玉米ZmCPK9基因在非生物脅迫下的表達分析

足木熱木·吐爾遜，陳勛基，陳 果，李建平，郝曉燕，黃全生

(新疆農業科學院核技術生物技術研究所，烏魯木齊 830091)

玉米ZmCPK9基因在非生物脅迫下的表達分析

足木熱木·吐爾遜，陳勛基，陳 果，李建平，郝曉燕，黃全生

(新疆農業科學院核技術生物技術研究所，烏魯木齊 830091)

目的鈣依賴蛋白激酶(CPKs)是一類依賴于Ca2+的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，僅在植物和部分低等生物中存在。Ca2+作為第二信使，在植物生長發育和抗逆應答過程中起著重要作用。研究玉米ZmCPK9基因在幼苗期不同逆境脅迫下的動態表達，為分析該基因在玉米逆境應答中的功能和機制奠定基礎。方法利用生物信息學方法，分析ZmCPK9基因序列特征，采用Real-time PCR技術分析ZmCPK9在干旱、低溫、鹽和ABA誘導下的表達特征。結果利用生物信息學方法從玉米基因組中鑒定出CPK基因，命名為ZmCPK9。序列分析表明ZmCPK9 cDNA序列長1 548 bp，編碼515個氨基酸。生物信息學分析顯示，在蛋白質序列和結構上該基因與其他物種CPK基因一樣非常保守。Real-time PCR的結果表明，在干旱、低溫、鹽和ABA誘導下，ZmCPK9表達量均有所上調。結論ZmCPK9是玉米CPKs基因家族中一個新的成員，對干旱、低溫、鹽和ABA等非生物脅迫具有應答反應，推測ZmCPK9對植物防御非生物脅迫具有一定作用。

玉米；CPK9基因；非生物逆境

0 引 言

【研究意義】玉米是重要的糧食作物和經濟作物之一。生產上，玉米常常受到干旱、低溫、鹽等非生物因素脅迫，可導致減產甚至絕收，對農業生產造成不可限量的損失。而Ca2+是轉導途徑中的第二信使，在調節植物生長發育和抵抗逆境脅迫中發揮著重要作用。鈣依賴的蛋白激酶(Calcium dependent protein kinases)，全稱是鈣依賴的鈣調素不依賴的蛋白激酶(Calcium-dependent calmodulin-independent protein kinases)，簡稱CPKs[1]。生物信息學分析發現玉米ZmCPK9基因與其他物種中的CPKs基因有相似或部分相似的功能，推測可能參與了非生物脅迫的應答。因此，研究ZmCPK9基因在幼苗期對干旱、低溫、鹽和ABA等不同逆境脅迫下的動態表達，為對搞清該基因在玉米逆境應答中的功能和機制具有實際意義。【前人研究進展】CPKs在大豆中[2]存在以來，相繼在多種植物中發現蛋白激酶。研究表明CPKs廣泛存在于植物體內，是植物體內最大的Ca2+調控蛋白激酶家族，在擬南芥[3]、水稻[4]、小麥[5]和玉米[6]等植物中分別發現有34、31、20和40個CPKs基因家族成員。數目眾多的CPKs基因家族和廣泛的細胞內定位都暗示了CPKs基因在植物信號轉導途徑中具有廣泛的功能。目前，對來自不同物種的CPKs基因的生物學功能仍了解甚少，其表達和代謝過程的調節機制等方面還有待進一步研究。【本研究切入點】研究報道CPKs基因與植物的抗逆作用息息相關[7]，對玉米ZmCPK1、ZmCPK17、ZmCPK22、ZmCPK28和ZmCPK34基因克隆并進行了功能鑒定[8]，而對玉米ZmCPK9基因尚待研究。研究玉米ZmCPK9基因在幼苗期不同逆境脅迫下的動態表達。【擬解決的關鍵問題】以玉米自交系B73為材料，用生物信息學和Real-time PCR對ZmCPK9基因進行分析。

1 材料與方法

1.1 材 料

玉米瑞德黃馬牙(Reid yellow Dent)系列B73，屬堅稈綜合種，具有早熟和配合力高等優點，是美國當代商業育種中重要玉米自交系的祖先種，在生產上已得到廣泛應用[9]。因此，選擇玉米自交系B73為實驗材料(實驗室保存)。當幼苗生長至三葉期，分別進行干旱(土壤含水量達到60%開始處理)、低溫(4 ℃)、NaCl(200 mmol/L水培)和ABA(100 μmol/L水培)4種脅迫處理，在處理后0(CK)、1、3、6、12和24 h取整株幼苗，置于液氮中速凍，-80℃冰箱保存備用。實驗設置3次重復。

