兒童患者下呼吸道標本苛養菌陽性分離率的影響因素分析

潘 芬， 趙婉彤， 張天棟， 石迎迎， 蔣 婕， 張 泓

兒童患者下呼吸道標本苛養菌陽性分離率的影響因素分析

潘 芬， 趙婉彤， 張天棟， 石迎迎， 蔣 婕， 張 泓

目的分析兒童患者下呼吸道標本苛養菌（肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌）陽性分離率的影響因素。方法選取210份下呼吸道標本，分別在采集后0.5 h、2 h、6 h、12 h、24 h接種于血平皿和巧克力平皿，研究運送時間、運送培養基和不同接種培養基對苛養菌陽性分離率的影響。結果200份合格下呼吸道標本研究結果顯示：隨著標本放置時間的增加，肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌陽性分離率呈現下降趨勢，除0.5 h、2 h時間段外結果差異具有統計學意義（P＜0.05），但0.5 h、2 h 2個時間段樣本陽性率無差異；含半固體培養基的陽性分離率在不同時間段均高于其他2種運送培養基，但差異并無統計學意義（P＞0.05）；肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌在兩種商品化平皿中陽性分離率、生長情況差別不大（P＞0.05）。結論選擇合適的運送時間、運送培養基和接種培養基對于提高苛養菌陽性分離率具有一定的意義。

下呼吸道； 苛養菌； 陽性分離率

Abstract: ObjectiveTo investigate the factors affecting the isolation of fastidious bacteria such asStreptococcus pneumoniaeandHaemophilus in fl uenzaefrom lower respiratory tract specimens in children.MethodsA total of 210 lower respiratory tract specimens from children were collected and inoculated on both blood agar plate and chocolate agar plate 0.5 h, 2 h, 6 h, 12 h,and 24 h after collection. The effect of specimen turnaround time, transport medium, and inoculation medium on the isolation of fastidious bacteria was studied.ResultsThe results of 200 quali fi ed specimens showed that the isolation ofS. pneumoniaeandH. in fl uenzaesigni fi cantly decreased with the increasing of specimen turnaround time (P＜0.05), but no signi fi cant difference was observed between 0.5 h and 2 h timepoints. The isolation of fastidious bacteria in semi-solid medium was non-signi fi cantly higher than the other two transport medium (P＞0.05). No signi fi cant difference was found in the isolation and growth ofS. pneumoniaeandH. in fl uenzaeon different inoculation media (P＞0.05).ConclusionsThe appropriate specimen turnaround time, transport medium,and inoculation medium are important for improving the isolation of fastidious bacteria from lower respiratory tract in children.

Key words:lower respiratory tract; fastidious bacterium; isolation

肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌是引起下呼吸道感染（low respiratory tract infections， LRTI）的常見苛養菌，陽性分離率為20%～60%[1-3]。下呼吸道標本病原菌的分離和鑒定是診斷下呼吸道感染的金標準[4]。及時快速有效分離苛養菌是治療LRTI的主要措施之一。

由于各實驗室的人員和技術的差異，引起不同醫院之間報道的LRTI苛氧菌陽性分離率高低不同[5-6]，從而影響了肺部感染病原菌的診斷，造成抗菌藥物的不合理使用，延遲了臨床上患兒的治療時機。基于本實驗室較高的苛養菌陽性分離率，本研究將對下呼吸道標本流程所涉及的技術要素進行評估，分別從標本分析前、分析中進行逐步規范化分析，建立并評估下呼吸道苛養菌分離的規范流程，以期提高下呼吸道標本的采集合格率、及時送檢率及苛養菌準確分離率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1研究對象 收集我院2016年10－12月210例疑似下呼吸道感染患兒的下呼吸道標本210份。

1.1.2試劑與儀器 無菌棉拭子、常規三通管、含半固體培養基運送培養基、血平皿（上海伊華生物有限公司、Thermo生物有限公司）、含萬古霉素的巧克力平皿（上海伊華生物有限公司、Thermo生物有限公司）、肺炎鏈球菌臨床菌株、流感嗜血桿菌臨床菌株、質控菌株（肺炎鏈球菌ATCC49619和流感嗜血桿菌ATCC49766）、一次性100 μL定量接種環（上海遠慕生物有限公司）、VITEK 2-Compact自動鑒定儀（法國梅里埃生物有限公司）。

1.2 方法

1.2.1下呼吸道標本采集 臨床微生物操作人員采用氣管插管結合負壓吸引方法[7]對210例患兒進行痰液標本采集，采集過程均嚴格按照無菌操作進行，每份標本均置于無菌棉拭子、常規三通管、含半固體培養基運送培養基。

1.2.2分析前評估（評估下呼吸道標本數210份）

1.2.2.1標本質量判斷[8]① 肉眼觀察下呼吸道標本，標本形態：“水狀”、“黏液狀”、“膿性”、“含血絲”、“全為血狀”，記錄標本性狀；② 涂片鏡檢：低倍顯微鏡下，痰液涂片白細胞＞25個，上皮細胞＜10個，為合格標本；③ 計算送檢下呼吸道標本的合格率：合格率=合格標本數/送檢標本總數；

