酪蛋白胃腸模擬水解液活性檢測及細胞吸收機制初步研究

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(陜西科技大學食品與生物工程學院,陜西西安 710021)

酪蛋白胃腸模擬水解液活性檢測及細胞吸收機制初步研究

薛海燕,李珊,杜枘宣,韓波,張穎

(陜西科技大學食品與生物工程學院,陜西西安710021)

目的:研究牛乳酪蛋白在胃腸模擬水解條件下水解物的生物活性,以及這些肽類在細胞水平的吸收機制,為蛋白質生理作用機制研究奠定基礎。方法:以牛乳酪蛋白為原料,對其進行體外模擬胃腸消化實驗,通過檢測消化液的DPPH自由基清除率和抑菌圈大小,分析其抗氧化和抗菌活性;建立Caco-2單層細胞模型對水解液進行過膜吸收,RP-HPLC分析過膜前后消化液組成,研究吸收情況。結果:模擬胃和腸消化時間均在2 h時,牛乳酪蛋白消化液的DPPH自由基清除率達到最大,分別為46.40%和56.7%,并且此時對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌性能最強;細胞吸收實驗表明2 h胃模擬水解液肽氮生物利用度達到7.79%,2 h腸模擬水解液達到15.11%,之后基本持平;親水性的多肽能被成功吸收進入單細胞層下側,但疏水性多肽大部分不易通過,易被降解或阻止。結論:牛乳酪蛋白在模擬消化條件下能產生生物活性肽類,并能被腸細胞吸收。

酪蛋白,胃腸模擬消化,抗氧化活性,Caco-2細胞

Abstract:Objective:To study on bioative detetion and cell-based absorption mechanisms of gastrointestinal hydrolysis derived from bovine casein. It can further elucidate physiological mechanisms of food protein to humanbeing.Methods:Bovine milk casein was hydrolyzedinvitrosimulating gastrointestinal digestion. The hydrolysate’s antioxidant and antimicrobial activity were detected through the DPPH free radical clearance rate analysis and the bacteriostatic ring size determination. In addation,Caco-2 monolayer cell model was optimizated and established to simulate the membrane absorption of hydrolysate. RP-HPLC was used to analyze the digestive juices before and after across the membrane.Results:It showed the DPPH free radical clearance rates reached maximum,46.40% of 2 h-Gastricand 56.7% of 2h-Gastroin-testinal digestions from bovine casein. At the same time,the inhibition activity onEscherichiacoliandStaphylococcusaureusalso achieve maximum. Experiment results showed that hydrolyzed 2 h stomach simulation peptide absorption nitrogen bioavailability of 7.79%,2 h hydrolyzed imtestines simulation of 15.11%,after the flat.The peptide can be successfully absorb water into single cell layer under the side,but most hydrophobic peptide by not easily,easy degradation or stop.Conclusion:The gastrointestinal hydrolysate of casein can produce bioactive peptides as well as absorb by intestinal cell monolayer.

Keywords:casein;gastrointestinal digestion;antioxidant activity;Caco-2 cells

蛋白質是人體必需的營養成分之一。近幾年,蛋白質分解后產生的活性多肽成為研究熱點[1]。來源于食品的生物活性肽在動物進食消化后,不只為機體提供基本營養成分,還可能發揮一定的生理功能[2]。這些發現使得營養學家在評定蛋白質營養價值時,不僅要考慮蛋白質中的必需氨基酸含量,還應考慮在消化過程中是否會產生一些具有潛在生理功能的活性肽[3]。而牛乳酪蛋白中包含多種人體必需的氨基酸[4],經體外酶可控水解后可以產生多種生理活性肽,如免疫活性肽、腎素肽、抗氧化肽、酪蛋白磷酸肽(CPP)、血管緊張素轉換酶(ACE抑制肽)等[5]。目前研究大多集中于體外酶解蛋白制備乳源生物活性肽方面[6]。如Maruyama等人使用胰蛋白酶水解牛乳酪蛋白,在水解液中得到三種降血壓的二肽其肽段分別為:PP、RP及AH[7];徐鑫等人用胰蛋白酶水解牛乳酪蛋白,測定水解物對小鼠脾細胞的增殖促進作用達到0.184[8]。但關于蛋白質經胃腸水解后是否會產生理活性肽,具有生理活性的多肽進入胃腸道后能否被吸收,生理活性肽是否能完整通過小腸上皮細胞及通過的機制研究報道較少[9]。

