4種提取工藝制備潰結康栓對潰瘍性結腸炎大鼠的治療作用

李麗霞，何 毅，馬東明，馬曉偉，裴 帥，夏鴻東，張懂懂，鄭雪瑩，黃芝娟*，肖學鳳*

（1 .天津中醫藥大學中藥學院，天津 300193；

2 .天士力制藥集團股份有限公司創新中藥關鍵技術國家重點實驗室，天津 300410）

4種提取工藝制備潰結康栓對潰瘍性結腸炎大鼠的治療作用

李麗霞1，何 毅2，馬東明1，馬曉偉1，裴 帥1，夏鴻東1，張懂懂1，鄭雪瑩1，黃芝娟2*，肖學鳳1*

（1 .天津中醫藥大學中藥學院，天津 300193；

2 .天士力制藥集團股份有限公司創新中藥關鍵技術國家重點實驗室，天津 300410）

目的 研究4種提取工藝制備的潰結康栓對2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）誘導潰瘍性結腸炎（UC）大鼠的治療作用。方法 SD雄性大鼠隨機分為正常對照組、模型組、美沙拉秦栓組和4種提取工藝制備的潰結康栓組共7組，每組10只，用TNBS法復制UC大鼠模型，各給藥組給予相應栓劑治療，連續14 d。以各組實驗大鼠疾病活動指數（DAI）、結腸黏膜損傷度、組織病理學改變、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-4（IL-4）等為指標，對其治療療效進行評價。結果 模型組大鼠DAI評分、結腸黏膜損傷評分，血清中TNF-α、IL-1β及IL-4水平與正常對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01），美沙拉秦栓組、各工藝潰結康栓組DAI評分、結腸黏膜損傷評分顯著降低，TNF-α、IL-1β 及IL-4水平與模型組比較有統計學意義（P＜0.05）；美沙拉秦栓組與工藝Ⅰ潰結康栓組、工藝Ⅳ潰結康栓組DAI評分，TNF-α、IL-1β及IL-4水平比較無統計學意義。結論 4種提取工藝制備的潰結康栓均對TNBS誘導的UC模型大鼠有治療作用，其中以提取工藝Ⅳ制備的潰結康栓療效尤為顯著，可為潰結康栓制劑研究提供工藝基礎。

潰結康栓；提供工藝；潰瘍性結腸炎

Abstract:?Objective To study effects of Kuijiekang suppository with four different processes on rats with ulcerative colitis induced by TNBS.Methods SD male rats were randomly divided into control group, model group,positive control group and four groups of Kuijiekang suppository with four different processes,10 rats per group.Rats model of ulcerative colitis set up by rectally administration of TNBS, except control group、model group, were given the appropriate medication to treat for 14 days.Take disease activity index, colon tissue injuries of scores, pathology,TNF-α, IL-1β, IL-4 as the detection indicator and evaluate the treatment.Results Compared with the control group,the model rats showed DAI significantly increased, the levels of TNF-α, IL-1βincreased (P＜0.01), and IL-4 decreased(P＜0.01).Compared with the model group, different processes and positive control group showed DAI significantly decreased (P＜0.05), the levels of TNF-α, IL-1βdecreased (P＜0.05), and IL-4 (P＜0.05) increased.Conclusion Kuijiekang suppositories with different processes rectly have effect on the ulcerative colitis induced by TNBS,especially in the first and the fourth process.Thus, the fourth process should be taken into consideration to conduct the next research.

Keyword:?Kuijiekang suppository; process; UC

潰瘍性結腸炎（UC）是一種病因尚不明確的慢性、非特異性炎癥性疾病，屬炎癥性腸病的一個主要類型。病變多位于乙狀結腸和直腸，可擴展至近端結腸、橫結腸甚至全結腸，潰瘍嚴重者可侵及肌層及漿膜層，甚至導致腸穿孔。該病病程長、易復發、治愈難度大，被世界衛生組織列為現代難治病之一，嚴重威脅人類生存質量和健康水平，又有高癌變風險[1-2]。潰結康灌腸液是天士力制藥集團股份有限公司開發的中藥六類新藥，由赤芍、青黛、爐甘石、白及等中藥配制而成，治療UC療效顯著[3-5]，但存在灌腸后藥液腸容納性低、患者依從性差等缺陷，在此基礎上，筆者根據原處方及制劑工藝進行劑型改革，結合栓劑制備預實驗、文獻調研及以往的開發經驗，優選4種工藝進行藥效學研究，通過對UC大鼠的治療作用評價，篩選出最佳的提取工藝，從而為潰結康栓制劑研究提供提取工藝基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級SD大鼠70只，雄性，體質量（200±20）g，動物許可證號：SCXK-（軍）2012-0004，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供。

1.1.2 藥品與試劑 美沙拉秦栓由實驗室自制，美沙拉秦原料（湖北巨勝科技有限公司），硬脂酸聚烴氧（40）酯（S-40）（湖北遠成賽創科技有限公司），5% 2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）（sigma公司），福爾馬林由實驗室配制，甲醛溶液，分析純，批號20160111，天津市化學試劑供銷公司，白介素-1β（IL-1β）Elisa試劑盒、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-4（IL-4）Elisa試劑盒（武漢云克隆科技股份有限公司），氯化鈉注射液（河北天成藥業股份有限公司）。

