudomonasaeruginosa)NBRC3080,熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)CGMCC1.1802,腸沙門氏菌腸亞種(Salmonellaentericasubsp. enterica)CGMCC1.1859,枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)HMO1,單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)54001,金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)IID1677、IID3060,蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)AS1.1846,黑曲霉(Aspergillusniger),根霉(Rhizopus) 由內蒙古農業大學微生物實驗室保存;牛飼料 采購于呼和浩特市蒙豐飼料有限責任公司,主要成分:秸稈生物飼料、食鹽、玉米粉、貝殼粉、麩皮、豆餅等;供試菌株培養基:脫脂乳培養基[22]、MRS液體培養基[23];指示菌培養基:LB液體培養基、PDA培養基[24];抑菌活性檢測培養基:水瓊脂培養基、營養瓊脂培養基 配制方法見參考文獻[25]。

W-CJ-2D雙人單面垂直凈化工作臺 蘇州智凈凈化設備有限公司;HPS-250生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;SX-500高壓滅菌鍋 德國Tomy公司;OHAUS EX623電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司;PHS-25型數顯酸度計 杭州雷磁分析儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株發酵上清液及指示菌的制備 將各供試菌株按體積分數2%接入MRS液體培養基中,37 ℃發酵24 h,離心(8000 r/min、10 min)取上清液,用0.22 μm微孔濾菌器過濾,得到菌株發酵上清液,4 ℃冷藏待用。

將作為指示菌的各細菌按體積分數2%接種于LB肉湯培養基中,37 ℃培養24 h,培養至二代,4 ℃冷藏待用。

將霉菌接種在PDA斜面培養基上,在28 ℃培養箱內培養4 d后,加入一定量的無菌生理鹽水,刮取斜面上的孢子,振蕩,然后將含有霉菌孢子的無菌生理鹽水通過無菌紗布過濾以除去菌絲殘體,調節孢子懸液濃度在105孢子/mL左右,4 ℃冷藏待用[26]。

1.2.2 抑菌活性的測定 采用雙層瓊脂擴散法[27],先以1%的無菌瓊脂水溶液在培養皿底層打底,待瓊脂凝固后均勻擺放牛津杯,再倒20 mL帶有指示菌的固體培養基,待培養基凝固后取牛津杯,在其形成的孔內加0.2 mL各供試菌發酵上清液,在37 ℃培養24 h后測其抑菌圈直徑。

1.2.3 菌株S1-4產抑菌物質的抑菌譜 選用實驗室保存的革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌及霉菌作為指示菌,采用雙層瓊脂擴散法測定菌株S1-4對各指示菌的抑菌作用,以確定其抑菌譜。

1.2.4 菌株S1-4產生抑菌活性物質的提取 采用pH吸附釋放法、硫酸銨沉淀法、乙醇沉淀法,對菌株S1-4發酵所產生的抑菌活性物質進行提取。

1.2.4.1 pH吸附釋放法 參照乳酸菌細菌素分離粗提的文獻[28]方法,將吸附pH設定為5.0,解析pH設定為7.0。用NaOH(5 mol/L)溶液將菌株S1-4發酵液的pH調至為5.0,使細菌素吸附在菌體細胞上進行吸附,離心收集菌體細胞(10 mL),用與吸附pH相同的磷酸鈉緩沖液洗細胞1～2次,重懸于20 mL的NaCl(0.1 mol/L)溶液中,用5%的磷酸調至pH為7.0,進行振蕩解析,離心收集上清,用0.22 μm微孔濾菌器濾菌,分別收集解析液和沉淀物。

1.2.4.2 硫酸銨沉淀法 將菌株S1-4依照1.2.1中方法制備發酵上清液,緩慢加入硫酸銨細末于上清液中,使其達到60%的飽和度[29],置于4 ℃環境過夜,分別取離心上清液和沉淀物備用。

1.2.4.3 乙醇沉淀法 將菌株S1-4依照1.2.1中方法制備發酵上清液,將菌株發酵上清液在4 ℃下與料液比為1∶4的乙醇混合,沉淀4 h,離心取其上清液,沉淀物收集備用,上清液經旋轉蒸發除掉乙醇備用。

