蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示玉米籽粒發(fā)育過程中脅迫相關(guān)蛋白的表達(dá)特性

于濤，李耕，劉鵬，董樹亭，張吉旺，趙斌

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蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示玉米籽粒發(fā)育過程中脅迫相關(guān)蛋白的表達(dá)特性

于濤，李耕，劉鵬，董樹亭，張吉旺，趙斌

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/作物生物學(xué)國家重點實驗室，山東泰安 271018）

【目的】從蛋白質(zhì)組學(xué)的層面探討玉米籽粒發(fā)育過程中脅迫相關(guān)蛋白的表達(dá)特性，分析其功能，揭示籽粒自身防御系統(tǒng)的分子調(diào)控機理。【方法】大田條件下，以玉米品種登海661（DH661）為供試材料，67 500株/hm2密度下種植，開花期人工飽和授粉后第3、5、10、15、20、30、40和50 天（DAP）取果穗中部籽粒。TCA-丙酮沉淀法提取籽粒總蛋白，用同位素標(biāo)記相對定量（iTRAQ）技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。通過匹配Uniprot玉米蛋白數(shù)據(jù)庫鑒定籽粒總蛋白，并且用基因本論（GO）注釋按照生物過程、分子功能及細(xì)胞組件進(jìn)行功能分類。分析鑒定籽粒發(fā)育過程中顯著差異表達(dá)的脅迫相關(guān)蛋白，并且將其分層聚類以展示其在籽粒發(fā)育過程中的表達(dá)模式。【結(jié)果】通過匹配玉米蛋白數(shù)據(jù)庫，籽粒中總計鑒定到4 751個蛋白，這些蛋白涉及多種生物過程與分子功能，其中代謝過程與分子過程是最主要的兩個生物過程，而催化活性與綁定功能是最主要的兩個分子功能類別，表明這些生物過程與分子功能對籽粒發(fā)育具有重要作用。定量分析檢測到123個脅迫相關(guān)蛋白在玉米籽粒發(fā)育過程中顯著差異表達(dá)，主要參與籽粒蛋白修飾（33個）、活性氧（ROS）體內(nèi)平衡（31個）、貯藏物質(zhì)保護(hù)（17個）、病蟲害響應(yīng)（8個）及其他脅迫響應(yīng)過程（34個）。蛋白修飾相關(guān)蛋白主要包含一系列的熱激蛋白、肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶及蛋白二硫鍵異構(gòu)酶，并且這些蛋白在籽粒不同發(fā)育階段均顯著積累，這對穩(wěn)定籽粒中的蛋白結(jié)構(gòu)具有重要作用。ROS相關(guān)蛋白包含不同的抗氧化酶系，并且主要在籽粒發(fā)育前、后期顯著積累，維護(hù)了ROS的體內(nèi)平衡。貯藏物質(zhì)保護(hù)相關(guān)蛋白主要包含多種蛋白酶抑制劑、油脂體蛋白及油脂體固醇蛋白，并且這些蛋白隨著籽粒發(fā)育不斷上調(diào)表達(dá)，保護(hù)了貯藏物質(zhì)的合成與積累。病蟲害響應(yīng)相關(guān)蛋白同樣在籽粒發(fā)育后期顯著積累，增強了籽粒對生物脅迫的抗性。其他脅迫響應(yīng)相關(guān)蛋白主要包括一系列的晚期胚胎豐富蛋白（LEA）、膜聯(lián)蛋白、脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白、非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白及脂氧合酶，其中LEA在籽粒發(fā)育后期顯著積累，膜聯(lián)蛋白與脂氧合酶主要在發(fā)育前期顯著表達(dá)，而脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白及非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白在籽粒不同發(fā)育階段均有積累，表明這些蛋白在籽粒不同發(fā)育階段發(fā)揮重要作用。【結(jié)論】脅迫相關(guān)蛋白在籽粒不同發(fā)育階段顯著積累，構(gòu)建了一個協(xié)同、多樣、穩(wěn)定的防御調(diào)控機制，維護(hù)了籽粒正常的發(fā)育過程。

