響應曲面法優化云南武定雞胸肉酶解工藝

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(1.云南農業大學食品科學技術學院,云南昆明 650201;2.云南農業大學云南省畜產品加工工程技術研究中心,云南昆明 650201)

響應曲面法優化云南武定雞胸肉酶解工藝

宋武剛1,2,王桂瑛1,2,程志斌2,谷大海1,2,徐志強1,2,朱仁俊1,*,廖國周1,2,*

(1.云南農業大學食品科學技術學院,云南昆明650201;2.云南農業大學云南省畜產品加工工程技術研究中心,云南昆明650201)

武定雞,雞胸肉,水解度

Keywords:Wuding chicken;chicken breast;degree of hydrolysis

我國擁有極為豐富的地方優質肉雞品種資源,目前已經成為第二大雞肉生產和消費國。肉雞在國內市場上除整只活雞銷售外,主要是以各部位分割后制成熟食銷售,一些帶骨產品受到我國消費者的普遍歡迎,而具有高蛋白、低脂肪等特點的雞胸肉,因其口感不佳,市場開拓不夠廣,價格也偏低[1-3]。由于生產技術和加工設備的落后,我國肉雞的精深加工程度僅為5.8%,與世界的20%存在較大差距,而云南可能更低,而且受制于傳統消費觀念和飲食習慣及資金技術支持,云南地方優質肉雞產業發展緩慢[4-6]。云南武定雞具有耐粗飼、抗逆性強、肉質細嫩鮮美的特點,為云南“六大名雞”之首,武定閹雞則是武定雞中的精品,被稱為“武定壯雞”,其肉質更細嫩,氨基酸、必需氨基酸和風味氨基酸含量更高[7-9]。目前,武定雞的研究主要集中在營養成分測定及營養代謝相關基因的分析,對武定雞進行精深加工和產品開發鮮有報道[10-13]。

蛋白酶解技術在畜產品和水產品的開發利用方面已經被廣泛應用,通過蛋白酶水解蛋白質可以提供高附加值產品,產品包括藥物、人類和動物營養品、化妝品、微生物氮源和天然抗氧化生物活性肽等,這些酶解產物經過精深加工后,不僅具有優于其他生物活性化合物的特點,而且能賦予產品營養與功能等性質[14-17]。Schmidt[18]、白騰輝[19]、閆利萍[20]等人對雞胸肉酶解工藝條件進行了研究,孫楊贏[21]、唐道邦[22]等對雞胸肉酶解液的抗氧化活性做了研究,而利用這些酶解產物與氨基酸、還原糖和(或)香辛料發生美拉德反應制備熱反應香精和天然調味料的技術可以避免風味的損失以及營養的流失,一直是研究的熱點[23]。因此,利用蛋白酶解技術可以對雞胸肉進行精深加工,不僅可以擴大雞胸肉產品的市場,還可以提高雞胸肉的附加值,創造更大的經濟效益,具有廣泛的開發前景。本研究以150日齡武定閹母雞胸肉為原料,通過篩選高效的水解酶,研究了兩種酶復配的最佳酶解工藝條件,為后期開發特色風味調味料提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

150日齡武定閹母雞雞胸肉 云南農業大學實驗種雞場;木瓜蛋白酶(80 U/g)、中性蛋白酶(10 U/g)、風味蛋白酶(10 U/g)、動物蛋白酶(15 U/g) 江蘇銳陽生物科技有限公司;甲醛和氫氧化鈉(分析純) 天津市鳳船化學試劑科技有限公司;磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉(食品級) 連云港友進食品添加劑技術開發有限公司;其他試劑 均為國產分析純。

BCD-254冰箱 SIEMENS;101型干燥箱 北京中興;MJ-BL25c4攪拌機 廣東美的;JJ-1增力攪拌器 常州澳華;DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋 天津泰斯特;DT5-2型低速臺式離心機 北京時代北利;KDN-04B半自動凱氏定氮儀 浙江托普。

1.2 實驗方法

1.2.1 水分測定 采用GB/5009.3-2010中直接干燥法測定[24]。

1.2.2 總氮測定 參照GB/T 9695.11-2008測定[25]。

1.2.3 酶解工藝 雞胸肉→搗碎→一定pH緩沖液溶解→加酶→恒溫水解→滅酶(100 ℃,10 min)→離心(5000 r/min,10 min)→上清液為酶解產物。

1.2.4 單一酶篩選實驗 根據風味蛋白酶、動物蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶性質及預實驗結果確定酶解基本條件,以水解度為指標,考察不同酶的酶解效果。

