不同連作年限懷牛膝根際土壤理化性質及微生物多樣性

王娟英，許佳慧， 吳林坤， 吳紅淼， 朱 銓, 孔露霏, 林文雄,*

1 福建農林大學生命科學學院， 福州 350002 2 福建農林大學生物農藥與化學生物學教育部重點實驗室， 福州 350002 3 福建農林大學農業生態過程與安全監控重點實驗室， 福州 350002

不同連作年限懷牛膝根際土壤理化性質及微生物多樣性

王娟英1,2,3，許佳慧2,3， 吳林坤1,2,3， 吳紅淼1,2,3， 朱 銓1,2,3, 孔露霏1,2,3, 林文雄1,2,3,*

1 福建農林大學生命科學學院， 福州 350002 2 福建農林大學生物農藥與化學生物學教育部重點實驗室， 福州 350002 3 福建農林大學農業生態過程與安全監控重點實驗室， 福州 350002

以不同連作年限懷牛膝根際土壤為材料，采用土壤農化分析技術和磷脂脂肪酸生物標記法，對土壤理化性質以及根際微生物群落結構進行分析。結果表明：懷牛膝連作會使大部分大量元素(全磷、堿解氮、速效磷和速效鉀)含量上升，而全氮、全鉀的變化并無明顯趨勢。全量鈣、全量鎂、全量錳和有效鋅的含量也會隨著連作年限的增加而增加。研究發現，懷牛膝連作1a的土壤與對照相比，根際土壤微生物群落結構差別不大，但是與連作10a和30a的土壤相比微生物多樣性卻發生了明顯變化。土壤中總PLFAs、細菌、革蘭氏陰性菌Gram(-)及真菌含量都隨連作年限增加而明顯上升，微生物多樣性增加，且革蘭氏陽性菌Gram(+)/革蘭氏陰性菌Gram(-)的比值隨著連作年限的增加而下降。此外，土壤中一些嗜熱解氫桿菌和真菌等參與土壤物質循環和木質素降解的微生物類群數量明顯增加，假單胞菌等有益微生物類群也顯著增多，這是牛膝連作促進作用的生物學基礎。研究用藥用植物懷牛膝證明了植物根際微生物結構和功能多樣性對植物連作促進或連作抑制作用的產生與控制的生態學意義。

懷牛膝；連作促進；磷脂脂肪酸；根際微生物

Abstract： In this study, the rhizosphere soils ofAchyranthesbidentata, which was grown in a monoculture for multiple years, were investigated for analyzing the major elements, trace elements and rhizosphere microbial community structure by means of agricultural chemistry and phospholipid fatty acid (PLFA) analysis techniques. The results showed that consecutive monocultures ofA.bidentataincreased the contents of major elements (total phosphorus, alkaline hydrolysis nitrogen, available phosphorus, and available potassium). However, the ability of consecutive monocultures to change the total nitrogen content and total potassium was not obvious. In addition, total calcium, total magnesium, total manganese, and available zinc contents also increased with the increasing years of monoculture. Further analysis of PLFA profiles showed that there were no obvious differences in the rhizosphere microbial community structures between the control and newly plantedA.bidentata. Besides, different results were depicted by 10 years and 30 years of consecutive monoculture, which showed that the total PLFA, bacteria (especially G-), and fungal content increased significantly, and the G+/G-ratio decreased with increasing years of monoculture. Moreover, some microbes involved in material cycling and lignin degradation, such asHydrogenobacter, fungi (PLFA18:2ω6,9), and some beneficial bacteria includingPseudomonasincreased significantly with increasing years of monoculture. These results suggest the important biological basis for the promotion mechanism ofA.bidentataunder a monoculture system. The case study exemplifies the ecological significance of rhizosphere microbial structure and its functional diversity in monoculture promotion or monoculture inhibition.

KeyWords:Achyranthesbidentata; continuous cropping promotion; phospholipid fatty acid; rhizosphere microorganisms

懷牛膝(AchyranthesbidentataBl.)為莧科牛膝屬多年生草本植物，主產于我國河南溫縣、武陟、博愛及沁陽等地，是著名的“四大懷藥”之一。根據《中華人民共和國藥典》記載，牛膝性味甘苦、酸平，具有補肝腎、散淤血、填精補髓、益陰活血之功效[1]。在長期的生產實踐過程中，人們發現大約有70%以上的藥用植物連續在同一塊田地上種植后，會出現土壤微生態環境惡化，自身生長發育不良，產量與藥用品質下降等現象，即連作障礙(continuous monoculture problem)。根據文獻報道，大部分塊根類藥材(如地黃、人參、三七、當歸等)常會出現這種現象，因而稱之為忌連作藥用植物[2- 5]。然而，與之相反的是，懷牛膝是一種非常耐連作的道地藥材。近些年來作者在調查中發現，頭茬懷牛膝品質較差，而連作5a后其品質明顯改善。當連作10a以上時，懷牛膝地下部即藥用部位生長良好，主根又長又粗，須根和側根少，產量高、品質好[6-7]。