將以上三種方法所得上清液和沉淀物調pH至5.0,以大腸桿菌NBRC3301為指示菌,分別測定其抑菌圈直徑。

1.2.5 基于單因素實驗的菌株S1-4產生抑菌物質提取條件的優化

1.2.5.1 不同沉淀pH對分離提取液抑菌活性的影響 采用乙醇沉淀法,將菌株S1-4發酵上清液pH分別調至4.0、5.0、4.5、5.0、5.5、6.0,以料液比為1∶4與95%乙醇于4 ℃環境下沉淀4 h,離心取其上清液,旋轉蒸發除掉乙醇,所得提取液以大腸桿菌NBRC3301作為指示菌,測量抑菌圈直徑,確定其抑菌能力。

1.2.5.2 不同乙醇濃度對分離提取液抑菌活性的影響 采用乙醇沉淀法,將菌株S1-4發酵上清液的pH調至5.0,以料液比為1∶4分別與濃度為20%、40%、60%、80%和95%的乙醇于4 ℃環境下沉淀4 h,離心取其上清液,旋轉蒸發除掉乙醇,所得提取液以大腸桿菌NBRC3301作為指示菌,測量抑菌圈直徑,確定其抑菌能力。

1.2.5.3 不同沉淀時間對分離提取液抑菌活性的影響 采用乙醇沉淀法,將菌株S1-4發酵上清液的pH調至5.0,以料液比為1∶4與95%的乙醇于4 ℃環境下沉淀2、4、6、8、10 h,離心取其上清液,旋轉蒸發除掉乙醇,所得提取液以大腸桿菌NBRC3301作為指示菌,測量抑菌圈直徑,確定其抑菌能力。

1.2.5.4 不同料液比對分離提取抑菌活性的影響 采用乙醇沉淀法,將菌株S1-4發酵上清液的pH調至5.0,與料液比分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5 (v∶v)的95%乙醇于4 ℃環境下沉淀4 h,離心取其上清液,旋轉蒸發除掉乙醇,所得提取液以大腸桿菌NBRC3301作為指示菌,測量抑菌圈直徑,確定其抑菌能力。

1.2.6 基于正交實驗的菌株S1-4產生抑菌物質提取條件的優化 菌株S1-4的抑菌物質活性以乙醇沉淀法為基礎進行單因素實驗,通過對沉淀pH、乙醇濃度、料液比和沉淀時間進行四因素三水平的L9(34)正交實驗,獲取最優提取方法。正交實驗因素水平見表1。

表1 正交實驗因素水平設計Table 1 The factors and level of orthogonal experiment design

1.2.7 菌株S1-4在飼料中的應用 將菌株S1-4發酵液按0%、2%、5%、7%和10%的比例添加到市售牛飼料中,對照組添加同體積MRS液體培養基,在室溫(18～25 ℃)條件下進行貯藏,分別按GB13093-91《飼料中細菌總數的測定方法》和GB13092-91《飼料中霉菌檢驗方法》測定各組飼料第0、3、7、14、21和30 d的細菌總數和霉菌總數。

1.3 數據處理

通過Origin軟件進行數據統計并作圖,應用SPSS軟件對正交表進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的抑菌活性篩選

將14株乳酸菌作為供試菌株,以大腸桿菌NBRC3301和金黃色葡萄球菌IID1677為指示菌,初篩結果如表2所示。

表2 供試乳酸菌的抑菌活性篩選結果Table 2 Screening on antibacterial activity of lactic acid bacteria

注:-:抑菌圈直徑≤8 mm,表示沒有抑菌效果。

由表2可知,對大腸桿菌(Escherichiacoli)NBRC3301和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)IID1677指示菌均有抑菌活性的菌株有8株,經實驗發現菌株S1-4發酵液的抑菌活性較強且穩定,對指示菌的抑菌圈直徑分別達(19.69±0.71) mm和(20.59±0.26) mm。因此選擇S1-4作為后續實驗菌株。

2.2 菌株S1-4的抑菌譜

菌株S1-4的發酵液對各指示菌的抑菌能力,結果見表3。

由表3可知,空白實驗組的MRS液體培養基抑菌圈直徑均小于8 mm,說明MRS液體培養基本身無抑菌作用。菌株S1-4發酵上清液中的抑菌物質對所有供試指示菌的抑菌圈直徑均大于11 mm,不僅對枯草芽孢桿菌、單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌等革蘭氏陽性菌有抑制作用,對大腸桿菌、沙門氏菌、鼠傷沙門氏菌、綠膿假單胞桿菌、熒光假單胞菌、腸沙門氏菌腸亞種等革蘭氏陰性菌及黑曲霉和根霉也有較明顯的抑菌效果。這與張艾青[30]等所研究的結果相接近。因此,認為菌株S1-4發酵上清液中的抑菌活性物質具有較廣的抑菌范圍,為將來的開發應用提供了可能性。經16S rDNA序列分析,菌株S1-4鑒定為戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus,相似度99.7%)[19]。菌株S1-4發酵上清液中的抑菌活性物質對大腸桿菌NBRC3301抑菌圈直徑最大,達(13.77±0.85) mm,故將大腸桿菌NBCR3011作為后期各項實驗的指示菌。