1.2.4.1 酶添加量實驗 固定溫度50 ℃,初始pH6.5,酶解時間4 h,四種酶添加量分別為0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%(以雞胸肉干重計,下同),考察酶添加量對水解度的影響。

1.2.4.2 酶解時間實驗 固定溫度50 ℃,初始pH6.5,四種酶添加量為0.25%,酶解時間分別為3、3.5、4、4.5、5、5.5、6 h,考察反應時間對水解度的影響。

1.2.4.3 酶解溫度實驗 固定四種酶添加量為0.25%,初始pH6.5,酶解時間4 h,酶解溫度分別為45、50、55、60 ℃,考察酶解溫度對水解的影響。

1.2.4.4 酶解pH實驗 固定四種酶添加量為0.25%,酶解溫度50 ℃,酶解時間4 h,酶解pH分別為5.5、6、6.5、7、7.5,考察酶解初始pH對水解度的影響。

1.2.5 復配酶單因素實驗 根據1.2.4所得到的實驗結果,以水解度為指標,研究酶復配比例、酶添加量、反應時間、反應溫度和pH對復配酶酶解效果的影響。

1.2.5.1 酶復配比例 固定溫度50 ℃,初始pH6.5,酶解時間5 h,木瓜蛋白酶和中性蛋白酶總添加量為0.3%,研究兩種酶不同比例(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)對酶解效果的影響。

1.2.5.2 復配酶添加量 固定溫度50 ℃,初始pH6.5,酶解時間5 h,木瓜蛋白酶與中性蛋白酶添加比例為2∶1,研究不同添加量(0.15%、0.225%、0.3%、0.375%、0.45%)對酶解效果的影響。

1.2.5.3 酶解時間 固定復配酶添加量0.3%(木瓜蛋白酶∶中性蛋白酶=2∶1),溫度50 ℃,初始pH6.5,研究不同酶解時間(3、3.4、4、4.5、5、5.5、6 h)對酶解效果的影響。

1.2.5.4 酶解溫度 固定復配酶添加量0.3%(木瓜蛋白酶∶中性蛋白酶=2∶1),時間5 h,初始pH6.5,研究不同酶解溫度(45、50、55、60 ℃)對酶解效果的影響。

1.2.5.5 酶解pH 固定復配酶添加量0.3%(木瓜蛋白酶∶中性蛋白酶=2∶1),時間5 h,溫度50 ℃,研究不同酶解pH(6.0、6.5、7.0、7.5)對酶解效果的影響。

1.2.6 響應面試驗 根據1.2.5實驗結果,運用Box-Behnken中心組合試驗設計原理,以水解溫度(X1)、水解pH(X2)、酶添加量(X3)為變量,水解度為指標,實驗設計詳見表1及表3。

表1 Box-Behnken試驗設計Table 1 Design of Box-Behnken response surface experiments

式中,V3-樣品體積,mL;c1-氫氧化鈉標準滴定溶液的濃度,mol/L;0.014-1.00 mL氫氧化鈉標準滴定溶液[c(NaOH)=1.000 mol/L]相當于氮的質量,g。

1.3 數據分析

數據處理與分析采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析與多重比較,以平均值±標準差表示;響應面實驗由Design-Expert 8.0.5b設計并進行分析。

2 結果與分析

2.1 武定雞胸肉基本成分分析

為計算蛋白酶的添加量(以雞胸肉的干重計)和水解度，故測定雞肉原料的水分含量和總氮含量，結果見表2。

表2 武定雞胸肉基本成分Table 2 The basic ingredients of chicken meat

2.2 單一酶對雞胸肉水解度的影響

2.2.1 單一酶添加量對雞胸肉水解度的影響 由圖1知,隨著酶添加量增加,水解度增大,達到一定量后變化趨于平穩。其中,木瓜蛋白酶是水解度最大酶,在0.25%時,水解度最大,為26.49%,且與0.3%、0.35%添加量的水解度差異不明顯(p>0.05);風味蛋白酶、動物蛋白酶和中性蛋白酶在添加量為0.3%時水解度達到最大,分別為8.65%、17.50%和22.37%,且與其他添加量的水解度相比,差異極顯著(p<0.01),當添加量為0.35%時,水解度卻有所下降。