有研究表明，藥用植物連作障礙的產生與其根系分泌物介導下，根際微生物結構變異，病原菌增多，有益菌下降有關[8]。而連作促進的產生及其機制至今仍是個迷。李娟等[9]運用HPLC等技術測定牛膝主要藥用活性成分甾酮和皂苷含量，結果顯示麥茬地中首次種植的牛膝藥材中甾酮含量(0.5401 mg/g)和皂苷含量(1.0462 mg/g)均低于多年懷牛膝-小麥復種連作地中牛膝的甾酮(0.7493 mg/g)和皂苷含量(2.4381 mg/g)，因而推斷連作促進可能與連作引起土壤中藥用活性成分的累積有關。然而，這些物質能否有效促進藥用植物本身的生長發育，未見直接的試驗證據報道。此外，有研究結果表明，植物根系分泌物進入土壤后易被土壤微生物降解，很難達到實驗室條件下的有效作用濃度[10]，因而，產生直接化感(direct allelopathy)促進或抑制作用的可能性不大[11]。近年來，越來越多的研究結果認為，植物化感作用(包括連作化感促進或連作化感抑制作用)是由植物根系分泌物介導而間接產生的化學生態學現象。換一句話說，植物化感作用是植物與土壤微生物相互作用的結果。在這一過程中，根際環境作為土壤微生物活動的一個復雜的、動態的微生態系統，在植物生長、吸收、分泌過程中扮演著重要角色。諸多研究表明，根際土壤微生物多樣性參與根際生態系統的物質轉化和循環，在維持土壤健康方面扮演著越來越重要的角色[12-13]。因此，從植物-微生物根際互作角度，探討懷牛膝連作促進的根際生態學效應是一項亟待解決的問題。

研究植物根際土壤微生物的群落結構變化是植物-微生物根際互作機制的重要內容之一。通常可采用可培養微生物法、磷脂脂肪酸生物標記法(PLFAs)和BIOLOG技術、限制性片段長度多態性(T-RFLP)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、同位素標記等方法[14]。磷脂脂肪酸生物標記法(PLFA)主要根據不同類群微生物的指示PLFAs不同，具有高度專一性，能夠快速、直接提供土壤微生物的生物量和群落結構的信息，且實驗步驟要求較低，因此，該方法仍是目前較為常用的和有效的一種微生物群落結構分析方法[15-16]。馬琨等[17]采用PLFAs方法研究發現，連作與間作處理下，馬鈴薯根際土壤微生物群落結構差異大，具體表現在馬鈴薯與蠶豆間作下，其根際效應比馬鈴薯與玉米間作的明顯。李奇松等[18]研究也發現在無隔和網隔處理(即存在間作作物地下部根系互作)時，玉米和花生間作不僅是產量高而且根際微生物總PLFAs、細菌、真菌都高于全隔(即不存在間作作物地下部根系互作)處理。可見PLFAs至今仍是經濟有效的方法。據此，本研究采用PLFAs技術，以不同連作年限牛膝根際土壤為研究對象，探討牛膝根際土壤微生物群落結構隨連作年限增加的動態變化，為闡明牛膝的連作促進機理提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

以“核桃紋”牛膝為供試品種，同一時間種植在不同連作年限的土壤中，在其塊根膨大期，采用五點取樣法收集不同土壤樣本，即收集以下4個處理的土壤樣本：(1)對照土，即對應于各處理，且只種前作作物小麥的土壤(CK)；(2)連作牛膝1a的土壤；(3)連作10a的土壤；(4)連作30a的土壤。田地種植模式采用不同年限的復種連作，即前茬種植小麥，收獲后種植牛膝。

懷牛膝播種期為7月20日，花期7—9月，果期9—10月。播種前，施有機復合肥1200kg/hm2，翻地約50cm左右再整地播種。之后在整個牛膝生長發育期間均采用相同的田間管理措施。本試驗于懷牛膝塊根膨大期(9月20日)取樣，土壤樣品采用五點取樣法，牛膝根際土壤取樣方法如下：首先用鏟子去除懷牛膝地上部表層土壤，然后用鏟子挖出地下部塊根，輕輕抖去根圍土，收集塊根表面根際土。收集的土壤樣品過2mm孔徑篩子后分成兩部分，一部分風干用于測定土壤理化性質，另一部分用于提取土壤微生物磷脂脂肪酸。