2.3 菌株S1-4的抑菌活性物質的提取

將三種提取方法所制得的上清液和沉淀溶解液進行雙層瓊脂擴散法抑菌實驗,其抑菌效果如表4所示。

表4 不同提取方法所得分離液的抑菌能力Table 4 Antibacterial ability of separation phase isolated by different extraction methods

表3 菌株S1-4的抑菌譜Table 3 Antimicrobial spectra of strain S1-4

由表4可知,菌株S1-4的抑菌活性物質經pH吸附釋放法獲得的上清液與沉淀溶解物的抑菌圈直徑很小,可見此方法對該抑菌活性物質的提取效果不好。硫酸銨沉淀法所得上清液與沉淀物中都具有一定的抑菌活性,二者的抑菌能力比較接近,可見硫酸銨沉淀法能夠提取出該抑菌活性物質,但對該抑菌活性物質的提取效果不明顯。菌株S1-4發酵液經乙醇沉淀法所得上清液的抑菌圈直徑為(32.09±0.20) mm,沉淀物的抑菌圈直徑為(8.34±0.53) mm,上清液和沉淀溶解液的抑菌圈直徑相差很大,這說明乙醇沉淀法能夠較好的提取出該抑菌活性物質。因此,采用乙醇沉淀法對該抑菌活性物質進行提取。

2.4 菌株S1-4的抑菌活性物質提取條件的優化

2.4.1 沉淀pH對分離提取液抑菌活性的影響 由圖1可知,當沉淀pH為5.0時,該抑菌活性物質的抑菌能力較好。推測原因可能是沉淀pH為5.0時,細菌素能夠較好的吸附在細胞上,促進了與靶細胞的結合,這可能與細菌素的抑菌機理有關[29,31]。菌株S1-4大部分抑菌活性物質并沒有被沉淀出來,仍然溶解于乙醇溶劑中。故選定沉淀pH為5.0為菌株S1-4的抑菌活性物質的最佳提取pH。

圖1 不同沉淀pH所得分離提取液的抑菌能力Fig.1 The inhibition ability of different extracts obtained under different precipitation pH

2.4.2 乙醇濃度對分離提取液抑菌活性的影響 由圖2可知,隨著乙醇濃度的增加,被分離提取出的抑菌活性物質的抑菌能力增強,當乙醇濃度為95%時,該抑菌活性物質的抑菌能力最強。這可能是由于隨著乙醇濃度的增加抑菌活性物質的提取率提高,當乙醇濃度達到95%時,大部分的抑菌活性物質被抽提在乙醇層中。故選定濃度為95%的乙醇為菌株S1-4的抑菌活性物質的最佳提取乙醇濃度。

圖2 不同乙醇濃度所得分離提取液的抑菌能力Fig.2 The antibacterial ability of the extract under different ethanol concentration

2.4.3 沉淀時間對分離提取液抑菌活性的影響 由圖3可知,隨著沉淀時間的延長,該抑菌活性物質的抑菌能力逐漸增強,而沉淀時間過長可能會破壞該抑菌活性物質的結構。當沉淀時間達到6 h后,大部分抑菌活性物質仍然存在于乙醇溶劑中,且其結構未被破壞,經旋轉蒸發除去乙醇,達到提取目的。故選定沉淀6 h為菌株S1-4的抑菌活性物質的最佳提取時間。

圖3 不同沉淀時間所得分離提取液的抑菌能力Fig.3 The antibacterial ability of the extract under different precipitation time

2.4.4 料液比對分離純化抑菌活性的影響 由圖4可知,當料液比為1∶4時,被分離提取出的抑菌活性物質的抑菌能力較好。原因可能是隨著料液比的增大,提取液中除抑菌活性物質外的其他物質與乙醇充分相互作用被沉淀出,而大部分抑菌活性物質未被沉淀仍然溶解于乙醇溶劑中,除去乙醇,達到提取目的。故選定料液比為1∶4作為菌株S1-4的抑菌活性物質的最佳提取料液比。