所用Trolzol試劑、Real-timePCR試劑盒、反轉錄酶、TaqDNA聚合酶和RNA酶抑制劑均購自寶生物工程有限公司；引物及其他試劑均購自生工生物工程(上海)有限公司。

1.2.1 ZmCPK9的生物信息學

利用NCBI中Blastp[10]、CCD[11]和Cobalt[12]工具分別對ZmCPK9進行氨基酸同源序列分析、功能域分析、基因序列比對分析和不同物種CPKs基因進化樹分析，并采用neighber-joning方法構建系統進化樹。利用ExPASy中ProtParampI/Mw[13]在線工具對ZmCPK9基因的蛋白序列的理化性質、氨基酸組成等一級結構進行預測，利用SignalP 4.1 Server[14]進行信號肽分析，利用ProtScale[13]進行疏水性/親水性預測，Profun2.2 Server[15, 16]進行功能預測，利用Psort[17]在線工具對編碼蛋白亞細胞定位進行預測，GORIV[18]對蛋白進行二級結構預測，通過SWISS-MODEL[19]在線軟件同源建模。除特殊說明外，軟件均設置為默認參數。

1.2.2 總RNA的提取和引物設計

參照試劑盒使用說明，采用TROLZOL試劑分別提取材料總RNA。根據Maize Sequence數據庫中(http://www.maizegdb.org)ZmGAPDH內參基因和ZmCPK9基因序列，用軟件Primer 5.0設計Real-time PCR特異性引物：

ZmGAPDH-F5'-CAACGACCCCTTCATCACCAGG-3'，

ZmGAPDH-R5'-ATACTCAGCGCCAGCCTCACCC-3'；

ZmCPK9-FCCACGTTTTGCCGAAGAAA，

ZmCPK9-RCCGCTTTTTTCGTGGCACT。

滌塵居臥室。燈下、床上，赤裸的柳含煙就像掉進冰窖里臉色蒼白。她吃力地睜開眼睛看到床前蕭飛羽的身影。“我不是有意的，我是想，我是想……”她沒有說下去，因為她竟然沒有聽到自己的聲音。

1.2.3 Real-time PCR

按Trolzol法提取總RNA樣品反轉錄合成cDNA，均一化后作為Real-time PCR模板，進行Real-time PCR擴增，檢測不同脅迫處理后ZmCPK9基因表達量變化。

Real-time PCR按SYBRPremixExTaqTMII試劑盒操作說明進行，20 μL反應體系：SYBR Green PCRMix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 8 μL。反應條件：95℃，1 min；95℃，10 s，60℃，20 s，72℃，30 s，40次循環。設置3次重復。以玉米ZmGAPDH為內參基因，相對表達量計算按照2-△△Ct法[20]。

1.3 數據處理

用GraphPad prism 6.0軟件進行統計分析，數值為平均值±標準差(means±SD)，n=3，差異顯著性分析采用Dunnett’st檢驗。

2 結果與分析

2.1 ZmCPK9基因序列的獲得與克隆

以擬南芥和水稻CPK基因序列和蛋白序列，經Blastx比對，結合Maize GDB數據庫中(http://www.maizegdb.org)分析，獲得一致性較高的ZmCPK基因家族序列，根據這些家族序列在Maize GDB數據庫中查找ZmCPK核酸序列，依據Blastx蛋白比對結果構建進化樹進行分析，可知玉米ZmCPK基因家族與水稻OsCPK和擬南芥的AtCPK基因家族的進化關系較近，可能在功能上具有相關性或相似性，根據Real-time PCR的實驗分析結果，對干旱、低溫、NaCl和ABA脅迫有應答的基因進行了基因的全長cDNA克隆[21]。

2.2 ZmCPK9基因的生物信息學

2.2.1 ZmCPK9基因特征

通過PT-PCR獲得ZmCPK9基因cDNA全長，在NCBI數據庫中，cDNA序列比對結果顯示，基因序列長1 548 bp，編碼515個氨基酸。Blastp發現，ZmCPK9與AtCPK9(Q42396.1)具有同源性，一致性為100%，因此，命名為ZmCPK9。CCD功能域分析顯示具有典型的CPK保守結構域，N末端均有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶域、Ca2+結合位點，在CPK特有的C端調控區(即是鈣結合區)，有4個EF-hands結構域。用Cobalt工具比較不同物種中CPKs蛋白序列，與玉米ZmCPK11、水稻OSCPK11、OSCPK9一致性分別為88%、90%和88%，這基因與玉米與水稻親緣關系相對較近。系統發育進化樹中ZmCPK9和水稻相應基因聚在一起也驗證了這一結果。圖1

