豆腐柴葉總黃酮不同溶劑級(jí)分抗氧化活性分析

, ,,

(1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川綿陽(yáng) 621010;2.四川省生物質(zhì)資源利用與改性工程技術(shù)研究中心,四川綿陽(yáng) 621010;3.江油市春雨生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司,四川江油 621700)

豆腐柴葉總黃酮不同溶劑級(jí)分抗氧化活性分析

熊雙麗1,2,馬楠1,廖婷婷1,薛朝云3

(1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川綿陽(yáng)621010;2.四川省生物質(zhì)資源利用與改性工程技術(shù)研究中心,四川綿陽(yáng)621010;3.江油市春雨生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司,四川江油621700)

采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、羥自由基、超氧陰離子、還原力、總抗等體外抗氧化活性模型和抗氧化活性綜合評(píng)價(jià)指數(shù),分析四川江油地區(qū)不同溶劑萃取的豆腐柴黃酮級(jí)分(乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿、水)的抗氧化活性。結(jié)果顯示,不同濃度乙醇提取總黃酮的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除活性最高。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率、羥基自由基清除率、ABTS陽(yáng)離子自由基清除率、總抗和還原力皆隨乙醇濃度的升高而呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì),超氧陰離子自由基清除率卻隨乙醇濃度增加一直降低。綜合評(píng)價(jià)指數(shù)顯示不同濃度乙醇抗氧化活性依次為75%醇提物>65%醇提物>55%醇提物>85%醇提物>95%醇提物。乙酸乙酯層萃取物的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率、總抗、還原力及ABTS陽(yáng)離子自由基清除率要優(yōu)于其它各萃取層。正丁醇層萃取物的超氧陰離子自由基清除率要優(yōu)于其它各萃取層。乙酸乙酯層抗氧化活性最佳。豆腐柴葉總黃酮有較好的抗氧化活性,可作為抗氧化劑或者健康食品原料開(kāi)發(fā)。

豆腐柴,黃酮,分級(jí)分離,抗氧化

Abstract:The article mainly evaluated the antioxidant ability of total flavonoids in various extracts(ethyl alcohol,ethyl acetate,normal butyl alcohol,chloroform fraction and water)fromPremnamicrophyllaTurcz leaves in Jiangyou area including DPPH radical,ABTS+· radical,hydroxyl radical,superoxide anion radical scavenging effect,reducing power,ferrous ions chelating activities and total antioxidant capacity(FRAP). The free radical scavenging activity of total flavonoids extracted by different concentrations of ethanol was highest in DPPH. The free radical scavenging activity(DPPH radical,·OH,ABTS+·),total antioxidant capacity(FRAP)and reducing power were dependent on the concentration of alcohol increasing first and then decreasing,while the superoxide anion radical scavenging activity was contrary to the increase of alcohol concentration. The comprehensive evaluation index(APC)of tested samples was decreased in the following order:75% ethanol extract>65% ethanol extract>55% ethanol extract>85% ethanol extract>95% ethanol extract. The DPPH radical scavenging activity,FRAP value and reducing power were higher than those of other solvent extracts. The superoxide anion radical scavenging rate of ethyl acetate extract was stronger than those of other solvent extracts. The antioxidant capacity of ethyl acetate extract was strongest according to the APC results. The flavone from leaves ofPremnamicrophyllaTurcz has strong antioxidant activity and can be used as antioxidant or raw materials of healthy food.

Keywords:PremnamicrophyllaTurcz;flavone;fractionation;antioxidant activity

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆腐柴 四川江油春雨生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司;2,2′-二氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS),2,4,6-三(2-吡啶)-1,3,5-三嗪(TPTZ)和DPPH SIGMA ALDRICH公司;蘆丁對(duì)照品 華中海威(北京)基因科技有限公司;抗壞血酸 天津歐博凱化工有限公司;乙酸乙酯、乙醇、正丁醇、三氯甲烷、氫氧化鈉、硝酸鋁等 均為分析純。

紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) 日本HITACHI公司;真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Thermosavant 公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市瑞德儀器設(shè)備有限公司;SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豆腐柴葉黃酮類(lèi)化合物不同溶劑萃取級(jí)分的制備 豆腐柴葉經(jīng)干燥粉碎過(guò)60目篩預(yù)處理之后,用不同濃度乙醇(55%、65%、75%、85%、95%)進(jìn)行萃取(料液比1∶37 g/mL、提取溫度81 ℃、提取時(shí)間3.4 h[6]),分別分析各提取物抗氧化活性。然后,以最佳乙醇濃度和最佳提取工藝提取豆腐柴葉總黃酮[6],將提取液于45 ℃真空減壓濃縮至無(wú)醇味后用石油醚萃取除去色素類(lèi)部分,水相再加入3倍體積乙醇,低溫靜置過(guò)夜,離心(4500 r/min,15 min)后將上清液減壓濃縮除去乙醇后依次用氯仿、乙酸乙酯及正丁醇對(duì)豆腐柴葉總黃酮進(jìn)行分級(jí)萃取,得到極性不同的各級(jí)分(水層、氯仿層、乙酸乙酯層、正丁醇層),分別旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑后真空冷凍干燥后進(jìn)行抗氧化活性分析。

1.2.2 豆腐柴葉不同溶劑萃取級(jí)分的抗氧化活性分析

1.2.2.1 DPPH自由基和·OH清除活性測(cè)定 DPPH自由基清除活性測(cè)定[6-7]。·OH清除活性測(cè)定[7]。

S(%)=[(V0-Vi)/V0]×100

式(1)

1.2.2.3 總抗氧化能力 總抗氧化能力采用FRAP法[9-10],并略作修改。樣品的抗氧化活性以達(dá)到同樣吸光值所需的硫酸亞鐵毫摩爾數(shù)表示。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制:比色管中依次加入濃度為0、0.1、0.2、0.4、0.6、1.0 mol/L的硫酸亞鐵溶液各60 μL,加入6.0 mL FRAP工作液(現(xiàn)配現(xiàn)用,0.3 mol/L pH3.6醋酸鹽緩沖溶液、10 mmol/L TPTZ溶液、20 mmol/L FeCl3溶液按照10∶1∶1混合而成,預(yù)熱至37 ℃),混勻后37 ℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)10 min,593 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值(A),由吸光值(y)和硫酸亞鐵濃度(x)做回歸直線(xiàn)得y=0.2735x-0.0133,相關(guān)系數(shù)R2=0.9992。

黃酮類(lèi)化合物不同溶劑萃取級(jí)分的總抗氧化能力測(cè)定:取不同濃度不同級(jí)分的黃酮樣品替代硫酸亞鐵溶液，按照上述方法測(cè)定吸光值(Ai),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品的FRAP值。計(jì)算公式為(2):

FRAP(mmol/L)=(Ai+0.0133)/0.2735

式(2)

1.2.2.4 還原力測(cè)定 還原力測(cè)定采用鐵氰化鉀法[11]。

1.2.2.5 ABTS陽(yáng)離子自由基清除率的測(cè)定 黃酮類(lèi)化合物不同溶劑萃取級(jí)分ABTS+·清除率參考文獻(xiàn)[10],并略作修改。取7.4 mmol/L ABTS儲(chǔ)備液和2.6 mmol/L過(guò)硫酸鉀儲(chǔ)備液各0.2 mL,混合后于黑暗條件下放置14 h。用75%乙醇稀釋,并用75%乙醇調(diào)零,在734 nm 處調(diào)整吸光值為0.700±0.005得ABTS+·工作液。取0.1 mL不同濃度樣液與ABTS+·工作液3.9 mL混勻,在25 ℃水浴反應(yīng)6 min后于734 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)i。以去離子水代替ABTS+·工作液測(cè)定吸光值A(chǔ)0。按式(3)計(jì)算ABTS+·清除率(S):

S(%)=(1-Ai/A0)×100

式(3)