利用動物實驗可以很好地進行營養物質的吸收評價,但結構完整性的維持是生理活性肽功能發揮的前提,動物機體復雜,體內多肽追蹤困難[10]。而Caco-2細胞單層膜具有與腸上皮細胞相同的細胞極性和緊密連接,并且表達出與腸上皮細胞的主動轉運系統相同的轉運載體;在細胞培養的AP側生長出的刷狀緣微絨毛也同樣表達氨肽酶、堿性磷酸酶和磺基轉移酶等,這些酶在小腸刷狀緣也都存在[11]。Caco-2腸道單層細胞模型由于其重復性好、操作簡單等優點被廣泛應用于藥物或食物營養素在腸道中的吸收評價中[12]。

因此,本研究通過模擬胃腸水解牛乳酪蛋白得到多肽水解液,檢測水解液中多肽的抗氧化活性和抑菌活性,以Caco-2單層細胞膜為模型,模擬體內腸道吸收、轉運,使水解多肽通過單層細胞,采用RP-HPLC對AP側和BL側的樣品進行檢測,對多肽的吸收進行初步研究,從而為蛋白質營養生理作用機制提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與方法

酪蛋白、胃蛋白酶(3000 U/mg)、胰蛋白酶(3000 U/mg)、DPPH(分析純) 美國Sigma公司;牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉 北京奧博星生物技術有限責任公司;大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、Caco-2細胞、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液 南京凱基生物發展有限公司;DMEM高糖培養基、青霉素-鏈霉素混合溶液 美國Hyclone公司;Hank’s平衡鹽溶液(HBSS) 美國Sigma公司;25 cm2培養瓶、12孔透明Transwell板(膜面積0.33 cm2) 美國康寧公司。

1200LC型高效液相色譜儀 美國安捷倫有限公司;752型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;HF90 CO2培養箱 上海力申儀器有限公司;Ti-U型倒置相差顯微鏡 大恒圖像有限公司;細胞電阻儀 美國MILLIPORE MILLICELL-ER;MULTISKAN mk3型酶標儀 賽默飛世爾上海儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酪蛋白水解物的制備

1.2.1.1 人工胃液和人工腸液的制備 參照文獻[13]中的方法。人工胃液:1 g胃蛋白酶溶解于50 mg超純水中,加入1.64 mL 10% HCl溶液,定容至100 mL,備用。

人工腸液:稱取0.68 g磷酸二氫鉀加到50 mL超純水中,用0.1 mol/L NaOH調節pH至6.8,加入1 g胰蛋白酶,定容至100 mL,備用。

1.2.1.2 體外模擬胃消化 稱取12 g酪蛋白溶于500 mL pH為8的PBS中,振蕩使其充分溶解后,用1 mol/L的HCl調節溶液的pH至2.0。將20 mL人工胃液加入酪蛋白溶液中,在37 ℃恒溫水浴振蕩器中模擬消化,在0、1、2、3、4、5 h分別取樣50 mL,然后將所得樣品在沸水中滅酶10 min,調節pH至等電點4.6以沉淀未消化的酪蛋白,10000 r/min離心30 min,分離獲得上清,NaOH調節上清溶液pH至8.0,將所得樣品凍干儲存于4 ℃冰箱中備用,其中0 h為對照。

1.2.1.3 體外模擬腸消化 按照1.2.1.2方法制備2 h酪蛋白胃消化液500 mL,用1 mol/L的NaOH調節溶液的pH至8.0,加20 mL的人工腸液,在37 ℃恒溫水浴振蕩器中繼續模擬消化,取樣時間、取樣量及保存方式同1.2.1.2。