1.2 土壤理化性質測定方法

1.2.1 土壤中大量元素的測定

稱取風干后土壤1.000g土裝入開氏瓶中，加入5mL濃硫酸，電壓調制360V，消煮3h至土變白。待其稍冷卻后，加入500μL過氧化氫，將電壓調制230V，以后每隔5min加少于500μL 過氧化氫，直至上清液變澄清后取出開氏瓶。加入20mL雙蒸水，過濾，定容100mL。濾液保存用于全N、全P和全K的測定。堿解N的測定：采用堿解擴散法。速效P的測定：采用(碳酸氫鈉浸提)鉬銻抗比色法。速效K的測定：采用醋酸銨浸提原子吸收法[19]。

1.2.2 土壤中微量元素的測定

全量微量元素測定：將土壤風干后過孔徑為2mm的塑料篩，稱取0.1000g土樣，加入5mL濃硝酸和1mL的30%過氧化氫，經微波消解，微波儀工作條件如表1。

表1 微波儀工作條件

待冷卻后，將液體轉移至10mL離心管，10000r/min離心3min。將上清液倒出，用超純水定容至25mL，最后過濾備用，同時做空白實驗。測定時采用WFX- 130A原子吸收分光光度計來測量土壤中全量Fe、Mn、Zn、Cu、Ca、Mg的含量[20](表2)。

有效態銅、鋅、鐵、錳的測定：采用二乙三胺五乙酸(DTPA)浸提法[21]，稱取風干后懷牛膝根際土壤10.00g于50mL離心管中，加入新鮮配制的DTPA浸提液20mL，蓋好瓶蓋，置于25℃，180r/min條件的搖床上搖3h，立即過濾。濾液立即用原子吸收分光光度計測定。除了標曲用DTPA浸提液配置外，濃度及儀器工作條件與全量元素測定方法相同。

1.3 土壤微生物群落PLFA生物標記分析

土壤微生物群落結構分析：采用磷脂脂肪酸(PLFA)生物標記法進行測定[22]。操作步驟為：將20mL的0.2mol/L的KOH甲醇溶液和4g的新鮮土樣加到50mL的離心試管中，混合均勻，在37℃下溫育1h(磷脂脂肪酸釋放，并甲脂化，樣品10min搖勻1次)。加入3mL 1.0mol/L的醋酸溶液(中和pH值)，充分混勻后加10mL正己烷(使PLFAs轉到有機相中)，600rpm/min離心15min，然后將上層正己烷轉到干凈試管中，用冷凍干燥儀揮發掉溶劑。最后將PLFAs溶解在1mL體積比為1∶1的正己烷∶甲基丁基醚溶液中，再加入10μmol/L的內標19∶0，過濾后用作GC分析。

表2 WFX-130A原子吸收分光光度計火焰法工作條件

采用美國Agilent 6890N型氣相色譜儀，條件：二階程序升高柱溫，70℃起始1min，接著20℃/min升至170℃，持續2min，爾后5℃/min升溫至280℃，維持5min，最后以40℃/min升溫至300℃，1.5min后結束。進樣量1μL，進樣分流比100∶1。

1.4 數據分析

方差分析采用Excel和DPS 3.0結合，數據均采用單因子方差，多重比較方法選用Tukey法(P<0.05)來分析。當分析不同連作年限牛膝土壤的4個樣本之間土壤微生物PLFAs的分布特性時，將數據對數轉化，以歐氏距離為聚類尺度，用(WPGMA)進行系統聚類。并采用Canoco軟件進行主成分(PCA)分析。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質分析

2.1.1 土壤中大量元素分析

從表3可見，除了全氮、全鉀并無明顯的變化趨勢外，牛膝連作下，土壤中全磷、堿解氮、速效磷和速效鉀的含量均上升。進一步分析發現，在連作10a的土壤中這些營養成分的含量已經有明顯的增加，而在連作30a的土壤中最高。可見，懷牛膝連作會使土壤大部分大量元素(特別是速效的元素)含量上升。

表3 不同連作年限懷牛膝根際土壤中大量元素的含量

CK:表示對照土壤CK stands for control soil; 同一列不同字母表示不同樣品差異水平達 0. 05

2.1.2 土壤中微量元素分析

試驗分析發現：除了土壤的全量鈣、全量鎂、全量錳含量隨著連作年限的增加而增加外，其它3種元素(如全量鐵、全量鋅和全量銅)的含量并無明顯增加的趨勢，有的甚至還呈現下降的趨勢(表4)。對土壤有效態微量元素分析還發現，除了土壤有效鋅含量隨著連作年限的增加而增加外，土壤中有效鐵、有效鋅和有效錳含量都呈先下降后上升變化的規律(表5)，這說明懷牛膝連作會影響土壤中全量微量元素的變化，但是對于土壤有效態的微量元素卻影響不顯著。