圖1 單一酶添加量對水解度的影響Fig.1 Effect of addition of single enzyme on DH

2.2.2 單一酶酶解時間對雞胸肉水解度的影響 由圖2可知,隨著反應的進行,水解度逐漸增大,在反應5 h后趨于平緩,說明反應接近完成,反應5 h時,風味蛋白酶、動物蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的水解度分別為10.16%、18.53%、25.74%、18.94%。從實驗結果分析可知,四種酶5 h水解度與3、3.5、4、4.5 h的水解度差異極顯著(p<0.01),且與6 h的水解度差異不顯著(p>0.05),說明底物在5 h內基本被酶解完全,而且酶解時間過長,會提高生產成本,因此適宜酶解時間為5 h。

圖2 單一酶酶解時間對水解度的影響Fig.2 Effect of enzymatic time of single enzyme on DH

2.2.3 單一酶酶解溫度對雞胸肉水解度的影響 由圖3可知,隨著反應溫度的升高,水解度先上升后下降。風味蛋白酶在50 ℃時水解度達到最大,水解度為10.43%,相比其他反應溫度的水解度,差異極顯著(p<0.01),而動物蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶在55 ℃時,水解度達到最大,分別為17.09%、26.49%、21.34%。其中,木瓜蛋白酶在55 ℃的水解度相比其他溫度的水解度,差異極顯著(p<0.01),中性蛋白酶在45～55 ℃之間,水解度差異不明顯,但與60 ℃相比,差異極顯著(p<0.01)。

圖3 單一酶酶解溫度對水解度的影響Fig.3 Effect of enzymatic temperature of single enzyme on DH

2.2.4 單一酶酶解pH對雞胸肉水解度的影響 由圖4可知,風味蛋白酶在pH為6.5時,水解度最大,為11.94%,而動物蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的水解度在pH為7.0時,達到最大,分別為20.52%、28.82%、24.84%。通過對實驗數據進行分析可知,風味蛋白酶在pH為6.5時的水解度與pH為5.5、6.0、7.5時的水解度差異極顯著(p<0.01),而木瓜蛋白酶和中性蛋白酶在pH為7.0時的水解度與pH為5.5、6.0、6.5、7.5時的水解度相比,差異極顯著(p<0.01),動物蛋白酶在pH為7.0時的水解度與pH為5.5、6.0和6.5時的水解度相比,差異也極顯著(p<0.01)。

圖4 單一酶酶解pH對水解度的影響Fig.4 Effect of reaction pH of single enzyme on DH

通過以上實驗,考察了酶添加量，酶解時間、溫度和pH四個因素對水解度的影響,發現木瓜蛋白酶在四個因素實驗中,水解度都是最高的,而中性蛋白酶次之,且與木瓜蛋白酶反應條件相似,在各個單因素實驗中,最高的木瓜蛋白酶水解度大概是水解度最低的風味蛋白酶的3倍。木瓜蛋白酶屬于半胱氨酸蛋白酶類,能水解甘氨酸、賴氨酸和精氨酸等的蛋白底物,中性蛋白酶屬于金屬蛋白酶類,能水解苯丙氨酸、亮氨酸、色氨酸等的底物,兩種酶復配,極大的增大了可水解的底物范圍,且本研究以水解度為指標,發現木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解雞胸蛋白的水解度明顯高于其余兩種蛋白酶,兩種蛋白酶復配水解雞胸肉蛋白的水解度明顯高于單一酶水解,故選出木瓜蛋白酶和中性蛋白酶進行復配。

2.3 復配酶對雞胸肉水解度的影響

2.3.1 復配酶復配比例對雞胸肉水解度的影響 雞胸肉蛋白質中的各種氨基酸含量是不同的,而木瓜蛋白酶和中性蛋白酶所作用的氨基酸殘基是不同的,因此,不同比例酶組合,水解度不同。由圖5可知,酶復配比例在木瓜蛋白酶與中性蛋白酶比為2∶1時,水解度最大,為32.87%,通過實驗數據分析發現,木瓜蛋白酶比中性蛋白酶為2∶1時的水解度與其余復配比例相比,差異極顯著(p<0.01),因此,實驗選擇木瓜蛋白酶與中性蛋白酶復配比例為2∶1。

圖5 酶復配比例對水解度的影響Fig.5 Effect of the ratio of two enzymes on DH

2.3.2 復配酶添加量對雞胸肉水解度的影響 由圖6可知,木瓜蛋白酶和中性蛋白酶添加量0.15%～0.375%時,水解度不斷增大,且差異極顯著(p<0.01),在0.375%時水解度最大,為36.92%。當酶添加量從0.375%增加到0.45%,水解度不再增加反而出現下降,且兩者水解度差異極顯著(p<0.01),當酶濃度過高時,可能還會不利于反應的進行,這可能是由酶的性質決定的,酶既能促進正反應,也能促進逆反應的進行,因此,酶的添加量要適可而止。