1.1.3 儀器 FA2004電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司），栓劑模型（江蘇省諸暨醫藥設備廠），L600臺式低速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司），Infinite 200型多功能酶標儀（瑞士Tecan公司），DK-98-Ⅱ水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司），遠紅外恒溫干燥箱（余姚市遠東數控儀器廠），Motic BA410 生物顯微鏡（麥克奧迪實業集團有限公司），Motic Pro 282A-數碼顯微系統（麥克奧迪實業集團有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 潰結康栓制備 工藝Ⅰ：赤芍等藥材12倍量水提2次，每次1 h，干燥，粉碎；青黛、爐甘石等藥材粉碎，均過100目藥篩，混勻，制得藥粉Ⅰ。工藝Ⅱ：赤芍、青黛、白及等藥材12倍量水提2次，每次1 h，干燥，粉碎；爐甘石等藥材粉碎，均過100目篩，混勻，制得藥粉Ⅱ。 工藝Ⅲ：赤芍、白及等藥材12倍量水提2次，每次1 h，干燥，粉碎；青黛等藥材12倍量80 %乙醇提取2次，每次2 h；爐甘石粉碎，均過100目篩，混勻，制得藥粉Ⅲ。工藝Ⅳ：赤芍等藥材12倍量水提2次，每次1 h，干燥，粉碎；白及以水提醇沉方式制得白及粗多糖；青黛、爐甘石等藥材過100目篩，混勻，制得藥粉Ⅳ。4種藥粉以S-40為基質，基質：藥粉=1：1，制得4種栓劑，工藝Ⅰ潰結康栓、工藝Ⅱ潰結康栓、工藝Ⅲ潰結康栓，工藝Ⅳ潰結康栓。

1.2.2 實驗分組 SD大鼠適應性飼養1周后，隨機分為正常對照組、模型組、美沙拉秦栓組、工藝Ⅰ潰結康栓組、工藝Ⅱ潰結康栓組、工藝Ⅲ潰結康栓組、工藝Ⅳ潰結康栓組共7組，每組10只。

1.2.3 大鼠UC模型的建立 1）TNBS乙醇溶液配制：5 % TNBS與50 % 乙醇體積比3：2混勻，4 ℃保存。2）UC大鼠模型的復制[6]：大鼠造模前禁食不禁水24 h，稱重后，10 %水合氯醛溶液（3 mL/kg）腹腔麻醉，固定于手術臺上，將外徑2 mm、長約15 cm硅膠管于溫水中浸泡至軟，硅膠管外壁涂抹少許甘油，插入大鼠肛門6～8 cm，以TNBS乙醇溶液120 mg/kg（4 mL/kg）緩慢注入，夾閉肛門，倒置，使造模液充分作用于腸腔，正常對照組大鼠給予相同劑量的生理鹽水灌腸。造模后大鼠側臥歸籠，自然清醒。造模后每天記錄大鼠體質量、飲食、活動狀態及糞便情況。

1.2.4 給藥方法 于大鼠造模第3天后給藥，放入自制固定容器內，使肛門完全暴露，給藥。工藝Ⅰ潰結康栓組、工藝Ⅱ潰結康栓組、工藝Ⅲ潰結康栓組、工藝Ⅳ潰結康栓組給藥劑量 4 mL/kg；美沙拉秦栓組給藥劑量100 mg/kg，模型組與正常對照組給予4 mL/kg蒸餾水。給藥前禁食不禁水12 h，用直徑2 mm、長15 cm于溫水中軟化的硅膠管涂抹少量甘油后從肛門插入約6～8 cm，緩慢推入，給藥后夾閉肛門，倒置。給藥1次/d，連續14 d。

1.2.5 標本采集 給藥后第14天晚禁食，次日對各組大鼠稱重，10 %水合氯醛（3 mL/kg）腹腔麻醉，腹主動脈取血，離心，取上清液，分裝，- 20 ℃冰箱保存。迅速剖開腸系膜，分離肛門至盲腸之間的全部直腸和結腸，觀察大鼠結腸6～8 cm外觀形態，沿縱軸剖開腸管，用預冷的生理鹽水沖洗腸管內殘留物，平鋪展開，肉眼觀察黏膜病變情況，記錄潰瘍個數，直尺測量潰瘍面大小。取1 cm大小的潰瘍面，10 %福爾馬林液浸泡固定，常規石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色法（HE）染色，光鏡下觀察結腸的病理組織學形態。

1.3 檢測指標 1 ）大鼠一般情況： 觀察并記錄各組大鼠精神狀態、飲食、活動、毛色、大便性狀、體質量等情況，各組大鼠進行DAI評分標準參照文獻[7]。2 ）大鼠結腸黏膜損傷評分標準，參照文獻[8-9] ：觀察結腸黏膜大體形態損傷、組織病理學改變。3 ）生化指標測定：運用雙抗體夾心ELISA法檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-4 水平。

