MALDI SepsityperTMKit 和血清分離膠促凝管法兩種前處理方法在基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術直接鑒定陽性血培養病原菌的應用評估

秦娟秀， 黃 芊， 高倩倩， 謝乙慧， 李 敏， 張灝旻

MALDI SepsityperTMKit 和血清分離膠促凝管法兩種前處理方法在基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術直接鑒定陽性血培養病原菌的應用評估

秦娟秀， 黃 芊， 高倩倩， 謝乙慧， 李 敏， 張灝旻

目的比較MALDI SepsityperTMKit 和血清分離膠促凝管法兩種前處理方法在基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix- assisted laser desorption ionization- time of fl ight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技術直接鑒定血培養陽性病原菌的有效性。方法收集上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院2016年4－6月血培養儀報警的非重復血培養瓶138個，以傳統培養鑒定的方法為金標準，同時采用以上兩種前處理方法處理陽性標本，再進行MALDI-TOF MS鑒定。結果本次共收集非重復的血培養陽性標本138份，排除6個假陽性血瓶，鑒定出的病原菌包括革蘭陰性菌70株（53.03%）、革蘭陽性菌57株（43.18%）、真菌3株和2例復數菌。MALDI SepsityperTMKit 和血清分離膠促凝管法兩種前處理方法的血培養快速鑒定病原菌準確率分別為91.67%和84.09%，種鑒定準確率分別為83.33%和61.36%。兩種前處理方法處理后，革蘭陰性菌的準確率分別為98.57%和 95.71%，革蘭陽性菌的準確率分別為87.72%和78.59%，兩者鑒定所需時間為40 min/樣本和25 min/樣本。結論雖然MALDI SepsityperTMKit 比血清分離膠促凝管法鑒定準確率稍高但兩者差異無統計學意義（91.67%對84.09%，P＞0.05），與MALDI SepsityperTMKit相比，血清分離膠促凝管法是一種快速、易獲得、低廉的MALDI-TOF MS直接鑒定血培養病原菌的前處理方法。

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜； MALDI SepsityperTMKit； 血清分離膠促凝管法； 血培養； 病原菌

Abstract: ObjectiveThe aim of this study was to evaluate the commercial Sepsityper? kit and serum separator tube coupled with matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry for direct identification of microorganisms in a blood culture system.MethodsA total of 138 clinical blood samples from clinical laboratory in Renji hospital were tested with two methods respectively from April to June of 2016. Performance of the assays were compared against that of conventional bacterial culture as a reference.ResultsA total of 138 nonduplicate positive blood culture samples were collected,including 70 (53.03%) gram negative samples, 57 (43.18%) gram positive samples, 3 fungus samples, 2 mixed samples, and 6 false positive samples which were excluded from further analysis. The accuracy rate of Sepsityper? kit and serum separator tube was 91.67% and 84.09% in rapid identification of pathogen from blood samples, 83.33% and 61.36% in correct identification to species level. The accuracy rate of Sepsityper? kit and serum separator tube was 98.57% and 95.71% in identifying gram-negative bacteria, 87.72% and 78.59% in identifying gram-positive bacteria, respectively. The turnaroundtime for identification of each sample was 40 min by the commercial Sepsityper? kit and 25 min by serum separator tube.ConclusionsMALDI SepsityperTMkit has shown slightly higher accuracy rate in identi fi cation of pathogen from blood sample than serum separator tube, but the difference is not signi fi cant (91.67% vs. 84.09%,P＞0.05). Compared with MALDI SepsityperTMkit,serum separator tube is a rapid, easy, and cost-effective pretreatment method for direct identi fi cation of microorganisms from blood cultures using MALDI-TOF mass spectrometry.

Key words:matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry; MALDI Sepsityper? Kit; serum separator tube as pretreatment methods; blood culture; pathogen

血流感染是臨床非常危重的感染類型，有較高的發病率和致死率。據估計，全球范圍內每年約1 900萬人發生膿毒血癥[1]。依據CHINET細菌耐藥性監測網數據，2012年我國血流感染分離菌株數較2011年增加了21.4%[2]。傳統的微生物鑒定方法主要是基于表型的檢測，包括革蘭染色，微生物培養和生化試驗等，往往耗時較長，需要至少72 h才能將結果反饋臨床。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix- assisted laser desorption ionization- time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是近年發展起來的一種新型的細菌鑒定技術，不僅可以快速準確鑒定細菌，還可用于一些無菌樣本如血液和尿液的直接鑒定，極大地縮短了檢測時間[3-5]。而MALDI-TOF MS直接鑒定血液和無菌體液是否準確取決于樣品的前處理。MALDI SepsityperTMKit是德國布魯克公司推出專門用于血培養直接鑒定的前處理試劑盒，同時與本實驗室采用的血清分離膠促凝管法進行比較，并以傳統的培養方法作為參考方法，來評估兩種方法快速鑒定血培養陽性的有效性，從而找出適合不同實驗室的前處理方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株來源 收集2016年4－6月上海仁濟醫院第1次培養陽性的血培養瓶進行研究。