玉米；籽粒發(fā)育；iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)；脅迫相關(guān)蛋白；蛋白功能

0 引言

【研究意義】玉米作為食物、飼料的重要來源，其籽粒發(fā)育好壞直接關(guān)系到最終的產(chǎn)量與品質(zhì)。然而，籽粒發(fā)育過程中不可避免地遭受復(fù)雜多樣的環(huán)境脅迫，顯著影響籽粒產(chǎn)量與品質(zhì)的形成。蛋白是生命活動的直接調(diào)控者。因此，在蛋白水平上，深入研究玉米籽粒發(fā)育過程中脅迫相關(guān)蛋白的表達(dá)特性，對于解析籽粒自身防御系統(tǒng)的分子調(diào)控機理，增強玉米的抗逆能力，提高籽粒產(chǎn)量與品質(zhì)具有重要意義。同時，對于玉米育種與栽培種植也具有指導(dǎo)價值。【前人研究進(jìn)展】玉米籽粒發(fā)育源于雙受精過程，可劃分為三個不同的階段：早期發(fā)育階段（庫容建成期）、灌漿期及成熟期[1]。然而，籽粒在不同發(fā)育階段常常受到多重脅迫，尤其在籽粒成熟期，含水量迅速下降，收獲時的籽粒含水量一般低于20%[2]。這種低水分條件下，玉米其他營養(yǎng)組織細(xì)胞會迅速失活，而籽粒在吸脹后仍能正常萌發(fā)，表明籽粒在發(fā)育過程中必須獲得充足的耐脫水能力[3]。前人對生物脅迫如細(xì)菌、真菌感染[4-5]及非生物脅迫包括干旱[6]、高溫[7-8]、弱光[9]和淹水[10-11]對籽粒發(fā)育的影響及籽粒應(yīng)對這些脅迫形態(tài)、生理生化的響應(yīng)機制進(jìn)行了大量研究。然而，對其發(fā)育過程中防御系統(tǒng)的分子調(diào)控過程鮮見報道。蛋白質(zhì)組學(xué)可以在蛋白水平解析籽粒發(fā)育過程中脅迫響應(yīng)的分子調(diào)控機理，其中同位素標(biāo)記相對定量技術(shù)（iTRAQ）能夠在復(fù)雜樣品中大規(guī)模鑒定與定量蛋白[12]。以iTRAQ為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析在小麥[13]、水稻[14]中的研究表明，多種脅迫相關(guān)蛋白在籽粒發(fā)育過程中顯著差異表達(dá)，這些協(xié)同表達(dá)的蛋白參與籽粒防御調(diào)控，保證籽粒在不同發(fā)育階段的正常發(fā)育。【本研究切入點】前人針對玉米籽粒發(fā)育過程中形態(tài)、生理生化的脅迫響應(yīng)進(jìn)行了大量研究，但涉及籽粒發(fā)育防御系統(tǒng)的分子調(diào)控過程鮮見報道。籽粒在不同發(fā)育階段脅迫相關(guān)蛋白的表達(dá)特性尚不清楚。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究利用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)方法，旨在鑒定及描述玉米籽粒不同發(fā)育階段脅迫相關(guān)蛋白的表達(dá)特性。通過分析這些蛋白的表達(dá)特性及潛在的生物學(xué)功能，以進(jìn)一步揭示玉米籽粒發(fā)育過程中防御調(diào)控的分子機理，為培育玉米耐脅迫新品種及栽培種植提供生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設(shè)計

本試驗于2015年在黃淮海玉米區(qū)域技術(shù)創(chuàng)新中心及山東農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生物學(xué)國家重點實驗室進(jìn)行。試驗采用玉米品種登海661，播種前精細(xì)整地、造墑。6月15日播種，10月5日收獲，種植密度67 500株/hm2。小區(qū)面積60 m2（6 m×10 m）。田間管理按照大田標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，生育期內(nèi)水分供應(yīng)充足，病蟲草害預(yù)防及時。