2.2.2 ZmCPK9蛋白特征

ZmCPK9蛋白分子式為C2 508H3 955N693O759S25，分子量為56 761.68 kD，等電點(pI)9.14，平均疏水性(GRAVY)-0.295，脂肪系數(AI)83.75。GORIV軟件預測蛋白無規則卷曲所占的比例最高，占47.38%，其次是α-螺旋41.55%和延伸鏈11.07%，不含β-螺旋。通過在線SWISS-MODEL軟件對ZmCPK9和AtCPK9蛋白的三維結構進行預測，研究表明，兩者的三維結構預測結果十分相似。根據SignalP4.1Server軟件預測結果顯示ZmCPK9基因所編碼的蛋白不存在信號肽，為非分泌蛋白，它們在細胞質中合成后可能不被運轉。ProtScale軟件預測蛋白為弱親水性蛋白。Psort軟件預測ZmCPK9蛋白據其概率大小依次可能存在于內質網(膜)、質膜、微體(過氧物酶體)和細胞核。Profun2.2 Server軟件預測顯示ZmCPK9可能參與調控轉錄調控，屬裂解酶類。圖2

圖1 ZmCPK9和其他物種基于氨基酸序列的進化樹
Fig.1 Phylogenetic tree of ZmCPK9 and other plant species based on acid sequences

A:ZmCPK9 蛋白質三維結構預測；B:AtCPK9 蛋白質三維結構預測

A: Prediction ofZmCPK9 protein 3D structure; B: Prediction ofAtCPK9 protein 3D structure

圖2 ZmCPK9與AtCPK9蛋白質三維結構比較
Fig.2 Comparison Prediction of ZmCPK9with AtCPK9 protein 3D structure

2.3不同非生物脅迫下ZmCPK9基因表達

用熱酚法提取幼苗總 RNA，經反轉錄后得到4種不同脅迫條件下的 cDNA 模板，進行PCR擴增后，獲得1.5 kb 左右的片段(圖3A)，與cDNA序列長度一致。

利用Real-time PCR方法，分析ZmCPK9基因在在干旱、低溫、NaCl和ABA 4種脅迫條件下的表達模式。研究表明，4種脅迫處理下，在不同處理時間下，ZmCPK9基因表達量均有所上調，但不盡相同。在干旱、低溫、NaCl和ABA處理時，ZmCPK9基因相對表達量上調幅度較大，分別在24、12、12和1 h時其相對表達量達到最大值，分別是對照的2.25(P<0.05)、235.11(P<0.05)、1.22(P<0.05)和3.28(P<0.05)倍，而在高溫42℃處理時相對表達量下調幅度較大，在3 h時其相對表達量達到最小值，分別是對照的0.08倍(P<0.001)。在干旱脅迫條件下，隨著處理時間延長而有所升高，至24 h時表達量達到最大值，為2.24±0.22，是對照的2.24倍(P<0.05)(圖3B)。在250 mmol/L NaCl脅迫條件下，隨著處理時間延長而其相對表達量有所上升，12 h時其相對表達量達最大值，為230.10±23.51，是對照的235倍(P<0.05)，但隨后開始下降(圖3C)。在100 mol/L ABA脅迫條件下，隨著處理時間延長而其相對表達量有所上升，12 h時其相對表達量達到最大值，為1.22±0.12，是對照的1.2倍(P<0.05)，但隨后其相對表達量下調至0.12±0.10，是對照的0.12倍(P<0.05)(圖3D)。在4℃冷激脅迫條件下，隨著處理時間延長而其相對表達量有所上升，在1 h時，其相對表達量達到最大值3.28±0.26，是對照的3.3倍(P<0.05)，隨時間延長后，其相對表達量逐漸下調(圖3E)。ZmCPK9參與了干旱、鹽、ABA和低溫等信號傳導調控，對植物防御非生物脅迫具有一定作用。圖3

3 討 論

3.1 ZmCPK9是玉米CPKs家族中的新成員

ZmCPK9與植物中的CPKs基因具有同源性，同時含有CPKs基因的結構域。功能域分析顯示ZmCPK9含有絲氨酸/蘇氨酸激酶催化域等，CPKs蛋白具有的保守功能域。用Cobalt工具比較不同物種中CPKs蛋白序列，發現ZmCPK9與水稻等中CPKs基因具有同源性，而且有非常保守的序列和結構，與玉米ZmCPK11、水稻OSCPK11、OSCPK9一致性分別為88%、90%和88%，這與玉米與水稻親緣關系相對較近的現象是一致的(玉米和水稻同屬禾本科植物)。系統發育進化樹中ZmCPK9和水稻相應基因聚在一起也驗證了這一結果，玉米和水稻具有較近的親緣關系。另一方面，也暗示在逆境應答或其他信號通路中可能有相似的功能。說明ZmCPK9是植物CPKs家族中的1個新成員。