1.1.2儀器與試劑 MALDI-TOF MS、MALDI SepsityperTMKit和α-氰基-4-羥基肉桂酸基質（HCCA）購自德國Bruker Daltonik公司；BACTECTM FX 血培養系統、 血清分離膠促凝管、需氧和厭氧血培養瓶購自美國BD公司；甲酸、無水乙醇和乙腈購自美國Sigma-Aldrich公司；VITEK 2-Compact 全自動微生物分析系統和鑒定板條購自法國生物梅里埃公司；需氧血平皿、厭氧血平皿、麥康凱平皿和巧克力平皿購自英國OXIOD公司。

1.2 方法

1.2.1血培養陽性 直接革蘭染色涂片鏡檢培養陽性，取出陽性瓶，記錄陽性時間，并將陽性瓶中抽取部分液體涂片后進行革蘭染色，記錄血培養瓶中待測菌的種類及革蘭染色分類。

1.2.2傳統血培養鑒定法 根據涂片結果，將陽性標本轉種相應培養基，并-80 ℃保存。試驗菌株從冰箱取出劃線接種于哥倫比亞羊血瓊脂平皿上， 37°C 培養 18～24 h， 生長成單個菌落用無菌槍頭挑取單個菌落均勻涂抹在靶板上，每孔加70%甲酸1 μL，待晾干后每孔加基質液1 μL，采用MALDI-TOF MS進行鑒定。

1.2.3MALDI SepsityperTMKit方法 參考該試劑盒說明書進行操作，蛋白提取后，輸入菌株信息，采集菌株質譜數據，利用軟件Biotyper 3.0將人工采集到的圖譜與數據庫中的圖譜進行比對和結果分析，鑒定菌種，記錄質譜評分前2種非重復菌種的鑒定結果。

1.2.4血清分離膠促凝管法 直接鑒定方法將500 μL無菌水加入到1.5 mL的離心管中備用；消毒陽性瓶口，抽取混勻的5 mL血培養瓶內容物至BD分離膠促凝管，3 000 r/min離心10 min。用1 μL一次性接種環挑取上述步驟得到的灰白色菌體富集物加入到無菌水500 μL中，13 000 r/min，離心2 min；用無菌吸管吸取上清液棄去，加入無菌水500 μL懸浮并充分振蕩混勻，13 000 r/min，離心2 min；重復上一步驟；棄去上清液，加入無水乙醇700 μL懸浮并震蕩混勻，13 000 r/min，離心2 min；用移液槍將上清液（乙醇）吸取并棄去，13 000 r/min，離心2 min；室溫開蓋放置數分鐘晾干去除乙醇（殘留的乙醇會影響質譜峰，故盡量完全干燥）；向晾干的離心管中加入70%甲酸30 μL震蕩混勻，再加入乙腈30 μL，13 000 r/ min，離心2 min；取離心后的上清液1 μL點樣至金屬靶板并室溫晾干。待干燥后加入基質液1 μL，輸入菌株信息，采集菌株質譜數據，利用軟件Biotyper3.0將人工采集到的圖譜與數據庫中的圖譜進行比對和結果分析，鑒定菌種，記錄質譜評分前 2 種非重復菌種的鑒定結果。

1.2.5基因測序法 對于兩種前處理方法導致的質譜鑒定結果與純菌落質譜結果不相符的菌株采用16S rRNA測序法進行最終確認。采用天根生化試劑盒提取細菌DNA，提取的DNA作為模板待用。細菌鑒定采用16 S rRNA 序列測定法進行分子鑒定（引物：F， 5'-AGAGTTTGATGATGGCTCAG-3'；R， 5'-ACCGCAACTGCTGGCAC-3'）真菌采用 18 S rRNA序列測定法進行分子鑒定（引物：F， 5'-GATACCGTCGTAGTCTTA-3'；R， 5'-ATTCCTCGTT GAAGAGC-3'），PCR 擴增條件為 ：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32 個循環 ；72 ℃延伸 10 min。產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果。將PCR產物送鉑尚生物技術（上海）有限公司測序，所得序列在NCBI進行比對。