吐絲期，選擇有代表性、生長一致的植株掛牌標(biāo)記。開花后人工飽和授粉，分別在授粉后第3、5、10、15、20、30、40及50 天（DAP）于標(biāo)記的植株取3個果穗。將每個果穗中部籽粒剝離，并選取100粒液氮速凍后移至-80℃超低溫冰箱內(nèi)保存。每個取樣時期進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，用于iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)的分子生物學(xué)研究。

1.2 蛋白提取與含量測定

稱取1 g籽粒樣品于液氮中研磨，樣品懸浮于10倍體積含有10%（v/v）TCA的預(yù)冷丙酮溶液中，-20℃沉淀2 h。4℃、20 000×離心 30 min，棄上清液，取沉淀。沉淀中再加入10倍體積預(yù)冷的丙酮溶液，清洗沉淀（將沉淀搗碎或懸起），-20℃沉淀30 min，4℃、20 000×離心30 min。重復(fù)此過程多次直至沉淀基本為白色，后經(jīng)真空干燥得到粉末狀蛋白。稱取0.2 g蛋白干粉溶解于3 mL裂解液（8 mol·L-1Urea，30 mmol·L-1HEPES，1mmol·L-1PMSF，2 mmol·L-1EDTA，10 mmol·L-1DTT），超聲5 min助溶，4℃、20 000×離心30 min，取上清液。上清液中加入DTT至終濃度10 mmol·L-1，56℃水浴1 h。取出后，迅速加入IAM至終濃度55 mmol·L-1，暗室靜置1 h。混合樣品中再次加入4倍體積的預(yù)冷丙酮溶液，-20℃沉淀3 h。隨后，4℃、20 000×離心30 min，取沉淀。沉淀溶解于400 μL的復(fù)溶液（0.5 mol·L-1TEAB，0.1% SDS），超聲3 min助溶，4℃、20 000×再次離心30 min，取上清液。采用蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。

1.3 蛋白消化與肽段標(biāo)記

每個籽粒樣品取100 μg蛋白體積，用含0.1% SDS的TEAB補齊所有樣品體積。每100 μg蛋白樣品加入3.3 μg的胰蛋白酶，37 ℃水浴24 h。然后，補加胰蛋白酶1 μg，繼續(xù)37℃水浴24 h。凍干消化液，然后使用TEAB（水﹕TEAB=1﹕1）每管30 μL重新溶解肽段。按照試劑盒說明，用8標(biāo)iTRAQ試劑中的113、114、115、116、117、118、119及121分別標(biāo)記3、5、10、15、20、30、40及50 DAP的籽粒蛋白樣品。8個標(biāo)記的蛋白樣品室溫靜置2 h后混合，真空干燥。試驗共進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)標(biāo)記。

1.4 高效液相色譜

混合后的肽段樣品溶于10倍體積的強陽離子緩沖液A（10 mmol·L-1KH2PO4，乙腈25%，pH 3.0）。使用高效液相色譜系統(tǒng)并裝配強陽離子交換色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，100?）進(jìn)行肽段分餾。緩沖液B（10 mmol·L-1KH2PO4，2 mol·L-1KCl，乙腈25%，pH 3.0）用于流動相，流速設(shè)置為1 mL·min-1。設(shè)置強陽離子交換液相色譜分級梯度（0%，45 min；0—5%，1 min；5—30%，20 min；30—50%，5 min并維持5 min；50—100%，5 min并維持10 min）。總共收集36份洗脫組分，并且根據(jù)色譜峰合并為16份。隨后，洗脫組分根據(jù)使用說明，經(jīng)C18反相色譜除鹽后凍干，-80℃保存。