1.2.2.6 抗氧化活性綜合評(píng)價(jià) 采用抗氧化活性綜合指數(shù)法(APC)評(píng)價(jià)黃酮類(lèi)化合物不同溶劑萃取級(jí)分的總體抗氧化活性[12-13]。綜合上述6種抗氧化活性評(píng)價(jià)指標(biāo),按式(4)計(jì)算APC指數(shù)。

表1 不同濃度乙醇提取物的總黃酮抗氧化活性Table 1 Antioxidant activity of total flavonoids extracted with different concentrations of ethanol

表2 不同濃度乙醇提取總黃酮抗氧化活性綜合評(píng)價(jià)及排序Table 2 Comprehensive evaluation and ranking of antioxidant activity of total flavonoids extracted with different concentrations of ethanol

APC=∑(各樣品各抗氧化指標(biāo)能力分值/每種方法測(cè)定的最大值×使用的方法總數(shù))×100

式(4)

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有樣品均設(shè)3個(gè)重復(fù),測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用Excel 2013和SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和方差分析。樣品間的差異顯著性采用單因素方差分析(One Way ANOVA)Duncan新復(fù)極差法分析。p<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇濃度對(duì)總黃酮抗氧化活性的影響

一般情況下,植物中黃酮類(lèi)化合物存在多種不同極性成分,乙醇濃度對(duì)總黃酮的提取率和抗氧化活性影響較大[14]。為探究江油地區(qū)豆腐柴黃酮的抗氧化活性和構(gòu)效關(guān)系,首先分析了不同濃度乙醇萃取黃酮的抗氧化活性。

2.2 不同溶劑萃取級(jí)分的DPPH自由基和羥基自由基清除能力

DPPH自由基體系根據(jù)抗氧化劑提供的電子配對(duì),使其顏色褪去或者消失,從而測(cè)定物質(zhì)的抗氧化活性[15-16]。如圖1所示,不同溶劑萃取級(jí)分對(duì)DPPH自由基的清除率在0～0.5 mg/mL濃度范圍內(nèi)隨總黃酮濃度的增加而逐漸增強(qiáng),乙酸乙酯層和正丁醇層萃取物對(duì)DPPH自由基的清除率差異不大,且要遠(yuǎn)優(yōu)于氯仿層和水層萃取物,與曹穩(wěn)根[3]等報(bào)道的AB-8大孔吸附樹(shù)脂分離得到的豆腐柴黃酮活性規(guī)律一致。在濃度為0.5 mg/mL時(shí),乙酸乙酯層和正丁醇層的DPPH自由基清除率分別高達(dá)92.57%±0.06%和91.82%±0.26%,接近于VC95.78%±0.04%,表現(xiàn)出較強(qiáng)的DPPH清除活性,而且都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氯仿層與水層萃取物。

圖1 各萃取級(jí)分對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.1 Scavenging rate of each extraction fraction against DPPH·

如圖2所示,各萃取級(jí)分對(duì)·OH的清除率在0～0.5 mg/mL濃度范圍內(nèi)隨待測(cè)物濃度的增大而增高,其中氯仿層和乙酸乙酯層在達(dá)到0.1 mg/mL后清除率變得較為穩(wěn)定,正丁醇層和水層清除率仍緩慢增加。乙酸乙酯層、正丁醇層及水層·OH清除率較低,約50%。氯仿層·OH清除率較其它三個(gè)級(jí)分高,當(dāng)濃度為0.1 mg/mL時(shí),其羥基自由基清除率為63.54%±0.23%,甚至高于VC58.58%±0.31%,隨著濃度的進(jìn)一步上升,氯仿層萃取物對(duì)·OH得清除率不再有明顯變化,開(kāi)始低于VC,這可能與氯仿層黃酮類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)有關(guān),有待進(jìn)一步研究分析。

圖2 各萃取級(jí)分對(duì)羥基自由基的清除率Fig.2 Scavenging rate of extraction fraction against ·OH

2.3 不同溶劑萃取級(jí)分的超氧陰離子自由基清除能力和總抗氧化能力

圖3 各萃取級(jí)分對(duì)的清除率Fig.3 Scavenging rate of various extraction fraction against