表4 不同連作年限懷牛膝根際土壤中全量微量元素的含量

表5 不同連作年限懷牛膝根際土壤中有效態微量元素的含量

2.3 不同連作年限懷牛膝根際土壤微生物群落PLFAs檢測

磷脂脂肪酸結果顯示，共檢測到15種PLFAs的生物標記(表6)。包括細菌的PLFAs生物標記，如12：0、16：0；革蘭氏陽性細菌PLFAs生物標記，如i14：0、a15：0、a17：0；革蘭氏陰性細菌PLFAs生物標記，如16：1ω9t、16：1 ω 7c、cy19：0；放線菌PLFAs生物標記，如10Me18：0；真菌PLFAs生物標記，如18：2 ω6,9、18：1 ω9c；嗜熱解氫桿菌和原生生物的PLFAs生物標記，分別是18：0和20：4 ω6c(6,9,12,15)，種類豐富。除了在1a的根際土壤里未檢測到原生生物和13：0的PLFAs標記外，其他磷脂脂肪酸在所有土壤里均有分布。且種植過牛膝的根際土壤PLFAs豐富度大部分都高于對照土壤。進一步分析還發現，特別是16：0這類磷脂脂肪酸的含量隨著連作年限的增加而增加，且增長幅度非常明顯。而i14：0的含量則呈下降趨勢。

表6 不同連作年限牛膝根際土壤中各PLFAs的濃度

濃度單位 concentration unit：(nmol/g d.m. soil);1a表示種植牛膝第1年土壤 1 year refering to the rhizospheric soils ofAchyranthesbidentatamonocultured for one year;10a表示種植牛膝第10年土壤 10 year refering to the rhizospheric soils ofA.bidentatamonocultured for ten years，30a表示種植牛膝第30年土壤 30 year refering to the rhizospheric soils ofA.bidentatamonocultured for thirty years

2.4 不同連作年限懷牛膝根際土壤PLFAs種類和含量變化

從表7可以看出，不同連作年限懷牛膝根際土壤磷脂脂肪酸(PLFAs)生物標記種類和含量差異明顯。但是不同連作年限的懷牛膝土壤微生物種類和含量變化趨勢相似，都呈現出細菌>革蘭氏陰性細菌G->真菌>革蘭氏陽性細菌G+的趨勢。并且發現與連作1a的土壤相比，除了G+的含量下降之外，連作10a和30a的土壤中其他的微生物(包括總PLFAs、細菌、G-、真菌)含量都明顯上升。另外，G+/G-的比值隨著連作年限的增加而下降，而真菌/細菌得比值表現出相反的變化趨勢。

表7不同連作年限牛膝根際土壤中總PLFAs和各類菌所占百分比

Table7ThetotalPLFAsandpercentageofdifferentspecificmicrobialPLFAstototalonesinrhizosphericsoilsofAchyranthesbidentatamonoculturedforthedifferentyears

項目Item對照CK1a10a30a總PLFATotalPLFA83.1863c110.0285b126.5162a123.5279a細節Bacteria54.933a56.504a57.4441a57.1649aG+10.3961b12.4356a9.2338b9.4127bG-20.0886a20.5265a21.3383a21.6644a真菌Fungi20.9642a17.7198b18.1142b20.5061a細菌/真菌G+/G-/%51.8839b60.5722a43.2946c43.48cFungi/Bacteria/%38.1893a31.367b31.5483b35.9248ab

Total PLFA濃度單位concent unit：(nmol/g d.m. soil);其它單位用“%”表示the other units indicated in “%”

2.5 基于PLFAs生物標記的不同連作年限懷牛膝聚類及主成分分析

將所有土壤樣品(6個處理，3次重復)進行主成分分析(圖1A)，發現牛膝連作對根際微生物群落結構有明顯影響。主成分1(PC1)和主成分2(PC2)分別解釋總方差變量的44.3%和74.2%。對照和連作1a的懷牛膝根際土壤距離相近，均分布于主成分1的正端，連作10a與連作30a的距離較近，均分布于主成分1的負端。如圖1B所示，當歐式距離為14.23時，不同連作年限懷牛膝根際土壤可聚為兩大類，第一類包括CK，連作1a懷牛膝根際土壤，而連作10a和連作30a的懷牛膝根際土壤則聚在第二類中，說明這些土壤微生物多樣性相類似，生物量相近。這結果與主成分分析的結果相類似。綜合主成分與聚類分析結果可以看出，連作年限短的土壤樣品(如連作1a)明顯區別于連作年限長的土壤樣品(如連作10a、連作30a)。