1.5 質(zhì)譜鑒定

質(zhì)譜分析使用納升液相系統(tǒng)（Shimadzu，Kyoto，Japan）。混合后的蛋白樣品經(jīng)C18色譜柱（75 μm×2 cm，5 μm，100?）用含0.1%甲酸的乙腈溶液在45 min內(nèi)濃度梯度由5%上升到80%分離樣品，流速為300 nL·min-1。

質(zhì)譜分析采用Q-Exactive質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific，MA，USA）檢測肽段信號。檢測方式如下：正離子模式；母離子掃描范圍350—2 000 m/z；一級質(zhì)譜分辨率：m/z為200時70 000次；AGC target：1e6；一級最大IT：50 ms；掃描范圍數(shù)目：1；動態(tài)排除：15 s。

多肽和多肽的碎片的質(zhì)量電荷比，按照下列方法采集：每次全掃描后采集20個碎片圖譜，二級質(zhì)譜激活類型：HCD；隔離窗：2 m/z；二級質(zhì)譜分辨率：m/z為200時17 500次；微碎片圖譜數(shù)：1；二級最大IT值：100 ms；規(guī)一化碰撞能量：28 eV；填充率：1%。

1.6 數(shù)據(jù)分析

對于蛋白鑒定，采用MASCOT軟件（版本2.3.01，Matrix Science，London，U.K.）將原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)自動匹配Uniprot玉米蛋白數(shù)據(jù)庫。搜索參數(shù)設(shè)置如下：胰蛋白酶作為消化類型，并且允許1個最大的胰蛋白酶漏切位點；固定修飾采用半胱氨酸，可變修飾采用iTRAQ 8-plex（K）、iTRAQ 8-plex（Y）、iTRAQ 8-plex（N-term）及Oxidation（M）；肽段質(zhì)量誤差為15 ppm；串聯(lián)質(zhì)譜誤差為0.1 Da。蛋白至少含有一個唯一肽段，并且陽性結(jié)果錯誤率（FDR）≤1%才被認(rèn)為鑒定有效。

對于蛋白定量，由于iTRAQ是相對定量的方法，因此，在每一個生物學(xué)重復(fù)中均以3 DAP籽粒樣品為參考，將后續(xù)每個時期的蛋白樣品分別與之進(jìn)行比對。為保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，只有蛋白的定量信息至少存在于兩次生物學(xué)重復(fù)中才做進(jìn)一步分析。以3次生物學(xué)重復(fù)的平均值作為最終蛋白表達(dá)倍率。籽粒發(fā)育過程中，平均相對表達(dá)水平上調(diào)或下調(diào)差異大于1.5倍，并且在統(tǒng)計學(xué)ANOVA檢驗上＜0.05的蛋白定義為顯著差異表達(dá)的蛋白。

鑒定到的玉米籽粒蛋白進(jìn)行基因本輪（GO）注釋，并且按照生物過程、分子功能及細(xì)胞組件的功能范疇進(jìn)行分類[15]。采用Cluster 3.0軟件對籽粒發(fā)育過程中顯著差異表達(dá)的脅迫相關(guān)蛋白進(jìn)行表達(dá)模式聚類分析，聚類參數(shù)使用相似性度量及歐氏距離。聚類結(jié)果采用Java TreeView軟件進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 玉米籽粒蛋白鑒定及GO注釋

8個時期的籽粒蛋白樣品經(jīng)過提取，用于iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)分析。通過匹配玉米蛋白數(shù)據(jù)庫，玉米籽粒中總計鑒定到4 751個蛋白，其中2 755個至少存在于兩次生物學(xué)重復(fù)中（圖1）。