1.2.2 酪蛋白水解液抗氧化及抗菌活性檢測

1.2.2.1 酪蛋白水解液抗氧化檢測 采用DPPH法[14]對水解液的DPPH自由基清除率進行測定。

將所有比色管均置于25 ℃恒溫水浴鍋中避光反應30 min后于λ=517 nm處測定其吸光度,每個濃度測定3次,取平均值,測定結果以清除率(SR)表示。用等體積無水乙醇作為空白調零。計算公式為:

式中:A0:DPPH(1×10-4mol/L)的吸光度;Ai:DPPH與水解液混合液的吸光度;Aj:水解液的吸光度。

1.2.2.2 酪蛋白水解液的抑菌活性檢測 參照文獻[15]中的方法,選擇不同類型微生物的典型代表進行抑菌活性實驗,大腸桿菌作為革蘭氏陰性(G-)菌的典型代表進行抑菌活性實驗。將1×108CFU/mL的菌液均勻涂布接種在瓊脂平面上,孔內加入不同水解時間的多肽液樣品,37 ℃無菌恒溫培養48 h后測量抑菌圈直徑。

1.2.3 Caco-2細胞的培養及吸收轉運實驗

1.2.3.1 Caco-2細胞的培養 參照文獻[16]中的方法,Caco-2細胞培養液為加入10%胎牛血清和2%青-鏈霉素的DMEM高糖培養基,將1×104CFU/mL的第7代Caco-2細胞懸液接種于25 cm2培養瓶中,在37 ℃,5% CO2無菌培養箱中培養,待其生長至80%～90%時用0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA溶液進行消化并傳代。選取其中兩株,濃度調整至2×105CFU/mL,將其接種于Transwell板上,在37 ℃,5% CO2無菌培養箱中培養,開始培養的一周內隔天更換細胞培養液,一周后每天更換培養液,直至成膜,檢測單層膜模型的建立。所用單層膜細胞傳代均在20代以內。

1.2.3.2 成膜完整性檢測 細胞形態學檢驗:培養至21 d時,將細胞用HBSS緩沖溶液沖洗3次,在電子顯微鏡下觀察其形態學特征。跨膜電阻TEER值測定[17]:用細胞電阻儀測定跨膜電阻(在700～1500 Ω·cm2之間符合要求),Caco-2細胞膜細胞電阻值(Ω·cm2)=(Caco-2細胞膜電阻值-空白膜電阻值)×膜面積。

熒光黃檢漏實驗[18]:熒光黃標準曲線的制作:用HBSS配制10 mg/mL的熒光黃溶液,然后稀釋至1、0.5、0.25、0.1、0.05、0.01 mg/mL,用酶標儀在495 nm處檢測其吸光度,以濃度為橫坐標X,吸光度為縱坐標Y,繪制標準曲線:Y=124.79X+0.12796,R2=0.997。

Caco-2單層細胞膜的滲透率和表觀滲透系數(Papp):將0.5 mL 0.4 mg/mL的熒光黃溶液加入Transwell的AP側,然后向BL側加入1.5 mL的HBSS緩沖溶液,分別在0、30、60、90、120、150 min在BL取樣200 μL,然后添加同體積的HBSS緩沖溶液,在495 nm處檢測其吸光度,利用標準曲線計算熒光黃的濃度。以未接種細胞的Transwell板做為空白組。熒光黃的滲透率公式及表觀滲透系數計算公式如下:

式中:Papp:表觀滲透系數,cm/s;dQ/dt:單位時間內熒光黃的轉運量;A:膜的表面積,cm2;C0:AP側中熒光黃的初始濃度,mg/mL。

1.2.3.3 多肽水解液的吸收轉運實驗 參照文獻[19]中的方法,Caco-2細胞在Transwell板上形成緊密完整的單細胞層后,用HBBS沖洗板中各孔室的細胞3次,然后在每個孔室中都加入1 mL的HBBS,并放入37 ℃,5% CO2培養箱中孵育30 min,除去細胞膜表面的附著物、培養基質和HBBS緩沖液。牛乳酪蛋白多肽水解液用HBSS稀釋至5 mmol/L。多肽水解液從A池至B池的過膜實驗操作:在A池加入0.5 mL水解液,B池加0.5 mL的HBSS,放入CO2培養箱中繼續培養1 h后,分別在B池中收集過膜液0.5 mL,平行3個孔。檢測AP及BL多肽氮含量,HPLC檢測2 h水解液組成。