圖1 不同連作年限牛膝根際土壤中PLFAs生物標記主成分分析(A)和聚類分析(B)Fig.1 Classification of PLFAs biomarks in rhizospheric soils of Achyranthes bidentata monocultured for different years by principal component (A) and WPGMA cluster analysis (B)

2.6 不同連作年限牛膝根際土壤中各類PLFAs和大量元素冗余分析(RDA)

圖2 不同連作年限牛膝根際土壤中各類PLFAs和大量元素冗余分析Fig.2 Redundancy analysis (RDA) between group-specific phospholipid fatty acid (PLFAs) and soil nutrients variables in rhizospheric soils of Achyranthes bidentata monocultured for different years

從RDA(圖2)結果發現各類PLFAs以及營養元素均分布在3個象限內。進一步分析表明G+/G-和G+和絕大多數環境變量和各類微生物菌群呈負相關，而與全氮呈正相關關系。細菌以及革蘭氏陰性菌的含量和絕大多數的元素(包括全磷、速效氮、速效磷、全鉀、速效鉀)含量密切相關。而真菌以及真菌/細菌的比值與元素含量關系不大。

3 討論

前人研究表明，在單一化種植模式下，農作物減產的原因可大致總結為以下3點：(1)土壤養分匱乏或失調[28-29]；(2)根系分泌物中化感物質的自毒效應[30]；(3)連作土壤微生態結構失衡[31-32]。對于這3個原因，不同的學者有不同研究結論與看法。孫冰玉[33]研究認為，連作下，東北烤煙根際土壤肥力發生了很大變化，土壤有機質含量、供鉀和供磷水平明顯不足，且必需元素等都顯著降低。但是，韓春麗等[34]發現連作大豆土壤中微量元素鋅、錳、鐵、銅含量的變化在不同年限中并無明顯下降變化規律。近年來，不少學者研究認為同一種植物長時間在同一田塊上種植，會造成了土壤中有益微生物數量的減少及有害病原菌數量的增長，在此消彼長的過程中影響植物體的正常功能、生長發育等生命活動。華菊玲等[35]發現，連作下芝麻根際土壤有益菌(芽孢桿菌Bacillus)的菌群數量明顯低于新種植地，而尖孢鐮孢菌(Fusariumoxysporum)、青枯勞爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)的含量顯著高于新種植地，正是這樣的微生物區系失衡導致了芝麻的連作障礙產生，因而導致減產降質，其結果充分說明了土壤微生物群落結構與功能多樣性的重要性。

本研究結果提供了一個作物連作促進的特例。研究發現懷牛膝連作會使得土壤中有效態的大量元素含量增加，微量元素則相反。然而，對全量大量元素影響卻不明顯。郝慧榮等[36]和Chen等[6]研究結果也認為，與牛膝連作2a土壤相比，連作20a的土壤有機質、全氮、全磷、全鉀、速效氮(銨態氮)和速效磷均有所增加，尤其以全磷、速效氮(銨態氮)和速效磷增加較為顯著，說明懷牛膝連作一定程度上改善了根際土壤環境，提高了土壤的保肥能力和補給能力，不僅有利于植株的生長，還為根際微生物活動提供營養和能源。據此，本研究從土壤微生物角度入手，利用磷脂脂肪酸生物標記法，研究連作下懷牛膝根際土壤微生物的變化情況。結果表明，在連作條件下，懷牛膝根際土壤微生物群落結構明顯發生了改變，即連作年限越長，微生物群落結構差異越大，且土壤中細菌特別是革蘭氏陰性細菌的數量呈上升趨勢，革蘭氏陽性細菌的數量變化不大，所以G+/G-比值明顯下降。前人研究認為該比值下降，說明土壤中可利用養分逐漸增多，佐證了我們對牛膝土壤有效養分隨連作年限延長而增多的結論[37]。進一步分析發現，隨連作年限的延長，土壤中一些嗜熱解氫桿菌、放線菌和真菌等一些參與土壤物質循環和木質素降解菌[25- 27]的微生物類群的數量也明顯提高，這是促進牛膝連作土壤養分有效化不斷增強的生物學基礎。此外，本研究還發現，隨連作年限的延長，土壤中一些有益微生物類群如假單胞菌Psudomonas(PLFA16:0)[15]芽孢桿菌Bacillus(PLFAa15:0)[23-24]也顯著增多(表6)。作者所在的課題組郝慧榮等[36]和Chen等[6]在對牛膝根際土壤微生物群落結構分析時發現，連作20a牛膝土壤微生物對氨基酸類的代謝活性較高，對多聚物、酚酸類、羧酸類的代謝活性較低，放線菌和原生動物的PLFA相對含量比連作2年分別高出1.4%和2.3%；T-RFLP分析發現，一些促生根際菌(PGPR，以芽孢桿菌屬Bacillus和類芽孢桿菌屬Paenibacillus為主)，包括假單胞菌屬Pseudomonas、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis、浸麻類芽孢桿菌(Paenibacillusmacerans)、環狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、球形芽孢桿菌(Bacillussphaericus)等和一些改善土壤質地、防治植物病害的功能菌(如鏈霉菌屬Streptomycetes等)隨著連作年限的增加而不斷增加，而以支原體屬(Mycoplasma)為主的病原菌則不斷減少，這是牛膝連作促進的重要根際生物學特性。