玉米籽粒蛋白經(jīng)GO注釋，按照生物過程、分子功能及細(xì)胞組件的功能范疇進(jìn)行分類。如圖2所示，玉米籽粒中的蛋白涉及多種生物過程與分子功能。生物過程類別中，蛋白廣泛參與代謝過程（24.58%）、分子過程（22.85%）、單一生物過程（17.80%）、刺激應(yīng)答（6.50%）、細(xì)胞成分組織（6.30%）、生物過程調(diào)控（6.22%）和定位（5.60%）等過程，其中代謝過程（24.58%）與分子過程（22.85%）是其最主要的兩個生物過程。分子功能類別中，蛋白主要具備催化活性（43.59%）、綁定（40.90%）、結(jié)構(gòu)分子活性（5.00%）及轉(zhuǎn)運因子（4.10%）等活性，其中催化活性（43.59%）與綁定功能（40.90%）占據(jù)最大的兩個功能類別。細(xì)胞組件類別中，蛋白主要定位于細(xì)胞（37.62%）、細(xì)胞器（28.49）、細(xì)胞膜（14.97%）及大分子復(fù)合物中（10.59%）。

圖1 3次生物學(xué)重復(fù)鑒定到的玉米籽粒總蛋白

2.2 脅迫相關(guān)蛋白的功能類別與表達(dá)特性

如表1所示，GO注釋與定量分析發(fā)現(xiàn)123個脅迫相關(guān)蛋白在籽粒發(fā)育過程中顯著差異表達(dá)。根據(jù)這些蛋白的生物學(xué)功能，將其劃分為以下5種功能類別：蛋白修飾（33個）、ROS體內(nèi)平衡（31個）、貯藏物質(zhì)保護(hù)（17個）、病蟲害響應(yīng)（8個）及其他脅迫響應(yīng)過程（34個）。

如圖3所示，分層聚類分析將這些脅迫相關(guān)蛋白的表達(dá)模式劃分為5種（A、B、C、D及E）。表達(dá)模式A包含23個蛋白，其表達(dá)水平在發(fā)育前期最高，后隨著籽粒發(fā)育不斷下調(diào)；表達(dá)模式B包含16個蛋白，這些蛋白在5及40 DAP具有兩個表達(dá)高峰；表達(dá)模式C包含5個蛋白，其表達(dá)水平在15—20 DAP顯著積累；表達(dá)模式D包含34個蛋白，其表達(dá)水平在15 DAP開始緩慢上調(diào)，并在50 DAP達(dá)到最高；表達(dá)模式E包含45個蛋白，其表達(dá)趨勢與D相似，只是在20 DAP開始快速上調(diào)表達(dá)，并且持續(xù)到50 DAP。

2.3 蛋白修飾相關(guān)蛋白的表達(dá)特性

33個蛋白修飾相關(guān)蛋白在籽粒發(fā)育過程中顯著差異表達(dá)，其中包括一系列的熱激蛋白，如熱激蛋白16.9 kDa I類熱激蛋白（編號1）、17.5 kDa II類熱激蛋白（編號2）、推測的熱激蛋白20伴侶家族蛋白（編號29）、熱激蛋白101（編號12）、熱激蛋白1（編號13）及3個70 kDa 熱激蛋白（編號10、11及32）（表1）。此外，其他參與蛋白修飾的蛋白還主要包括9個肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶（編號16—24）及3個蛋白二硫鍵異構(gòu)酶（編號26—28）（表1）。分層聚類分析顯示有6個（A），4個（C）及20個（D和E）蛋白分別在發(fā)育的前、中及后期顯著積累，而3個（B）在發(fā)育的前、后期均顯著積累（表2）。