圖6 復配酶添加量對水解度的影響Fig.6 Effect of addition of two enzymes on DH

2.3.3 復配酶酶解時間對雞胸肉水解度的影響 由圖7可知,當酶解時間由3 h增至5 h時,水解度明顯增大,差異極顯著(p<0.01),在5 h時,水解度達到了34.25%,當酶解時間由5 h增加到6 h時,水解度趨于平緩,差異也不顯著(p>0.05),從實際成本及其他因素考慮,選擇反應時間為5 h。

圖7 復配酶酶解時間對水解度的影響Fig.7 Effect of enzymatic time of two enzymes on DH

2.3.4 復配酶酶解溫度對雞胸肉水解度的影響 由圖8可知,當溫度從45 ℃上升到55 ℃時,水解度逐漸增大,在55 ℃時水解度達到最大值,為34.38%,與45和50 ℃的水解度相比,差異極顯著(p<0.01),溫度繼續升高,可能部分酶失去了活性,水解度降低,實驗數據分析顯示與溫度為55 ℃時水解度相比,差異也是極顯著的(p<0.01)。

圖8 復配酶酶解溫度對水解度的影響Fig.8 Effect of enzymatic temperature of two enzymes on DH

2.3.5 酶解pH對雞胸肉水解度的影響 由圖9可知,當pH由6.0上升到7.0時,水解度呈上升趨勢,在pH為7.0時,達到最大值為31.77%,當pH超過7.0后,水解度又下降,結果顯示pH7.0時的水解度與pH6.0、7.5時的水解度差異極顯著(p<0.01),這結果是完全符合酶的特性,因為酶都具有一定適宜的反應pH,不適宜的條件都會影響酶的活性。

圖9 復配酶酶解pH對水解度的影響Fig.9 Effect of reaction pH of two enzymes on DH

通過單一酶的單因素和復配酶的實驗結果可知,復配酶解的效果要優于單一酶酶解,水解度隨反應時間延長呈現先上升后平緩,且考慮到經濟成本等原因,選擇5 h,該因素不參與后續的響應面實驗的優化,所以選擇了溫度、pH、酶添加量等三個因素進行優化實驗。

2.4 響應曲面實驗結果

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

注:“**”表示差異極顯著，p<0.01。

表3 Box-Behnken實驗方案及結果Table 3 Design and results of the response surface experiments

圖10 溫度與pH(A)、溫度與酶添加量(B)和pH與酶添加量(C)交互影響雞胸肉水解度曲面圖Fig.10 Graph on interaction effect of reaction temperature and pH(A),reaction temperature and enzyme addition(B),pH and enzyme addition(C) on the degree of chicken breast hydrolysis

3 結論

在單因素實驗的基礎上,采用Box-Behnken實驗設計并通過響應面法優化修正后得到雞胸肉最佳的酶解工藝條件為木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的添加量分別為0.27%和0.13%,反應溫度54.3 ℃,pH為6.8,在此條件下,反應時間5 h后,雞胸肉酶解液的水解度達到了36.03%±0.31%,與預測值36.26%基本吻合,說明此方程與實際擬合較好,驗證了此模型的合理性。

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OptimizationofenzymatichydrolysisprocessofYunnanWudingchickenbreastmeatbyresponsesurfacemethodology

SONGWu-gang1,2,WANGGui-ying1,2,CHENGZhi-bin2,GUDa-hai1,2,XUZhi-qiang1,2,ZHURen-jun1,*,LIAOGuo-zhou1,2,*

(1.College of Food Science and Technology,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China;2.Livestock Product Processing Engineering and Technology Research Center of Yunnan Provine,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China)

TS251.5+5

A

1002-0306(2017)18-0099-06

2017-02-07

宋武剛(1987-)，男，碩士研究生，研究方向：肉品加工與質量控制，E-mail:allens1987@126.com。

*通訊作者:朱仁俊(1968-)，男，碩士，教授，研究方向：食品安全與質量控制，E-mail:2421125021@qq.com。 廖國周(1978-)，男，博士，副教授，研究方向：畜產品加工與質量控制，E-mail:liaoguozhou@ynau.edu.cn。

云南特色資源風味調料產品開發及產業化(2013IB010)；云南省科技計劃項目重大科技專項(2016ZA008)。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.020