1.4 統計學分析 采用SPSS 17.0統計軟件，實驗數據以均數 ±標準差（x± s ）表示，采用單因素方差分析進行各組間差異比較，以P＜0.05為具有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況及DAI評分 正常對照組大鼠體質量正常增長，無腹瀉、血便等異常改變。造模組大鼠在造模1 h后尿液顏色呈橘黃色，表明TNBS溶液已被吸收；造模組大鼠造模當天即出現精神不振、少動、厭食等表現；造、模后第2天即出現稀糊便，夾帶膿血，1周內均伴有體質量下降，毛色無光澤、枯燥，少動等表現。4種提取工藝制備的潰結康栓組、美沙拉秦栓組隨著給藥時間的持續，癥狀明顯好轉，大便逐漸恢復正常，呈灰褐色顆粒狀，毛色逐漸轉為光亮順滑。DAI評分結果,見表1。

表1 各組大鼠DAI評分（x± s ，n=6） 分

2.2 潰結康栓對UC大鼠病理形態學的影響 正常對照組大鼠結腸管壁無增厚，皺襞紋理清晰，黏膜光滑，鏡下觀察黏膜組織完整，細胞形態正常，黏膜固有層腺體排列整齊，含有大量的杯狀細胞，無炎性細胞浸潤。模型組大鼠結腸腸管局部充血、腸襞增厚，纖維化，失去彈性，可見明顯水腫和潰瘍，鏡下觀察結腸黏膜破壞，腺體結構紊亂，大量腺體被破壞消失，部分形成潰瘍，隱窩消失，大量中性粒細胞浸潤至黏膜下層、肌層，并且黏膜下層血管擴張、肌層增厚水腫。工藝Ⅰ潰結康栓組大鼠結腸黏膜仍見殘缺斷裂，杯狀細胞增多，潰瘍面情況改善，黏膜及黏膜下層中性粒細胞浸潤減少，黏膜充血水腫。工藝Ⅱ、工藝Ⅲ潰結康栓組大鼠鏡下觀察結腸黏膜杯狀細胞增多，仍可見隱窩膿腫，黏膜及黏膜下層有明顯中性粒細胞浸潤，與模型組相比，炎癥侵犯的深度和范圍減小。美沙拉秦栓組、工藝Ⅳ潰結康栓組大鼠結腸腸管輕度充血，未見水腫和潰瘍，鏡下觀察結腸黏膜杯狀細胞增多，腺體排列基本整齊，極少數仍見殘缺斷裂，少量中性粒細胞浸潤。結腸黏膜大體評分結果，見表2。

表2 各組大鼠結腸黏膜損傷評分（x ± s , n=6） 分

2.3 潰結康栓對UC大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-4的影響 見表3。

表3 各組大鼠血清中細胞因子水平比較（x± s , n=6）pg/mL

3 小結

從本實驗的結果可知：與模型組比較，不同工藝潰結康栓組DAI評分、結腸黏膜損傷評分、血清中TNF-α、IL-1β水平顯著降低，IL-4水平顯著升高，差異均具有統計學意義（P＜0.05），說明不同提取工藝潰結康栓對UC大鼠有不同程度的治療作用，其中工藝Ⅰ潰結康栓組和工藝Ⅳ潰結康栓組更為明顯，但是由于提取工藝Ⅰ中白及以原藥粉直接加入而制備潰結康栓，白及富含白及粗多糖，有特殊的粘性，在制栓過程中直接導致制栓液粘稠，注模困難。工藝Ⅱ、工藝Ⅲ潰結康栓組各指標差異較不明顯，分析原因可能是潰結康復方臣藥青黛、血竭中藥效成分未被提取完全，而中藥復方是由藥物配伍共同發揮治療作用，這也進一步提示對中藥復方物質基礎研究的必要性。綜合以上結果，再結合實際生產條件，本課題選用工藝Ⅳ作為最佳提取工藝，以制備潰結康栓[10-12]。

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Therapeutic effect of Kuijiekang suppository with different processes on rats with ulcerative colitis induced by TNBS

LI Lixia1, HE Yi2, MA Dongming1, MA Xiaowei1, PEI Shuai1, XIA Hongdong1, ZHANG Dongdong1,ZHENG Xueying1, HUANG Zhijuan2*, XIAO Xuefeng1*
（1.School of Chinese Materia Medica, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China;2.State Key Laboratory of Core Technology in Innovative Chinese Medicine,Tasly Pharmaceutical Group Co, Ltd, Tianjin 300410, China）

R283.1

A

2095-6258(2017)05-0708-04

2017-03-18）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.05.007

國家自然科學基金“中藥質量戰略研究”（81642011）。

李麗霞（1990 -），女，碩士研究生，主要從事藥學專業方向研究。

* 通信作者：肖學鳳，女，教授，碩士研究生導師，電話-（022）59596221，電子信箱-kai1219@163.com黃芝娟，女，高級工程師，電話-（022）86343778，電子信箱-huangzj@tasly.com