利用SRAP標記快速檢測西瓜雜交種子純度

韓宏偉，王 浩，佘建華，王 強，莊紅梅，劉會芳，李 寧

(新疆農業科學院園藝作物研究所，烏魯木齊 830011)

利用SRAP標記快速檢測西瓜雜交種子純度

韓宏偉，王 浩，佘建華，王 強，莊紅梅，劉會芳，李 寧

(新疆農業科學院園藝作物研究所，烏魯木齊 830011)

目的以設施、露地兼用西瓜雜交品種早佳(84-24)及其父本、母本為試驗材料，利用SRAP分子標記技術進行DNA指紋圖譜構建，篩選出能夠快速檢測西瓜早佳(84-24)雜交種子純度的SRAP標記。方法選取28對SRAP引物，對供試西瓜品種早佳(84-24)及其父、母本的基因組DNA進行擴增，篩選出擴增多態性好、條帶清晰、穩定的SRAP引物作為候選標記，利用100粒雜交種子進行純度檢測準確性驗證。結果28對供試引物中有22對引物在F1及其父、母本之間擴增出多態性條帶，多態性比率為78.6%，其中有1對為父本顯示，母本缺失的顯性SRAP引物(Me6F/ Em2R)。用顯性引物(Me6F/ Em2R)對100粒西瓜雜交種子進行純度檢測，經聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，純度為99.0%，與田間形態學鑒定結果(99.1%)基本一致。結論利用SRAP標記(Me6F/ Em2R)，結合聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，可以對西瓜雜交種早佳(84-24)的純度進行快速、準確鑒定。SRAP分子標記技術在西瓜雜交種子純度室內快速檢測中有很大的應用前景。

西瓜；SRAP標記；雜交種子純度；快速檢測

0 引 言

【研究意義】純度是種子質量的重要指標，也是種子分級的主要依據[1]。種子質量的優劣直接影響農產品質量和優良品種的增產潛力。目前西瓜雜交種子純度檢測主要以田間種植鑒定為主。不僅鑒定周期較長，且易受外界環境及人為因素的影響，結果并不十分可靠，快速、準確的鑒定西瓜雜交種子純度已顯得十分有必要。【前人研究進展】近年來隨著分子標記技術的發展，使西瓜雜交種純度快速鑒定成為可能。人們相繼開展了擴增片段長度多態性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)技術、隨機擴增多態性DNA標記(random amplified polymorphism DNA,RAPD)技術、簡單重復序列(simple sequence repeat,SSR)技術等在西瓜種子純度鑒定中應用研究[2]。因受技術本身的特點限制，并沒有在生產上得到廣泛應用。AFLP技術需要較高的試驗技能和高精度的儀器設備，難以普及推廣。RAPD技術雖然操作簡單、經濟快捷、多態性高，應用范圍廣，但對藥品、反應條件、操作等要求極為苛刻，擴增具有隨機性，結果重復性較低，限制了該技術的應用。而設計SSR引物需要對SSR位點進行分子克隆和 DNA 序列分析，給SSR 技術的開發和利用帶來了一定的困難。SRAP(Sequence-related amplified polymorp-hism)，相關序列擴增多態性，是一種新型的基于PCR的標記，由美國加州大學蔬菜作物系Li與Quiros[3]于2001年提出，SRAP的原理是利用獨特的引物設計對 ORFs(open reading frames)進行擴增，上游引物長17 bp，5’端的前10 bp是一段填充序列，緊接著是CCGG，組成核心序列及3’端3個選擇堿基，對外顯子進行特異擴增。SRAP操作簡便、擴增結果穩定、高效、重復性好等優點，已經被應用于圖譜構建[4]、比較基因組學、遺傳多樣性分析、基因連鎖標記開發及基因定位[5,6,7]和比較基因組學[7]的研究中。中國近年來關于SRAP分子標記在種子純度檢測中的應用已有很多，例如在西瓜[8]、瓠瓜[9]、花生[10]等作物上的運用。劉澤發等[8]研究結果表明，引物對E2/M5在紅小玉雜交種和親本間擴增出品種特異性條帶，適合在室內快速準確地進行雜交種的純度鑒定，試驗結果與大田鑒定結果吻合率高。張建成等[10]研究了分屬3個市場型的10個中國花生栽培種的序列相關擴增多態性( SRAP)，結果表明SRAP技術可以揭示花生栽培種的遺傳差異。郭慶華[11]利用 SRAP 標記技術，在兩親本及基因池間篩選45對引物，通過單株驗證，獲得與紅花苞葉刺性狀連鎖的1個SRAP標記(M3E3)。根據苞葉是否有刺以及是否擴增出的特異性條帶，計算出該標記和有刺紅花基因之間的交換值為 11.4%，說明兩者之間緊密連鎖。從片段的精確長度和堿基組成，認為紅花苞葉刺性狀緊密連鎖的SRAP標記M3E3可作為無刺紅花品種選育的輔助分子標記。【本研究切入點】利用SRAP標記技術進行雜交種子純度鑒定、遺傳差異分析及品種輔助選擇方面已有較多研究，但在西瓜雜交種子純度鑒定的研究報道較少，研究擬以西瓜雜交種早佳(84-24)及其父本、母本為試材，利用SRAP標記技術，結合聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，篩選出能夠快速檢測西瓜早佳(84-24)雜交種子純度的SRAP標記。【擬解決的關鍵問題】研究利用SRAP標記技術，結合聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，以西瓜雜交種早佳(84-24)及其父本、母本為試材，篩選出能夠快速檢測西瓜早佳(84-24)雜交種子純度的SRAP標記。為西瓜雜交種早佳(84-24)種子純度的快速、準確檢測提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為西瓜雜交種早佳(84-24)及其父本、母本種子，由新疆農業科學院園藝作物研究所提供。PCR所用的SRAP引物、dNTPs、TaqDNA酶、過硫酸銨、甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、瓊脂糖、Tris、EDTA-Na2·2H2O等生化試劑均購于生工生物工程(上海)股份有限公司；其它試劑均為進口或國產分析純。表1