2,4,6-三吡啶基三嗪(tripyridyl-triazine,TPTZ)可與受試物作用,被還原為Fe2+并呈現(xiàn)出藍(lán)色,于593 nm有最大吸收峰,通過(guò)吸光值大小轉(zhuǎn)化為Fe2+當(dāng)量即可比較抗氧化能力[17]。該值反映測(cè)試樣品還原力,抗氧化能力與FRAP值呈正相關(guān)。由圖4所示,在0～0.5 mg/mL濃度范圍內(nèi),VC和各萃取層萃取物FRAP值隨濃度的增大而增加,當(dāng)濃度大于0.35 mg/mL時(shí),各級(jí)分總抗氧化能力從大至小分別為乙酸乙酯層、正丁醇層、氯仿層、水層。

圖4 各萃取級(jí)分的FRAP值Fig.4 The FRAP value of various extraction fraction

2.4 不同溶劑萃取級(jí)分的還原力和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力

鐵氰化鉀還原體系測(cè)定還原力,可表征待測(cè)物自身發(fā)生氧化的能力,是評(píng)價(jià)抗氧化活性的重要指標(biāo)力[11,19],還原能力越強(qiáng)則抗氧化能力也越強(qiáng)。如圖5所示,在0～0.25 mg/mL濃度范圍內(nèi),各萃取層還原力隨濃度的增加而增長(zhǎng),總體呈現(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系。除水層以外,其它各萃取級(jí)分的還原力均大于李保同等報(bào)道的銀杏葉黃酮的還原力[20]。各層萃取還原力規(guī)律同DPPH。

圖5 各萃取層還原力Fig.5 Reducing power of extraction fraction

表3 不同溶劑萃取級(jí)分的抗氧化活性Table 3 Antioxidant activity of flavonoids in various extracts

表4 不同溶劑萃取級(jí)分抗氧化活性綜合評(píng)價(jià)及排序Table 4 Comprehensive evaluation and ranking of antioxidant activity of flavonoids in various extracts

ABTS+·是一種亞穩(wěn)態(tài)離子,易溶于乙醇,于734 nm處有吸收峰。根據(jù)受試物的干預(yù)對(duì)其吸光值的影響,可判斷天然產(chǎn)物的抗氧化活性[21]。如圖6所示,各萃取層在0～1.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)清除率隨濃度的增加而增大。乙酸乙酯層的清除率最好,其次是正丁醇層,再次是氯仿層,水層最差。其中,乙酸乙酯層、正丁醇層、氯仿層萃取物的ABTS+·清除均顯著高于VC。豆腐柴葉總黃酮各萃取層對(duì)ABTS+·的清除效果都優(yōu)于VC,這與其它抗氧化活性評(píng)價(jià)指標(biāo)呈現(xiàn)出了明顯的相反趨勢(shì),其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

圖6 各萃取層對(duì)ABTS+·的清除率Fig.6 Scavenging rate of extraction fraction against ABTS+·

2.5 不同溶劑萃取級(jí)分抗氧化活性的綜合評(píng)價(jià)

3 結(jié)論

[1]Erlund I. Review of the flavonoids quercetin,hesperetin,and naringenin. Dietary sources,bioactivities,bioavailability,and epidemiology[J]. Nutrition Research,2004,24:851-874.

[2]Muhammad A,Tel-Cayan G,?ztürk M,et al. Biologically active flavonoids from Dodonaea viscosa and their structure-activity relationships[J]. Industrial Crops and Products,2015,78:66-72.

[3]曹穩(wěn)根,段紅,翟科峰,等. 野生豆腐柴葉總黃酮抗氧化活性研究[J]. 滁州學(xué)院學(xué)報(bào),2016,18(5):40-43.

[4]Han H B,Li H,Hao R L,et al. One-step column chromatographic extraction with gradient elution followed by automatic separation of volatiles,flavonoids and polysaccharides from Citrus grandis[J]. Food Chemistry,2014,145:542-548.

[5]朱玲玲. 白鵑梅中黃酮類(lèi)物質(zhì)的分離純化和生物活性研究[D]. 廣州:暨南大學(xué),2016.