1.2.4 測定水解液中肽氮含量和生物利用度 用凱氏定氮法測定消化液中總氮含量[20]。TNBS法測定消化液中游離氨基酸氮含量[21]。

肽氮含量(g)=總氮含量-游離氨基氮含量

1.2.5 水解液RP-HPLC檢測 將各酪蛋白水解液樣品用0.45 μm的濾膜微濾上樣。色譜條件:色譜柱:Diamonsil TMC18(Φ4.6 mm×250 mm,5 μm);進樣量:20 μL;流速:1.0 mL/min;檢測波長:220 nm;柱溫:30 ℃;流動相A:含0.1% TFA乙腈,流動相B:含0.1% TFA超純水;0～30 min,10%～35%流動相A;30～40 min,35%～10%流動相A;40～50 min,10%流動相A[22]。

1.3 數據處理

用Origin軟件作圖并用SPSS 9.0進行統計學分析。

2 結果與討論

2.1 酪蛋白胃腸水解液抗氧化性分析

由圖1可知,酪蛋白胃水解液的DPPH·自由基清除率先增大后減小。在水解2 h前抗氧化活性逐漸增強,到2 h時DPPH·自由基清除率達到最大值46.40%;隨著反應的進行,DPPH·自由基清除率有所下降,最后趨于平緩,維持在34.51%左右,2 h后分子變小,抗氧化活性反而降低。食物蛋白質在胃內的停留時間為4～5 h,因此酪蛋白的模擬胃水解多肽在胃內具有抗氧化活性。酪蛋白腸水解液的DPPH·自由基清除率先增大后減小,2 h DPPH自由基清除率達到最大56.7%;2 h以后繼續消化,肽段被水解為更小分子的肽段或者氨基酸,使部分肽段的抗氧化活性降低,DPPH自由基清除率在3、4、5 h分別降至53.50%、51.80%、50.68%,但仍保持一定活性,這是由于某些氨基酸的特殊結構使其具有抗氧化活性,如組氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、色氨酸等[23],所以水解時間內的DPPH自由基清除率與0 h相比均升高。并且人工腸液的消化物的DPPH自由基清除率明顯高于人工胃液消化物(p<0.05),這可能是由于人工腸液消化的水解度較大,生成了較多具有抗氧化活性的多肽。

圖1 不同時間胃腸水解液對自由基清除率的影響Fig.1 The influence of gastric and intestinal intestinal juice hydrolysis time on free radical clearance

2.2 酪蛋白水解液抗菌活性檢測

由表1可知,酪蛋白并沒有顯著抑菌作用。兩種受試菌中均表現為抑菌圈直徑大小隨時間的延長先增大后減小,直到最后不產生抑菌圈。其中水解2 h的多肽液抑菌圈直徑最大,對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都具有最強的抑菌效果,即對革蘭氏陰性菌與陽性菌均能產生抑制作用。當水解時間在2～5 h范圍時,具有抑菌活性的多肽進一步被水解成沒有抗菌活性的小肽片斷,因此多肽液的抑菌圈直徑隨水解時間延長而逐漸減小,當抗菌活性肽濃度低于最小抑菌濃度時就不再有抑菌圈出現。

由表2可知,腸消化物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性在2 h時顯著升高(p<0.05),對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑均達到較高值,隨著反應時間的延長,抑菌活性又明顯降低。出現這種趨勢是由于人工胃液消化產生的具有抑菌活性的肽段,經過人工腸液再消化將進一步消化,從而使其降解為活性較低的肽段,但隨著消化時間的延長,又形成了一些新的小分子活性肽段,從而使抑菌能力有所提高,之后這些小分子的活性肽段又被進一步分解[6]。

表1 不同時間胃水解液對兩種菌的抑菌圈直徑Table 1 Different time stomach hydrolysate on bacteriostatic circle diameter of two kinds of bacteria