1.2 方 法

1.2.1 供試材料DNA提取

將供試西瓜雜交種早佳(84-24)F1代及其父本、母本種子在新疆農業科學院安寧區綜合試驗場播種，開花坐果后根據果皮形態特征，分別采集F1、父本和母本植株的幼嫩葉片，用于DNA提取，方法采用改良的CTAB法[12]；從供試西瓜雜交種早佳(84-24)F1代種子樣品中隨機選取100粒，用于SRAP標記檢測的準確性驗證，DNA提取參考姜陸[13]的方法。

1.2.2 SRAP多態性標記的篩選與擴增

SRAP-PCR反應體系(25 μL)：DNA(50 ng/μL)1 μL，2×TaqMaster Mix 12.5 μL，引物(10 μmol/L)各1 μL，加無菌水至25 μL。PCR反應程序：94℃預變性4 min，94℃變性40 s，35℃復性40 s，72℃延伸90 s，5個循環；94℃變性40 s，50℃復性40 s，72℃延伸90 s，30個循環；72℃延伸10 min，4℃保存；擴增產物用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。

2 結果與分析

2.1 多態性SRAP標記篩選

選取的28對SRAP引物組合對早佳F1代及其父本、母本基因組DNA進行多態性擴增，產物經6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，結果表明，有22對引物在F1代及其父本、母本之間擴增出多態性條帶，多態性比率為78.6%。其中引物Me6F/ Em2R(5’-TGAGTCCAAACCGGGCT-3’/ 5’- GACTGCGTACGAATTAAT-3’)為顯性標記，表現為父本和F1代擴增出230 bp的特異性條帶，母本則無此條帶。圖1

表1 供試SRAP引物組合及序列信息
Table 1 The No. and sequence of SRAP primers used in the experiment