3.2ZmCPK9與參與了干旱、鹽、ABA和低溫的應答

對ZmCPK9基因的生物信息學特征進行了預測，結果顯示ZmCPK9很多特征和參數與CPKs基因非常類似，這些結論不僅驗證了它們同屬CPKs基因家族，而且預示ZmCPK9可能共同參與或調控某些信號途徑。功能預測結果顯示ZmCPK9基因可能會參與ABA或其他激素介導的生理生化過程，預測的部分功能和已證實的不同物種中CPKs基因功能是一致的，已有研究結果也表明CPK基因在逆境(干旱、鹽、激素和低溫等)應答中起重要作用[22, 3, 23]。因此，分別進行干旱、低溫、NaCl和ABA 4種脅迫處理玉米自交系B73三葉期幼苗，用Real-timePCR分析其在不同脅迫處理下的相對表達量情況。玉米ZmCPK9基因在4種脅迫處理下不同時間點其表達量均有所上調，但具體動態表達模式不盡相同。在玉米ZmCPK11表達量受機械傷害、H2O2和ABA誘導，而ZmCPK5參與了H2O2和ABA應答過程[23, 24]。這些試驗結果與其在擬南芥、水稻和玉米中的同源基因有著相似的結論，這些結論也暗示ZmCPK9與其他物種中的同源基因有相似或部分相似的功能，參與了干旱、鹽、ABA和低溫的應答，但在不同的逆境應答過程中具體參與調控模式有所不同。

Dunnett’s t檢驗，*P<0.05,**P<0.01

Dunnett’s test,*P<0.05,**P< 0.01

圖3 玉米ZmCPK9在不同處理條件下的轉錄水平和全長cDNA擴增
Fig.3 Transcriptional level of ZmCPK9 under different treated conditions and its amplification of the full length cDNA

4 結 論

該文報道的ZmCPK9是ZmCPKs基因家族中新的一員，對干旱、低溫、鹽和ABA等非生物脅迫具有應答反應，推測該基因可能對植物防御非生物脅迫具有一定作用。

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Abstract：【Objective】 Calcium dependent proteinkinases (CPKs), a kind of serine/threonine protein kinases, are only found in plants and lower animals. Ca2+, as a second messenger, plays important roles in various aspects of plant physiology and is involved in many cellular processes. The purpose of this paper is to study the dynamic expression ofZmCPK9 gene in seedling stage under different stress conditions and to lay the foundation for further analysis of the function and mechanism of this gene in maize adverse stress response.【Method】ZmCPK9 gene sequence features were analyzed by using bioinformatics methods, and the expression characteristics ofZmCPK9 under drought, low temperature, salt and ABA stress were analyzed by real-time PCR technique. 【Result】The sequence analysis showed thatZmCPK9 had a length of 1,548 bp in the genome, encoding 515 aminoacids residues. Bioinformatics analysis revealed that the protein sequence and structure of theZmCPK9 gene were as conservative as those of other species, theCPKgene. Real-time PCR analysis discovered that the expression ofZmCPK9 was up-regulated by ABA, cold, drought and salt stress, respectively. 【Conclusion】ZmCPK9 is a new member in cornCPKsgene family in maize. The gene is involved in signal transduction regulation under the condition of drought, low temperature, salt, and ABA stress. We speculateZmCPK9 has a certain role in plant defense under abiotic stress.

Keywords: maize; calcium-dependent protein kinase 9; abiotic stress

ExpressionAnalysisofZmCDPK9GeneinMaizeunderAbioticStress

Zumuremu Turxun，CHENG Xun-ji, CHEN Guo, LI Jian-ping, HAO Xiao-yan, HUANG Quan-sheng

(ResearchInstituteofNuclearandBiotechnologies，XinjiangAcademyofAgriculturalSciences，Urumqi830091，China)

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.09.005

S513；S188

A

1001-4330(2017)09-1606-07

2017-06-19

國家自然科學基金項目(31260331)；新疆農業科學院優秀青年科技人才基金項目(2014026)

足木熱木·吐爾遜 (1981-)，女，新疆人 ，助理研究員，研究方向為玉米分子生物學，(E-mail) azze128@163.com

黃全生(1964-)，男，新疆烏魯木齊人，研究員，博士，研究方向為作物耐逆基因資源及分子生物學，(E-mail) hquansheng@126.com

Supported by: National Natural Science Foundation of China (31260331) and Outstanding Young Scientific Talent Foundation of Xinjaing Academy of Agricultural Sciences.(2014026)

Corresponding author：HUANG Quan-sheng(1964-)，male, Urumqi, Xinjiang, Professor, supervisor, the main research directions for crop adversity molecular biology，(E-mail) hquansheng@126.com