[6]胡予,李旭升,馬楠,等.豆腐柴葉總黃酮的提取、純化及抗氧化活性研究[J]. 食品工業(yè)科技,2016,20:268-273.

[7]Luo Y H,Li X R,HeIsolation J,et al. characterisation,and antioxidant activities of flavonoids from chufa(Eleocharistuberosa)peels[J]. Food Chemistry,2014,164:30-35.

[8]許樹(shù)軍,朱琪,于子惠,等. 橙皮苷及橙皮素清除超氧陰離子自由基能力的研究[J]. 中國(guó)醫(yī)藥學(xué)報(bào),2015,43(1):56-58.

[9]Benzie Iris F F,Strain J J. The Ferric Reducing Ability of Plasma(FRAP)as a Measure of “Antioxidant Power”:The FRAP Assay[J]. Analytical Biochemistry,1996,239(1):70-76.

[10]袁佐云,朱運(yùn)平,俞偉祖,等. 蒸煮與發(fā)酵對(duì)全谷物粉甲醇提取物抗氧化活性的影響[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào),2016,16(2):25-32.

[11]Tan L H,Zhang D,Wang G. Comparative analyses of flavonoids compositions and antioxidant activities of Hawk tea from six botanical[J]. Industrial Crops and Products,2016,80:123-130.

[12]Seeram N P,Aviram M,Zhang Y,et al. Comparison of antioxidant potency of commonly consumed polyphenol-rich beverages in the United States[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry,2008,56(4):1415-1422.

[13]張華,周志欽,席萬(wàn)鵬. 種柑橘果實(shí)主要酚類(lèi)物質(zhì)的體外抗氧化活性比較[J]. 食品科學(xué),2015,36(11):64-70.

[14]程悅,王志宇,王冬梅,等. 不同溶劑對(duì)雞血藤提取物總黃酮含量及抗腫瘤活性的影響[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17(9):142-144

[15]Sivasothy Y,SulaimanS F,Ooi K L. Antioxidant and antibacterial activities of flavonoids and curcuminoids fromZingiberspectabileGriff[J]. Food Control,2013,30:714-720.

[16]Wang Y Q,Gao Y J,Ding H. Subcritical ethanol extraction of flavonoids from Moringa oleifera leaf and evaluation of antioxidant activity[J]. Food Chemistry,2017,218:152-158.

[17]Giesea E C,Gascona J,Anzelmo G,et al. Free-radical scavenging properties and antioxidant activities of botryosphaeran and some other-D-glucans[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2015,72:125-130.

[18]曾偉. 芒萁黃酮的純化分離及抗氧化活性研究[D]. 廣州:廣東工業(yè)大學(xué),2013.

[19]曾維才,石碧. 天然產(chǎn)物抗氧化活性的常見(jiàn)評(píng)價(jià)方法[J].化工進(jìn)展,2013(6):50-51.

[20]李保同. 銀杏葉總黃麗的提取純化及其抗氧化性能研究[D]. 北京:北京林業(yè)大學(xué),2016.

[21]Re R,Nicoletta P,Proteggente A,et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay[J]. Australian Tafe Teacher,1999,26(10):1231-1237.

AntioxidantactivityofflavonewithdifferentsolventextractsfromPremnamicrophyllaTurczleaves

XIONGShuang-li1,2,MANan1,LIAOTing-ting1,XUEChao-yun3

(1.School of Life Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology,Mianyang 621010,China;2.Engineering Research Center for Biomass Resource Utilization and Modification of Sichuan Province,Mianyang 621010,China;3.Jiangyou Chunyu Ecological Agricultural Science and Technology Company,Jiangyou 621700,China)

TS255.1

A

1002-0306(2017)18-0019-06

2017-02-23

熊雙麗(1977-)，女，博士,教授，研究方向：功能性食品加工與安全， E-mail:372364129@qq.com。

四川省生物質(zhì)資源利用與改性工程技術(shù)研究中心專(zhuān)職科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)基金項(xiàng)目(14tdgc04);四川省科技廳項(xiàng)目(2017NFP0179)。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.004