引物序號PrimersNo．引物組合Primerspairs正向引物序列5’-3’Forwardprimerssequence5’-3’反向引物序列5’-3’Reverseprimerssequence5’-3’1Me1F/Em1RTGAGTCCAAACCGGATAGACTGCGTACGAATTATT2Me1F/Em2RTGAGTCCAAACCGGATAGACTGCGTACGAATTAAT3Me1F/Em3RTGAGTCCAAACCGGATAGACTGCGTACGAATTTGC4Me1F/Em5RTGAGTCCAAACCGGATAGACTGCGTACGAATTTGA5Me1F/Em6RTGAGTCCAAACCGGATAGACTGCGTACGAATTAAC6Me3F/Em1RTGAGTCCAAACCGGATGGACTGCGTACGAATTATT7Me3F/Em2RTGAGTCCAAACCGGATGGACTGCGTACGAATTAAT8Me3F/Em3RTGAGTCCAAACCGGATGGACTGCGTACGAATTTGC9Me3F/Em5RTGAGTCCAAACCGGATGGACTGCGTACGAATTTGA10Me3F/Em6RTGAGTCCAAACCGGATGGACTGCGTACGAATTAAC11Me4F/Em1RTGAGTCCAAACCGGACAGACTGCGTACGAATTATT12Me4F/Em2RTGAGTCCAAACCGGACAGACTGCGTACGAATTAAT13Me4F/Em3RTGAGTCCAAACCGGACAGACTGCGTACGAATTTGC14Me4F/Em5RTGAGTCCAAACCGGACAGACTGCGTACGAATTTGA15Me4F/Em6RTGAGTCCAAACCGGACAGACTGCGTACGAATTAAC16Me4F/Em7RTGAGTCCAAACCGGACAGACTGCGTACGAATTGCA17Me6F/Em1RTGAGTCCAAACCGGGCTGACTGCGTACGAATTATT18Me6F/Em2RTGAGTCCAAACCGGGCTGACTGCGTACGAATTAAT19Me6F/Em3RTGAGTCCAAACCGGGCTGACTGCGTACGAATTTGC20Me6F/Em5RTGAGTCCAAACCGGGCTGACTGCGTACGAATTTGA21Me6F/Em6RTGAGTCCAAACCGGGCTGACTGCGTACGAATTAAC22Me6F/Em7RTGAGTCCAAACCGGGCTGACTGCGTACGAATTGCA23Me7F/Em1RTGAGTCCAAACCGGTAAGACTGCGTACGAATTATT24Me7F/Em2RTGAGTCCAAACCGGTAAGACTGCGTACGAATTAAT25Me7F/Em3RTGAGTCCAAACCGGTAAGACTGCGTACGAATTTGC26Me7F/Em5RTGAGTCCAAACCGGTAAGACTGCGTACGAATTTGA27Me7F/Em6RTGAGTCCAAACCGGTAAGACTGCGTACGAATTAAC28Me7F/Em7RTGAGTCCAAACCGGTAAGACTGCGTACGAATTGCA

注：M為Marker DL2000；泳道1～36分別為引物組合17～28對供試雜交種的父本、母本和F1的擴增結果

Note: M:Marker DL2000; Lane 1-36: The amplification of paternal、 female and hybrid seed of Zaojia(84-24) by using A-L SRAP marker, respectively

圖1 西瓜雜交種早佳(84-24)部分多態性SRAP引物篩選
Fig.1 SRAP primers selection in watermelon hybrid of Zaojia(84-24)

2.2 西瓜早佳(84-24)雜交種子純度的鑒定

用SRAP引物(Me6F/ Em2R)對100粒西瓜早佳(84-24)雜交種子進行群體驗證，研究表明，100粒供試雜交種子中有99份擴增出了230 bp特異性條帶，只有泳道2的帶型與圖1中泳道8(母本)一致，被鑒定為假雜種，即供試西瓜雜交種子的純度為99.0%。供試西瓜雜交種早佳(84-24)F1代種子樣品在田間形態學鑒定中表現為，216株供試植株中有2個(母本自交株)假雜株，純度為99.1%，與SRAP標記分子檢測的結果基本一致。圖2

注：M1為Marker DL2000，M2為Marker B；泳道1～35為引物(Me6F/ Em2R)對部分供試雜交種子的擴增結果

Note: M1:Marker DL2000; M2:Marker B; Lane 1-35: The amplification of hybrid seed of Zaojia(84-24) by using Me6F/ Em2R SRAP marker

圖2 SRAP標記(Me6F/ Em2R)對西瓜早佳(84-24)雜交種子的擴增產物
Fig.2 SRAP profile of Zaojia(84-24 ) hybrid amplified with primer C(Me6F/ Em2R)

3 討 論

在西瓜雜交制種過程中，導致雜交種子中含有母本自交苗(假雜種)的主要原因是母本雌花隔離不徹底或授粉不及時。目前生產上對西瓜雜交種子純度的鑒定主要采用田間形態學鑒定的方法，即根據F1代雜交種與其母本之間在果實皮色、種皮顏色、葉片形狀等形態學上的差異來區分真假雜交種。早佳(84-24)F1雜交種與其母本之間形態學上的最大區別在于果實皮色，表現為F1雜交種果皮為綠底墨綠色實心條帶，而母本果皮則為淺綠底核桃紋形條帶，生產中常以此作為檢測早佳(84-24)真假雜交種的形態學標記。采用此方法需要將待檢測樣品田間播種，正常開花坐果后才能得出鑒定結果，且新疆無霜期較短，當年生產的雜交種子往往次年才能進行純度鑒定，或需要在南方進行異地鑒定，不僅鑒定周期較長，成本也較高。