綜上所述，植物根際微生物結構與功能多樣性對植物的健康生長有著極其重要的作用。近年來，有學者[38]將植物根際微生物組稱為植物的第二基因組學，已引起國內外學者的普遍關注。眾所周知，植物根系分泌物是介導根際微生物變化的誘導因子。不同的植物以及植物在其生長發育的不同階段，其根系會分泌各種次生代謝產物，而這些植物根系分泌物能產生間接的生態效應，并有效抑制某些類群微生物的生長，同時也會有效促進另一些類群微生物的生長，從而影響根際微生物的區系結構和功能多樣性，最終導致土壤微生物群落的選擇性效應[39- 41]。其中最為典型的就是豆科植物與根瘤菌的共生關系。豆科植物根系會分泌一種類黃酮物質，從而誘導根瘤菌在其根系表面定殖，從而形成共生關系，這就說明根系分泌物與根際微生物之間存在著密切關系。覃逸明等[42]采用高效液相色譜法(HPLC)對藥用植物丹鳳(PaeoniaostiiT.)自毒物質進行檢測，發現根系分泌物的濃度(包括阿魏酸、肉桂酸、香草醛、香豆素和丹皮酚)隨著連作年限的增加而上升，進而影響丹鳳地下部根長、根系活力以及地上部植株的生物量。Zolla等[43]在研究干旱脅迫對擬南芥植株生長的影響時發現，種植在同域土壤中的植物生物量要高于非同域土壤的，這是由于同域土壤中存在許多根際促生菌的原因。本研究結果發現隨著連作年限增加，總PLFAs生物量和細菌總量特別是革蘭氏陰性細菌和一些有益菌含量都在增加。這可能就是因為根系分泌物介導下，植物根際促生菌(PGPR)在土壤中產生富集作用的結果。然而，究竟是何種牛膝根系分泌物，且如何介導連作牛膝根際土壤微生物差異變化及其作用的內在機制尚需深入研究。

[1] 孟大利, 侯柏玲, 汪毅, 張鵬, 李銑. 中藥牛膝中的植物甾酮類成分. 沈陽藥科大學學報, 2006, 23(9): 562- 564, 576- 576.

[2] 郭蘭萍, 黃璐琦, 蔣有緒, 呂冬梅. 藥用植物栽培種植中的土壤環境惡化及防治策略. 中國中藥雜志, 2006, 31(9): 714- 717.

[3] 吳林坤, 黃偉民, 王娟英, 吳紅淼, 陳軍, 秦賢金, 張重義, 林文雄. 不同連作年限野生地黃根際土壤微生物群落多樣性分析. 作物學報, 2015, 41(2): 308- 317.

[4] 李勇, 劉時輪, 黃小芳, 丁萬隆. 人參(Panaxginseng)根系分泌物成分對人參致病菌的化感效應. 生態學報, 2009, 29(1): 161- 168.

[5] 陸曉菊, 官會林, 張正蕓, 馬永存, 唐蜀昆. 三七連作根際土壤微生物區系的16S rRNA系統遺傳多樣性. 微生物學報, 2015, 55(2): 205- 213.

[6] Chen T, Li J, Wu L K, Lin S, Wang J H, Li Z F, Zhang Z Y, Lin W X. Effects of continuous monoculture ofAchyranthesbidentataon microbial community structure and functional diversity in soil. Allelopathy Journal, 2015, 36(2): 197- 211.

[7] 李振方. 懷牛膝連作促進效應及其分子機理研究[D]. 福州: 福建農林大學, 2008.

[8] Wu L K, Wang J Y, Huang W M, Wu H M, Chen J, Yang Y Q, Zhang Z Y, Lin W X. Plant-microbe rhizosphere interactions mediated byRehmanniaglutinosaroot exudates under consecutive monoculture. Scientific Reports, 2015, 5: 15871.