表6 菌株S1-4抑菌物質對飼料中細菌總數的影響Table 6 Effect of antibacterial substance of strain S1-4 on total bacterial count in feed

圖4 不同料液比所得分離提取液的抑菌能力Fig.4 The antibacterial activity of different extracts under different liquid to liquid ratio

2.4.5 正交實驗 實驗結果見表5,極差R大小表明各因素對菌株S1-4產抑菌物質提取的影響程度,即沉淀pH>乙醇濃度>料液比>沉淀時間。菌株S1-4的抑菌物質的乙醇沉淀法提取最佳條件是A2B3C3D2,即沉淀pH為5.0,乙醇濃度95%,沉淀時間8 h,料液比為1∶4。在此條件下,菌株S1-4產抑菌物質的抑菌圈直徑為39.53 mm,比優化前(32.09 mm)提高了23.18%。

表5 菌株S1-4產抑菌物質的提取條件的正交實驗方案及結果Table 5 Orthogonal array design with experimental results for optimization of separation condition

2.5 菌株S1-4在飼料中的應用

2.5.1 貯藏不同時間細菌總數變化 菌株S1-4發酵液按不同比例添加到市售牛飼料中,在室溫下貯藏不同時間的細菌總數的變化情況見表6。

由表6可知,添加MRS的飼料細菌總數大于添加菌株S1-4發酵液的飼料細菌總數。可能是因為注入MRS的飼料中營養物質多,為微生物創造了適宜的生長環境,細菌總數隨著飼料貯藏時間的延長而逐漸增加,而添加菌株S1-4發酵液的飼料細菌總數增長緩慢,可能是菌株S1-4在發酵過程中產生了具有抑制細菌生長的活性物質,并隨著添加菌株S1-4發酵液的比例增大,飼料中抑制細菌效果越明顯。

2.5.2 貯藏不同時間霉菌總數變化 菌株S1-4發酵液按不同比例添加到市售牛飼料中,在室溫下貯藏不同時間的霉菌總數的變化情況見表7。

由表7可知,隨著室溫貯藏時間的延長,對照組飼料由顆粒細小、顏色均勻、感官指標較好逐漸變為顏色變淺發白、結塊、長毛并且伴有發黑跡象。而添加不同濃度菌株S1-4發酵液的實驗組,結塊和長毛現象出現的比對照組延緩,且添加濃度越大,出現結塊現象就相對越輕。這說明在飼料中添加菌株S1-4發酵液可抑制飼料中霉菌的生長,并且隨著菌株S1-4發酵液添加濃度的增加,抑菌效果也明顯。

表7 菌株S1-4抑菌物質對飼料中霉菌總數的影響Table 7 Effect of antibacterial substance of strain S1-4 on mold count in feed

3 結論

從內蒙古東部地區發酵酸菜中分離的14株乳酸菌中以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌檢測結果,對兩株菌均有抑菌活性的菌株有8株,其中菌株S1-4發酵液的抑菌活性較強且穩定,其抑菌圈直徑分別達(19.69±0.71) mm和(20.59±0.26) mm。菌株S1-4發酵上清液的抑菌物質對革蘭氏陽性菌和陰性菌均明顯的抑菌效果,呈現出較廣的抑菌譜。通過單因素和正交實驗結果表明,菌株S1-4產抑菌活性物質的最佳提取條件為:沉淀pH為5.0,乙醇濃度95%,沉淀時間8 h,料液比為1∶4 (v∶v)。在此條件下,菌株S1-4產抑菌物質的抑菌圈直徑為39.53 mm,比優化前提高了23.18%。菌株S1-4發酵液按不同比例添加到飼料后,可抑制飼料中細菌和霉菌的生長,并且隨著菌株S1-4發酵液添加量的增加,抑菌效果明顯增加。

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Screeningoflacticacidbacteriawithantibacterialactivityandoptimizationofextractionconditionsofantimicrobialsubstances

SHUANGQuan,SHEMi-na,BOLi-juan

(College of Food Science and Engineering,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China)

TS201.3

A

1002-0306(2017)18-0105-07

2017-02-27

雙全(1964-)，男，博士，教授，研究方向：食品科學，E-mail：shungquan688@126.com。

國家自然科學基金(31460443)；內蒙古自治區自然科學基金項目(2016MS0338)。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.021