研究篩選出的1對顯性SRAP標記(Me6F/ Em2R)，PCR擴增后經6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，能夠快速、準確的區分西瓜早佳(84-24)雜交種和母本自交苗(假雜種)，可以用來進行雜交種子純度檢測。采用此方法，一個熟練的技術人員可以在一個工作日內完成約 100 份樣品 DNA 的提取、PCR的擴增以及擴增產物的電泳檢測，使西瓜雜交種子純度的檢測效率大大提高，且更加的經濟和準確。

4 結 論

供試28對SRAP引物中有22對引物在西瓜雜交種早佳(84-24)及其父本、母本之間擴增出多態性條帶，多態性比率為78.6%，其中引物組合(Me6F/ Em2R)為顯性SRAP標記。利用SRAP標記(Me6F/ Em2R)，結合聚丙烯酰胺凝膠電泳對100份西瓜早佳(84-24)雜交種子純度進行檢測，其雜交種子純度為99.0%，與田間形態學鑒定結果(99.1%)基本一致；西瓜雜交種早佳(84-24)種子純度可以利用SRAP標記(Me6F/ Em2R)結合6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳技術，進行室內分子快速檢測，且檢測效率及準確率較高。

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Abstract：【Objective】 To screen out one SRAP marker to detect seed purity，the watermelon hybrids of Zaojia (84-24) and its paternal and female lines were used to study the polymorphorrism of amplifiable spectral bands.【Method】Polymorphic primer pairs were selected from 28 SRAP primer pairs for Zaojia (84-24) hybrids and their parents in this experiment. The SRAP primers with good polymorphism, clear bands and s
Table primers were selected as candidate markers, and the purity of the 100 hybrid seeds was tested and verified.【Result】The results showed that 28 pairs of primers had 22 pairs of primers, and polymorphic bands were amplified between F1and its parents. The ratio of polymorphism was 78.6%, among which, there was only one pair of complementary type SRAP primer(Me6F/ Em2R)with male display and lack of female parent, The result showed the purity of hybrid seeds was 99.0%, which was basically the same as the field morphological identification (99.1%).【Conclusion】SRAP primer (Me6F/Em2R), in combination with Polyacrylamide gel electrophoresis can be used to detect the purity of Zaojia (84-24) hybrid seed rapidly and accurately. There is a great prospect of application in using this method.

Keywords: watermelon; SRAP molecular marker; hybrid seed purity; rapid detection

UsingSRAPMarkersforRapidDetectionofZaojia(84-24)WatermelonHybridSeedPurity

HAN Hong-wei, WANG Hao, SHE Jian-hua, WANG Qiang, ZHUANG Hong-mei,LIU Hui-fang, LI Ning

(ResearchInstituteofHorticulturalCrops,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China)

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.09.007

S651

A

1001-4330(2017)09-1621-06

2017-07-05

新疆維吾爾自治區公益性科研院所基本科研業務費專項“蔬菜品種收集引進及篩選利用研究”(KYGY2016119)；新疆農業科學院青年基金項目“基于SRAP標記的西瓜雜交種早佳(84-24)純度的快速檢測體系構建”(xjnkq-2015008)

韓宏偉(1986-)，男，河南人，助理研究員，研究方向為特色瓜菜種質資源創新與新品種選育，(E-mail)hhwei2010@sohu.com

王浩(1970-)，男，山東人，研究員，研究方向為蔬菜栽培與生理，(E-mail)Wanghao183@163.com

Supported by: The Basic Research Funding for the Public Welfare Research Institutes of Xinjiang Uygur Autonomous Region "Study on Collection, Introduction and Selection of Vege
Table Germplasm" (KYGY2016119); The Youth Fund Project of Xinjiang Academy of Agricultural Sciences "The Construction of Rapid Detection System to Detect the Purity of Zaojia 84-24 Watermelon Seed by SRAP Markers (xjnkq-2015008)

Corresponding author：WANG Hao(1970-), Professor，Bachelor of Agriculture, Vege
Table cultivation and physiology. (E-mail) Wanghao183@163.com