1.2.6統計學分析 根據MALDI-TOF MS鑒定軟件設置的鑒定Cutoff值標準，對于純分單個菌落，得分在2.0以上完全可以鑒定到種的水平；得分在1.7～2.0，可能鑒定到屬水平；得分1.7以下，鑒定不準確。根據相關文獻[6-8]，我們選取了修正Cutoff值來評估兩種方法的有效性，修正Cutoff-2值標準為≥1.8鑒定到“種”水平，介于1.8～1.6鑒定到“屬”水平，得分1.6以下結果不可信。同時參考本次實驗結果提出修正Cutoff-3值標準：≥1.8鑒定到“種”水平，介于1.8～1.6鑒定到“屬”水平，如果得分≤1.6，但鑒定結果前3位均屬于同一種菌也認為鑒定正確，否則鑒定不可靠。兩種方法鑒定正確率的比較采用卡方檢驗。

2 結果

2.1 兩種前處理方法總準確率比較

本次共收集非重復的血培養陽性標本138份，排除6個假陽性血瓶，鑒定出的病原菌包括革蘭陰性菌 70株（53.03%）、革蘭陽性菌 57 株（43.18%） 、真菌3株和2例復數菌。按照經典Cutoff值 即Cutoff-1標 準：MALDI SepsityperTMKit 和分離膠促凝管兩種前處理方法對血培養快速鑒定病原菌準確率分別為87.88%和71.97%，種鑒定準確率分別為68.18%和43.18%；屬鑒定的準確率（排除種鑒定準確的標本，以下均按該方法計算）為19.70%和28.79%；未鑒定率分別為12.12%和28.03%。MALDI SepsityperTMKit鑒 定的準確率略高于血清分離膠促凝管法，差異無統計學意義（87.88% 對71.97%，P＞0.05）。按照修正的Cutoff-2標準，MALDI SepsityperTMKit 和血清分離膠促凝管法對血培養快速鑒定病原菌準確率分別為90.15%和76.52%；種鑒定準確率分別為83.33%和61.36%；屬鑒定的準確率為6.82%和15.15%；未鑒定率分別為9.85%和23.48%。在該水平上，MALDI SepsityperTMKit 與血清分離膠促凝管法相比有較高的準確率，差異同樣無統計學意義（95.45%對76.52%，P＞0.05）。按照修正的Cutoff-3標準MALDI SepsityperTMKit 和血清分離膠促凝管法對血培養快速鑒定病原菌準確率分別為91.67%和84.09%；種鑒定準確率分別為83.33%和61.36%，與Cutoff-2標準相同，但是屬鑒定準確率提高為8.33%和22.73%，未鑒定率降低到8.33%和15.91%，兩種方法在該水平上同樣差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見圖1。3種判斷水平上，兩種前處理方法準確率在統計學無明顯差異， SepsityperTMKit鑒定的準確率均略高于血清分離膠促凝管法。在Cutoff-3判斷標準下，兩種方法均有較高的準確率，因此我們將Cutoff-3作為本次實驗的判斷標準。

2.2 兩種前處理方法鑒定不同革蘭陰性菌的比較

本次收集革蘭陰性菌70株，不同細菌的鑒定結果見表1。 MALDI SepsityperTMKit 和分離膠促凝管法對血培養快速鑒定革蘭陰性菌準確率分別為98.57%和 95.71%，前者鑒定率稍高，但差異無統計學意義（P＞0.05）。兩種前處理方法對臨床感染常見的革蘭陰性病原菌如大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌均有很高的鑒定準確率。

2.3 兩種前處理方法鑒定不同革蘭陽性菌的比較

本次收集革蘭陽性菌57株，不同細菌鑒定結果見表2。 MALDI SepsityperTMKit 和分離膠促凝管法對血培養快速鑒定革蘭陽性菌準確率分別為87.72%和78.59%，前者正確率稍高，但兩者差異無統計學意義（P＞0.05）。兩種前處理方法鑒定臨床上常見的革蘭陽性病原菌如金黃色葡萄球菌、腸球菌屬均有較高的正確率，而對感染較為少見的棒狀桿菌屬的鑒定準確率較低。

無論選擇MALDI SepsityperTMKit 或血清分離膠促凝管法進行前處理，MALDI-TOF MS直接鑒定血培養陽性革蘭陰性菌的鑒定準確率均高于革蘭陽性菌，分別為98.57%對87.72%， 95.71%對78.59%。

圖1 MALDI SepsityperTMKit 和血清分離膠促凝管法兩種前處理方法對陽性血培養快速鑒定微生物的比較Figure 1 MALDI-TOF MS rapid identi fi cation of microorganisms in a blood culture system using two pretreatment methods（Sepsityper? kit and serum separator tube）

表1 MALDI SepsityperTMKit 和血清分離膠促凝管法對血培養陽性MALDI-TOF MS鑒定革蘭陰性菌的比較Table 1 MALDI-TOF MS identi fi cation of gram-negative bacteria following pretreatment with SepsityperTMkit and serum separator tube[n（%）]