注:a表示與0 h相比差異顯著(p<0.05);表2同。

表2 不同時間腸水解液對兩種菌的抑菌圈直徑Table 2 Different time of intestine hydrolysate on bacteriostatic circle diameter of two kinds of bacteria

2.3 Caco-2單層細胞膜模型的建立

2.3.1 Caco-2細胞形態學結果分析 細胞顯微鏡觀察顯示,在經過1 d培養后,細胞為不規側的扁狀,培養21 d時,細胞生長均勻,無白泡,可清楚看見Caco-2細胞形狀為不規則的扁狀,細胞形態完整,細胞之間緊密連接。但是無法證明單層膜的致密程度,其致密度還需要進一步驗證。

圖2 Caco-2細胞在Transwell板上培養單層膜形態圖(10×)Fig.2 Caco-2 cells are grown on the Transwell board form figuremonolayer film(10×) 注:左圖為培養1 d,右圖為培養21 d的細胞單層膜。

2.3.2 細胞TEER結果分析 12孔Transwell板上測得的TEER值如圖3所示。Caco-2細胞單層膜的致密性隨著培養時間延長而呈遞增趨勢。前8 d細胞的跨膜電阻增長較慢,到第8 d電阻達到(321±25) Ω·cm2,之后快速增大,第21 d時達到(1086±50) Ω·cm2,最后3 d增長趨于平緩,穩定在1100 Ω·cm2左右,與其它組的電阻率存在顯著性差異(p<0.05),說明Caco-2細胞形成了致密完整的單層膜,可以進行過膜實驗。

圖3 Caco-2細胞單層膜TEER值隨時間變化圖Fig.3 Caco-2 cell monolayer TEER value variation over time

2.3.3 熒光黃通透性的結果分析 利用熒光黃來檢測Caco-2單層膜表觀通透性(Papp),由于離子經過細胞旁間隙透過的量恒定,故用標記物熒光黃進行細胞間隙和致密度檢測。細胞緊密完整,則Papp值要小于0.5×10-6cm/s值,且Papp值還要處于10-6cm/s數量級上[24]。熒光黃濃度檢測的標準曲線:Y=124.79X+0.12796,R2=0.997;熒光黃的Papp值為0.37×10-6cm/s,小于0.5×10-6cm/s,達到相關文獻報道中的范圍[18],且平均透過率為0.37%,而空白對照組Papp值為5.9×10-5cm/s,遠遠大于0.5×10-6cm/s,且平均透過率為95%。結果表明:Caco-2細胞在Transwell板中連續培養21 d,所建立的Caco-2單層膜致密、完整,達到實驗要求,可以用于過膜實驗。

2.4 水解液中肽氮含量和生物利用度

收集不同時間水解液分別過單層Caco-2細胞膜后,檢測此時的肽氮生物利用率,如圖4所示,消化2 h的胃液生物消化率達到7.79%,消化2 h的胃腸水解液達到15.11%,之后基本持平,說明2 h后隨著酶切位點減少,蛋白酶的活性達到飽和,生物利用度增加緩慢,直到5 h才分別增加了1.08%和1.77%。從圖4中還可以看出，胰蛋白酶的水解度顯著高于胃蛋白酶的水解度(p<0.05),說明胰蛋白酶更易水解酪蛋白。

圖4 不同消化時間胃腸液過膜前后生物利用度Fig.4 Bioavailability of AP and BL of casein hydrolysate at the different digestion time

2.5 酪蛋白在腸Caco-2細胞上的轉運吸收

對Transwell的A、B池多肽水解液通過RP-HPLC檢測進行對比分析,RP-HPLC檢測結果如圖5、圖6所示。

圖5 胃水解多肽液過膜前后HPLC分析圖Fig.5 Stomach hydrolytic polypeptide liquid membrane before and after RP-HPLC analysis diagram注:A為體外胃水解2 h多肽液;B為A側剩余多肽液;C為過膜后B側多肽液;上方箭頭表示為通過部分;下方箭頭為消失部分;下方粗箭頭為未通過部分,圖6同。