1.2.2.2評估標本運送時間、運送培養基對苛養菌陽性分離率的影響 ① 將無菌棉拭子、常規三通管、含半固體培養基運送培養基的每份痰液標本，分別于采集后0.5、2、6、12和24 h接種于不同血平皿和巧克力培養基中；②將接種的平皿置于37 ℃，5% CO2條件下，孵育18～24 h，觀察菌落形態，對疑似為苛養菌菌落（肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌）進行純分，純分后的菌落經VITEK 2-Compact自動鑒定儀鑒定，確定菌種；③ 最后計算下呼吸道標本苛養菌陽性檢出率：苛養菌檢出率=標本苛養菌陽性數/合格標本數，評價標本運送時間、運送培養基對苛養菌陽性分離率的影響。

1.2.3分析中評估（評估上述肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌在不同商品化培養基的生長狀況）① 分別選擇2種商品化培養基（肺炎鏈球菌用血平皿、流感嗜血桿菌用巧克力平皿）；② 將下呼吸道標本分離陽性菌株配置成0.5麥氏單位菌懸液（相當于1.5×108cfu/mL），在0、24、48 h 3個時間段分別準備1支含半固體培養基塑料管，用微量加樣槍吸取10 μL菌懸液加入各拭子中。將24、48 h的拭子插入配備的含有半固體培養基的塑料管中，使拭子完全包含在半固體培養基的內部，置于室溫；③將0 h的各拭子立即放入裝有1 mL無菌0.9%NaCl溶液的試管中，漩渦振蕩30 s，在管壁上盡量擠干拭子，丟棄拭子。吸取100 μL洗脫液加入裝有0.9% NaCl溶液0.9 mL的試管中，做5個10倍濃度稀釋；④每個稀釋度取100 μL液體加入相應的培養皿表面，均勻涂抹，置于37 ℃，5% CO2條件下，培養24～48 h；⑤ 取菌落數在30～300個的培養皿作菌落計數，算出每個稀釋度的平均菌落數，從而計算出0、24、48 h 3個時間段各細菌的平均菌落數，以0 h的平均菌落數為100%帶菌量，算出24、48 h各菌種的存活百分率；⑥ 在選中的培養皿中分別選出最大的5個單個菌落，用游標卡尺進行測量最大菌落的直徑，并統計平均菌落的直徑；⑦ 對2種商品化血平皿中肺炎鏈球菌α 溶血的情況進行評價；⑧質控：測定過程中所有操作均嚴格按照實驗室室內質量控制文件進行。試驗開始前，按照說明書選擇相應標準質控菌株。對2種商品化血平皿進行質量控制，質量可控才可將測定數據納入研究。

1.2.4統計學分析 采用SPPSS 19.0軟件進行統計學分析，計數資料采用行×列卡方檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 分析前評估實驗結果

2.1.1標本合格情況 本實驗共采集了210份痰液標本，根據標本性狀，可分為“水狀”10份、“黏液狀”112份、“膿性”70份、“含血絲”18份；顯微鏡鏡檢合格標本有200份，標本合格率達95.2%。200份合格痰液標本中，共檢測到肺炎鏈球菌78株，流感嗜血桿菌30株，其中5份標本同時檢測出肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌。

2.1.2運送時間對苛養菌陽性檢出率的影響 200份合格痰液標本在0.5 h、2 h、6 h、12 h和24 h 5個時間段的肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌陽性分離率見表1、表2，結果表明隨著標本放置時間的不斷延長，肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌菌落數量不斷減少（4+→1+/-），陽性分離率呈現下降趨勢，結果差異有統計學意義（P＜0.05），但0.5 h、2 h兩個時間段標本陽性率并無差異。

2.1.3運送培養基對苛養菌陽性分離率的影響 200份合格痰液標本在3種運送培養基（無菌棉拭子、常規三通管和含半固體運送培養基）的肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌陽性分離率見表1、表2，結果發現含半固體培養基的陽性分離率在不同時間段均高于其他2種運送培養基，然結果差異并無統計學意義（P＞0.05）。但是，為保證2種苛養菌的陽性分離率，建議可常規采用含半固體運送培養基，尤其在標本未能及時接種的情況下。

表1 標本運送時間和運送培養基對肺炎鏈球菌陽性分離率的影響Table 1 The effect of specimen turnaround time and transport medium on isolation ofStreptococcus pneumoniaefrom lower respiratory tract

表2 標本運送時間和運送培養基對流感嗜血桿菌陽性分離率的影響Table 2 The effect of specimen turnaround time and transport medium on isolation ofHaemophilus in fl uenzaefrom lower respiratory tract

2.2 分析中評估實驗結果

2.2.1不同培養基對苛養菌檢出率的影響 在不同時間段，肺炎鏈球菌在2種商品化血平皿中陽性分離率差別不大（P＞0.05），同時流感嗜血桿菌在不同商品化巧克力平皿上檢出率也并無明顯差異（P＞0.05），提示肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌在不同廠家的血平皿、巧克力平皿陽性分離率均較為相似，不同廠家血平皿和巧克力平皿對2種苛養