2.4 真菌和復數菌

本次研究中，只有3株真菌，MALDI SepsityperTMKit鑒定正確2株，血清分離膠促凝管法均未鑒定出。2例復數菌感染，1例為大腸埃希菌和腸球菌混合感染，兩種方法均鑒定正確，另1例為熱帶念珠菌和屎腸球菌感染，兩種方法均未鑒定出。

3 討論

血流感染是一種非常嚴重的全身感染性疾病，有研究顯示，每推遲1 h使用抗生素進行合理治療，患者的存活率下降7.6%[9]。MALDI-TOF MS是近年來新興的細菌鑒定技術，其鑒定快速，因此有研究人員將其應用到血培養陽性的鑒定中，極大地縮短了鑒定時間。血培養陽性標本的前處理對鑒定起到了至關重要的作用。Kok等[10]發現，MALDI SepsityperTMKit聯合MALDI-TOF MS，可將血培養陽性標本鑒定時間縮短至1 h，而本實驗室也在前期實驗中探索出一種血清分離膠促凝管法的前處理方法。我們以傳統培養出純菌落再進行質譜鑒定的方法作為金標準，以評估兩種前處理方法的效果。

表2 MALDI SepsityperTMKit 和血清分離膠促凝管法對血培養陽性MALDI-TOF MS鑒定革蘭陽性菌的比較Table 2 MALDI-TOF MS identi fi cation of gram-positive bacteria following pretreatment with SepsityperTMkit and serum separator tube[n（%）]

血培養瓶中存在紅細胞、白細胞等物質，可能會干擾微生物的質譜峰，因此采用質譜儀直接鑒定血培養陽性的微生物需調整質譜評分標準[11]。多宗文獻表明[12-14]，根據血培養中微生物的提取方法與實驗室環境的不同，其Cutoff值可降低至1.50～1.70。因此我們采取了兩種修訂的Cutoff值。通過比較發現，依據Cutoff-3值標準（≥1.8鑒定到“種”水平，介于1.8～1.6鑒定到“屬”水平，如果得分≤1.6，但鑒定結果前3位均屬于同一種菌也認為鑒定正確，否則鑒定不可靠），MALDI SepsityperTMKit和血清分離膠促凝管法均有很高的鑒定準確率，因此我們選擇Cutoff-3值作為本實驗室的質譜評分標準。國內也有實驗室根據自身特點制定了適合自己的實驗室評分標準，如李媛睿等[15]將病原菌種屬質譜評分標準定為1.50和1.45。

與傳統培養方法相比，兩種前處理方法聯合MALDI-TOF MS有共同的優點：操作簡單，直接提取，將鑒定結果的反饋時間縮短了至少2 d。但這兩種前處理方法又有各自的優缺點。國外實驗室多采用廠商推薦的科研用Sepsityper配套試劑盒，但成本過高，處理時間平均40 min/樣本[16]； 血清分離膠促凝管法整個過程僅需約25 min/樣本的處理時間，且分離膠促凝管作為耗材在各醫療機構使用廣泛，成本低廉、實用性強。SepsityperTMKit鑒定的準確率略高于血清分離膠促凝管法（91.67%對84.09%），但無明顯的統計學差異。在真菌鑒定方面，由于本次納入菌數少，很難推斷兩種方法的準確性，而且不同真菌的血流感染治療選擇的藥物不同[17]，真菌引起的血流感染更為嚴重[18-19]，如何提高MALDI-TOF MS直接鑒定血培養陽性標本中真菌準確率，也是亟需解決的一個問題，這也為我們以后的研究提供了方向。

MALDI SepsityperTMKit和血清分離膠促凝管法兩種前處理方法均可以用于MALDI-TOF MS直接鑒定血培養陽性標本，與前者相比，后者是一種快速、易獲得、低廉的MALDI-TOF MS直接鑒定血培養病原菌的前處理方法。實驗室也可以依據自身特點和數據建立自己的質譜評分標準，選擇合適的前處理方法，從而快速準確地將結果反饋臨床，指導臨床抗生素的合理使用。

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Performance assessment of MALDI Sepsityper? kit and serum separator tube as pretreatment methods for direct identi fication of microorganisms from blood cultures using MALDI-TOF mass spectrometry

QIN Juanxiu, HUANG Qian, GAO Qianqian, XIE Yihui, LI Min, ZHANG Haomin. （Department of Laboratory Medicine, Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200127, China）

R378

A

1009-7708 ( 2017 ) 05-0546-06

10.16718/j.1009-7708.2017.05.012

2017-01-17

2017-04-17

上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院檢驗科，上海 200127。

秦娟秀（1989—）﹐女﹐碩士研究生﹐初級檢驗師﹐主要從事病原微生物的致病機制研究。

張灝旻﹐E-mail：zhanghaomin1976@163.com。