圖6 腸水解多肽液過膜前后HPLC分析圖Fig.6 Pancreatic enzyme hydrolysis polypeptide liquid membrane before and after RP-HPLC analysis diagram注:A為體外腸水解2h多肽液;B為A側剩余多肽液;C為過膜后B側多肽液。

從圖5可知,經Caco-2單層細胞吸收后,在保留時間為18.10、22.20、25.50、27.21、33.24 min等的峰可以通過Caco-2單細胞層,還有26.04、31.00 min等的峰未在B、C上出現。從圖6可知,經Caco-2單層細胞吸收后,在保留時間為18.11、19.00、22.03、24.11、25.50、27.13、33.20 min等的峰可以通過Caco-2單細胞層,28.00、33.01 min的峰未能通過單層細胞膜,23.40、23.70、29.20、34.00 min時的峰未在B、C上出現。推測多肽可能被膜上相關代謝酶水解。

據報道,當用RP-HPLC C18柱檢測多肽液時,保留時間為12～23 min和23～30 min的峰分別為親水性多肽和疏水性多肽,不能被單層膜吸收的多肽既有親水性也有疏水性,親水性多肽更易于通過,疏水性多肽不易通過,易被降解或阻止[25],被膜上相關代謝酶水解的多肽同樣為疏水性多肽,同時疏水性多肽未通過的時間段明顯高于親水性。如圖5中26.04、31.00 min的峰,圖6中23.40、29.20 min的峰。由于細胞有3種不同的運輸路線,包括載體運輸、細胞間連接的運輸和胞吞胞吐,這三種方式選擇性的參與到親疏水多肽的運輸中。每個多肽的結構性質不同,可能存在多種運輸路線,而且在腸吸收時疏水性的多肽還有一定的過膜量,所以親水性多肽大部分、疏水性小部分可以被成功吸收進入單細胞層下側。

3 結論

酪蛋白的水解產物隨著水解時間延長,使水解物中肽段進一步分解,導致其抗氧化活性在水解2 h后呈現降低趨勢。胃腸水解液中的抗菌肽對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有抑制作用,對革蘭氏陰性菌與陽性菌均能產生抑制作用,具有較廣的抗菌譜。這與水解液中的多肽組成有關系,亟待進一步的研究。RP-HPLC結果顯示,親疏水性的多肽能被成功吸收進入單細胞層下側,但疏水性多肽大部分不易通過,易被降解或阻止,也證明多肽兩極的肽段能被腸液優先消化水解,并且可以產生許多親水性的多肽,而親水性的多肽能夠保持更多肽鏈不受腸消化的破壞,所以水解作用引起總的疏水性減少,一些肽鍵被分解為兩個高親水性的化學基團。

[1]Hogan S,Lei Z,Li J,et al. Development of antioxidant rich peptides from milk protein by microbial proteases and analysis of their effects on lipid peroxidation in cooked beef[J]. Food Chemistry,2009,117(3):438-443.

[2]Meisel H.Bioactive peptides from milk protein:a perspective for consumers and producers[J].Austr J Dairy Technol,2001(56):83-91.

[3]宮霞,凌慶芝. 乳酪蛋白源抗高血壓活性肽的制備及其生理活性[J]. 上海交通大學學報,2009,27(1):53-56.

[4]Plank J,Andres P,Krause I,et al. Gram scale separation of casein proteins from whole casein on a Source 30Q anion-exchange resin column utilizing fast protein liquid chromatography(FPLC)[J]. Protein Expression & Purification,2008,60(2):176-181.

[5]Silva S V,Malcata F X.Caseins as source of bioactive peptides[J].International Dairy Journal,2005,15(1):1-15.

[6]龐廣昌,陳慶森,胡志和,等. 蛋白質的消化吸收及其功能評述[J]. 食品科學,2013,34(9):375-391.

[7]Maruyama S,Mitachi H,Tanaka H,et al. Studies on the active site and antihypertensive activity of angiotensin I-converting enzyme inhibitors derived from casein[J]. Agricultural and Biological Chemistry,1987,51(6):1581-1586.

[8]徐鑫,何佳易,劉國艷,等. 響應曲面法優化胰蛋白酶酶解條件制備乳源免疫活性肽[J]. 食品科學,2011,32(19):174-179.