[9] 李娟, 黃劍, 李萍, 張重義. 連作對牛膝中甾酮及三萜類物質含量的影響. 時珍國醫國藥, 2010, 21(10): 2433- 2434.

[10] Lin R Y, Wang H B, Guo X K, Ye C Y, He H B, Zhou Y, Lin W X. Impact of applied phenolic acids on the microbes, enzymes and available nutrients in paddy soils. Allelopathy Journal, 2011, 28(2): 225- 236.

[11] Wu H M, Wu L K, Wang J Y, Zhu Q, Lin S, Xu J H, Zheng C L, Chen J, Qin X J, Fang C X, Zhang Z X, Azeem S, Lin W X. Mixed phenolic acids mediated proliferation of pathogensTalaromyceshelicusandKosakoniasacchariin continuously monoculturedRadixpseudostellariaerhizosphere soil. Frontiers in Microbiology, 2016, 7: 335.

[12] Jacobsen C S, Hjelms? M H. Agricultural soils, pesticides and microbial diversity. Current Opinion in Biotechnology, 2014, 27: 15- 20.

[13] Rutigliano F A, Castaldi S, D′Ascoli R, Papa S, Carfora A, Marzaioli R, Fioretto A. Soil activities related to nitrogen cycle under three plant cover types in Mediterranean environment. Applied Soil Ecology, 2009, 43(1): 40- 46.

[14] 吳林坤, 林向民, 林文雄. 根系分泌物介導下植物-土壤-微生物互作關系研究進展與展望. 植物生態學報, 2014, 38(3): 298- 310.

[15] 張秋芳, 劉波, 林營志, 史懷, 楊述省, 周先冶. 土壤微生物群落磷脂脂肪酸PLFA生物標記多樣性. 生態學報, 2009, 29(8): 4127- 4137.

[16] Wu Z Y, Haack S E, Lin W X, Li B L, Wu L K, Fang C X, Zhang Z X. Soil microbial community structure and metabolic activity ofPinuselliottiiplantations across different stand ages in a subtropical area. PLoS One, 2015, 10(8): e0135354.

[17] 馬琨, 楊桂麗, 馬玲, 汪春明, 魏常慧, 代曉華, 何文壽. 間作栽培對連作馬鈴薯根際土壤微生物群落的影響. 生態學報, 2016, 36(10): 2987- 2995.

[18] Li Q S, Wu L K, Chen J, Khan M A, Luo X M, Lin W X. Biochemical and microbial properties of rhizospheres under maize/peanut intercropping. Journal of Integrative Agriculture, 2016, 15(1): 101- 110.

[19] 王昭艷, 左長清, 曹文洪, 楊潔, 徐永年, 秦偉, 張京鳳. 紅壤丘陵區不同植被恢復模式土壤理化性質相關分析. 土壤學報, 2011, 48(4): 715- 724.

[20] 黃明堦, 魏道智, 陳燕丹, 蔡碧瓊, 游秀花. 荷葉無機營養元素含量及溶出率. 河南科技大學學報: 自然科學版, 2010, 31(5): 80- 82, 86- 86.

[21] 杜靜靜. 不同種植年限果園土壤理化性質與酶活性研究[D]. 臨汾: 山西師范大學, 2013.

[22] Wu L K, Li Z F, Li J, Khan M A, Huang W M, Zhang Z Y, Lin W X. Assessment of shifts in microbial community structure and catabolic diversity in response toRehmanniaglutinosamonoculture. Applied Soil Ecology, 2013, 67: 1- 9.

[23] 劉國紅. 芽孢桿菌的分類鑒定及其相關屬的分類系統演變研究[D]. 福州: 福建農林大學, 2009.

[24] 劉貫鋒. 芽胞桿菌分類學特征及其生防功能菌株篩選[D]. 福州: 福建農林大學, 2011.

[25] 劉波, 胡桂萍, 鄭雪芳, 張建福, 謝華安. 利用磷脂脂肪酸(PLFAs)生物標記法分析水稻根際土壤微生物多樣性. 中國水稻科學, 2010, 24(3): 278- 288.

[26] 郁紅艷. 農業廢物堆肥化中木質素的降解及其微生物特性研究[D]. 長沙: 湖南大學, 2007.

[27] 付學琴, 黃文新. 不同樹齡南豐蜜橘根際土壤微生物群落多樣性分析. 園藝學報, 2014, 41(4): 631- 640.

[28] 秦舒浩, 曹莉, 張俊蓮, 師尚禮, 王蒂. 輪作豆科植物對馬鈴薯連作田土壤速效養分及理化性質的影響. 作物學報, 2014, 40(8): 1452- 1458.