菌的陽性分離率影響較小。見表1、表2。

2.2.2不同培養基對苛養菌生長情況的影響 肺炎鏈球菌在不同培養基的菌落大小存在一定差異；在菌落數量、細菌存活率和溶血性能方面差異不大；而流感嗜血桿菌不同培養基的菌落數量、大小、細菌存活率方面并無明顯差異（P＞0.05），見表3。

表3 不同培養基對肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌生長情況的影響Table 3 Effect of different inoculation media on the growth ofStreptococcus pneumoniaeandHaemophilus in fl uenzae

3 討論

合格的下呼吸道標本是診斷下呼吸道感染的重要前提之一，臨床常規采用的取材方法有咯痰法、負壓吸痰法、支氣管肺泡灌洗液取材等方法[7，9]，由于兒童人群無法自主咯痰，且經口咯痰易被口腔定植菌污染，其可靠性及敏感性均不如其他方法；支氣管鏡肺泡灌洗液有一定的指征，雖能提高病原菌的檢出率，但操作較負壓吸痰法為煩瑣，因此臨床一般建議采用負壓吸痰法以獲得下呼吸道標本。

影響LRTI細菌檢出率的主要因素包括實驗人員的技術操作、標本運送時間、運送培養基、培養平皿的選擇等。本研究針對分析前影響因素進行分析：①實驗技術人員操作。本研究均采用統一化培訓方式，遵循實驗室操作規程，并由同一名微生物檢驗人員操作，減少人員之間的差異性，以確保下呼吸道標本的合格率，保證苛養菌的分離。②標本運送時間。上述結果發現隨著運送時間的增加，苛養菌（肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌）檢出率逐漸減低，這提示下呼吸道標本需在標本采集后2 h內送至實驗室并完成接種；若2 h內無法完成接種，建議冰箱保存6 h，否則會影響苛養菌的檢出率。③標本運送培養基。根據實驗采用的3種運送培養基進行分析，發現含半固體培養基的運送系統檢出率明顯高于其他運送管，有研究數據表明含半固體培養基的運送系統由1支無菌纖維拭子和含有能維持細菌生物活性的半固體培養基的塑料管組成，培養基能為插入其中的標本提供氧分和水分，防止標本干燥，保證標本中的細菌存活[10]。對于營養要求不高的細菌，還起到增殖作用，使標本能夠較長時間保存。

此外，除了分析前的幾個因素外，分析中的因素對于苛養菌的分離培養也起到一定的作用。分析中影響因素包括：①培養平皿的選擇。肺炎鏈球菌一般采用哥倫比亞血瓊脂平皿分離。由于流感嗜血桿菌營養條件要求較高，一般采用巧克力平皿進行分離。②苛養菌的典型形態。不同來源的同一瓊脂平皿，由于其營養成分含量不同，使得細菌形態存在一定的差異。典型肺炎鏈球菌菌落形態呈現小、濕潤、隆起、灰白色、草綠色溶血，注意與鏈球菌屬其他細菌進行區分，以免遺漏，影響細菌陽性分離率。典型流感嗜血桿菌菌落形態呈無色透明、不溶血、呈露滴狀小菌落，注意與奈瑟菌鑒別。③實驗室檢測人員的檢測能力。實驗室操作人員均具有微生物多年檢測經驗，能確保上述苛養菌的準確分離及鑒定。本研究結果顯示2種商品化培養基的苛養菌陽性分離率差別不大（P＞0.05），但是由于培養基含水量的不同，使得菌落大小存在一定的差異，這就需要考驗實驗室檢測人員的經驗水平。在苛養菌菌株分離過程中，需結合其他生化試驗輔助鑒定該菌株，以防漏檢。

因此，在下呼吸道標本采集、分離培養及鑒定的過程中，做好分析前、分析中兩大方面的規范操作，確保標本準備采集、及時接種和準確鑒定，對于提高苛養菌的檢出率具有一定的意義，為臨床上有效治療兒童下呼吸道苛養菌感染提供有力支持，進而降低兒童下呼吸道苛養菌的感染率。

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Factors affecting the isolation of fastidious bacteria from lower respiratory tract specimens in children

PAN Fen, ZHAO Wantong, ZHANG Tiandong, SHI Yingying, JIANG Jie, ZHANG Hong. （Department of Laboratory Medicine, Shanghai Children's Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200040, China）

R378

A

1009-7708 ( 2017 ) 05-0541-05

10.16718/j.1009-7708.2017.05.011

2017-03-03

2017-03-30

上海申康醫院發展中心市級醫院臨床輔助科室能力建設項目（SHDC22014012）；上海市衛計委重要薄弱學科建設（2015ZB0203）。

上海市兒童醫院，上海交通大學附屬兒童醫院檢驗科，上海 200040。

潘芬（1988—），女，碩士，檢驗技師，主要從事細菌耐藥機制及傳播機制研究。

張泓，E-mail：zhanghong3010@126.com。