[9]劉珊珊,敖靜,謝寧寧,等. 酪蛋白抗氧化肽的胃腸消化穩定性研究[J]. 中國食品學報,2014,14(2):47-53.

[10]吳軍,翁春梅,劉曉東,等.外翻腸囊法研究靈仙新苷腸吸收動力學[J].中國新藥雜志,2014,23(5):601-605.

[11]關溯,陳孝,黃民.Caco-2細胞模型-藥物吸收研究的有效“工具”[J].中國藥理學通報,2004,20(6):609-614.

[12]丁龍. 蛋清源ACE抑制肽的結構與完整吸收關系研究[D]. 長春:吉林大學,2015.

[13]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].第二版.北京,中國醫藥科技出版社,2005:158.

[14]Guo H,Kouzuma Y,Yonekura M. Structures and properties of antioxidative peptides derived from royal jelly protein.[J]. Food Chemistry,2009,113(1):238-245.

[15]謝強,林玉桓,苗淑萍,等. 香芹酚對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細胞膜的影響[J]. 食品工業科技,2014,35(23):54-58.

[16]Gianluca Picariello,Giuseppe Iacomino,Gianfranco Mamone,et al. Transport across Caco-2 monolayers of peptides arising frominvitrodigestion of bovine milk proteins[J]. Food Chemistry,2013(139):203-212.

[17]Hosoya K-I,Kim K-J,Lee V H. Age-dependent expression of P-glycoprotein gp17O in Caco-2 cell monolayers[J]. Pharmaceutical Research,1996,13(6):885-890.

[18]尤青,馬增春,譚洪玲,等.人參水提物在Caco-2模型的吸收特征[J].中國藥理學通報,2013,29(12):1711-1716.

[19]Ranaldi G,Conaalvo R,Sambuy Y,et al.Permeability characterististics of parental and clonal human intestinal Caco-2 cell lines differentiated in serum supplemented and serum-free media[J].Toxicol InVitro,2003,17(5-6):76-767.

[20]魯健章,孫麗華,周彥鋼. 凱氏定氮法測定魚蛋白質含量的干擾因素分析[J]. 食品科學,2010,31(19):453-456.

[21]Samaranayaka A G,Kitts D D,Li-Chan E C. Antioxidative and angiotensin-I-converting enzyme inhibitory potential of a Pacific Hake(Merlucciusproductus)fish protein hydrolysate subjected to simulated gastrointestinal digestion and Caco-2 cell permeation[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry,2010,58(3):1535-1542.

[22]Ningning Xie,BoWang,Liangping Jiang,et al. Hydrophobicity exerts different effects on bioavailability and stability of antioxidant peptide fractions from casein during simulated gastrointestinal digestion and Caco-2 cell absorption[J].Food Research International,2015(76):518-526.

[23]李東平. 酶解水牛乳蛋白制備降血壓肽的研究[D]. 南寧:廣西大學,2012.

[24]莫李立,王素軍,楊本坤.阿魏酸在Caco-2細胞模型的通透性及其在大鼠體內吸收特性研究[J].中草藥,2012,43(5):947-951.

[25]Parrot S,Degraeve P,Curia C,et al.Invitrostudy on digestion of peptides in Emmental cheese:analytical evaluation and influence on angiotensin I converting enzyme inhibitory peptides[J]. Die Nahrung,2003,47(2):87.

Thebioacitvedetectionandmechanismofcell-basedabsorptiononsimulatinggastrointestinalhydrolysisofcasein

XUEHai-yan,LIShan,DURui-xuan,HANBo,ZHANGYing

(Institute of Food Biotechnology,Shaanxi University of Science and Technology,Xi’an 710021,China)

TS201.3

A

1002-0306(2017)18-0014-06

2017-02-28

薛海燕(1979-)，女，博士，副教授，研究方向：食品免疫檢測技術，E-mail：xuehaiyan@sust.edu.cn。

國家自然科學基金項目(31301405)；陜西省科技統籌計劃項目(2013KTZB02-02-05(2))；陜西省教育廳專項項目(16JK1101)。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.003