[29] 簡在友, 王文全, 孟麗, 王丹, 游佩進, 張子龍. 人參連作土壤元素含量分析. 土壤通報, 2011, 42(2): 369- 371.

[30] 楊瑞秀. 甜瓜根系自毒物質在連作障礙中的化感作用及緩解機制研究[D]. 沈陽: 沈陽農業大學, 2014.

[31] Yu J Q, Matsui Y. Extraction and identification of phytotoxic substances accumulated in nutrient solution for the hydroponic culture of tomato. Soil Science and Plant Nutrition, 1993, 39(4): 691- 700.

[32] Yu J Q, Matsui Y. Phytotoxic substances in root exudates of cucumber (CucumissativusL.). Journal of Chemical Ecology, 1994, 20(1): 21- 31.

[33] 孫冰玉. 連作對煙田土壤酶活性、微生物種群數量及土壤理化性質的影響[D].哈爾濱: 東北林業大學, 2010.

[34] 韓春麗, 劉娟, 肖春華, 張旺鋒, 劉梅, 黃建軍. 新疆綠洲連作棉田土壤微量元素含量的時空變化研究. 土壤學報, 2010, 47(6): 1194- 1201.

[35] 華菊玲, 劉光榮, 黃勁松. 連作對芝麻根際土壤微生物群落的影響. 生態學報, 2012, 32(9): 2936- 2942.

[36] 郝慧榮, 李振方, 熊君, 陳慧, 張重義, 林文雄. 連作懷牛膝根際土壤微生物區系及酶活性的變化研究. 中國生態農業學報, 2008, 16(2): 307- 311.

[37] 張圣喜, 陳法霖, 鄭華. 土壤微生物群落結構對中亞熱帶三種典型闊葉樹種凋落物分解過程的響應. 生態學報, 2011, 31(11): 3020- 3026.

[38] Berendsen R L, Pieterse C M J, Bakker P A H M. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in Plant Science, 2012, 17(8): 478- 486.

[39] 王建花, 陳婷, 林文雄. 植物化感作用類型及其在農業中的應用. 中國生態農業學報, 2013, 21(10): 1173- 1183.

[40] Haichar F Z, Marol C, Berge O, Rangel-Castro J J, Prosser J I, Balesdent J, Heulin T, Achouak W. Plant host habitat and root exudates shape soil bacterial community structure. The ISME J, 2008, 2(12): 1221- 1230.

[41] Hartmann A, Schmid M, Van Tuinen D, Berg G. Plant-driven selection of microbes. Plant and Soil, 2009, 321(1/2): 235- 257.

[42] 覃逸明, 聶劉旺, 黃雨清, 王千, 劉欣, 周科. 鳳丹(PaeoniaostiiT.)自毒物質的檢測及其作用機制. 生態學報, 2009, 29(3): 1153- 1161.

[43] Zolla G, Badri D V, Bakker M G, Manter D K, Vivanco J M. Soil microbiomes vary in their ability to confer drought tolerance toArabidopsis. Applied Soil Ecology, 2013, 68: 1- 9.

AnalysisofphysicochemicalpropertiesandmicrobialdiversityinrhizospheresoilofAchyranthesbidentataunderdifferentcroppingyears

WANG Juanying1,2,3, XU Jiahui2,3, WU Linkun1,2,3, WU Hongmiao1,2,3, ZHU Quan1,2,3, KONG Lufei1,2,3, LIN Wenxiong1,2,3 *

1Collegeoflifescience,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China2KeyLaboratoryofBiopesticideandChemicalBiology,MinistryofEducation,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China3FujianProvincialKeyLaboratoryofAgroecologicalProcessingandSafetyMonitoring,Fuzhou350002,China

國家自然科學基金(81303170，81573530，31401950，U1205021)；閩臺作物特色種質創制與綠色栽培協同創新中心(2015- 75)

2016- 06- 07; < class="emphasis_bold">網絡出版日期

日期:2016- 12- 27

10.5846/stxb201606071097

*通訊作者Corresponding author.E-mail: wenxiong181@163.com

王娟英，許佳慧， 吳林坤， 吳紅淼， 朱銓, 孔露霏, 林文雄.不同連作年限懷牛膝根際土壤理化性質及微生物多樣性.生態學報,2017,37(17):5621- 5629.

Wang J Y, Xu J H, Wu L K, Wu H M, Zhu Q, Kong L F, Lin W X.Analysis of physicochemical properties and microbial diversity in rhizosphere soil ofAchyranthesbidentataunder different cropping years.Acta Ecologica Sinica,2017,37(17):5621- 5629.