表1 籽粒發(fā)育過程中鑒定到的顯著差異表達(dá)的脅迫相關(guān)蛋白

2.4 活性氧（ROS）體內(nèi)平衡相關(guān)蛋白的表達(dá)特性

如表1所示，31個顯著差異表達(dá)的脅迫相關(guān)蛋白涉及ROS的體內(nèi)平衡，主要包括1-Cys過氧化物酶（編號34）、2個抗壞血酸過氧化物酶（編號35及36）、2個多酚氧化酶（編號52及53）、6個谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（編號41—46）、5個超氧化物歧化酶（編號54—58）及6個硫氧還原蛋白（編號59—64）。分層聚類分析顯示有8個（A）及16個（D和E）蛋白分別在發(fā)育的前、后期顯著積累，而僅有1個（C）在發(fā)育中期顯著表達(dá)；此外，有6個（B）蛋白在發(fā)育的前、后期均顯著積累（表2）。值得注意的是同一蛋白的不同亞型（如谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、超氧化物歧化酶及硫氧還原蛋白）具有不同的表達(dá)模式，以硫氧還原蛋白為例，6個硫氧還原蛋白亞型中，1個（編號64）亞型在發(fā)育中期顯著積累，3個亞型在發(fā)育后期顯著積累，剩下的2個亞型在發(fā)育的前、后期均顯著積累（表1）。此外，鋅金屬硫II類蛋白（編號40）在50 DAP的表達(dá)水平與3 DAP相比上調(diào)高于44倍（表1），顯示出其在籽粒發(fā)育后期發(fā)揮重要作用。

生物過程Biological process：1代謝過程Metabolic process；2分子過程Cellular process；3單一生物過程Single-organism process；4刺激應(yīng)答Response to stimulus；5細(xì)胞成分組織Cellular component organization or biogenesis；6生物過程調(diào)控Biological regulation；7定位Localization；8發(fā)育過程Developmental process；9多細(xì)胞組織過程Multicellular organismal process；10再生Reproduction；11信號Signaling；12多機體過程Multi-organism process；13生長Growth；14免疫系統(tǒng)過程Immune system process；15生物過程調(diào)控Biological regulation；16生物附著Rhythmic process；17移動Locomotion；18細(xì)胞致死Cell killing。分子功能Molecular function：19催化活性Catalytic activity；20綁定Binding；21結(jié)構(gòu)分子活性Structural molecule activity；22轉(zhuǎn)運因子活性Transporter activity；23分子功能調(diào)控Molecular function regulator；24電荷載體活性Electron carrier activity；25抗氧化活性Antioxidant activity；26營養(yǎng)受體活性Nutrient reservoir activity；27分子感應(yīng)器活性Molecular transducer activity；28核苷酸轉(zhuǎn)錄因子活性Nucleic acid binding transcription factor activity；29蛋白質(zhì)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性Protein binding and transcription factor activity；30金屬伴侶活性Metallo chaperone activity。細(xì)胞組件Cell component：31細(xì)胞Cell；32細(xì)胞器Organelle；33細(xì)胞膜Membrane；34大分子復(fù)合物Macromolecular complex；35膜結(jié)合腔體Membrane-enclosed lumen；36細(xì)胞間區(qū)域Extracellular region；37胞間連絲Cell junction；38共質(zhì)體Symplast；39超分子纖維Supramolecular fiber；40病毒體Virion；41核狀體Nucleoid；42細(xì)胞外液Extracellular matrix

表2 分層聚類分析脅迫相關(guān)蛋白及蛋白功能在不同表達(dá)模式中的分布

2.5 貯藏物質(zhì)保護(hù)相關(guān)蛋白的表達(dá)特性

17個顯著差異表達(dá)的脅迫相關(guān)蛋白涉及貯藏物質(zhì)保護(hù)，主要包括多種蛋白酶水解抑制劑，如α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑（編號65）、胰蛋白酶抑制劑（編號70）、3個枯草桿菌蛋白酶抑制劑（編號67—69）及7個半胱氨酸蛋白酶抑制劑（編號72—78）（表1）。此外，2個油脂體蛋白（編號79及80）及1個油脂體固醇蛋白（編號81）也被成功鑒定。分層聚類分析顯示幾乎所有的貯藏物質(zhì)保護(hù)相關(guān)蛋白（15個，D及E）的表達(dá)均隨著籽粒發(fā)育不斷積累，并且在發(fā)育后期達(dá)到最高（表2）。

2.6 病蟲害響應(yīng)相關(guān)蛋白的表達(dá)特性

如表1所示，8個顯著差異表達(dá)的脅迫相關(guān)蛋白涉及病蟲害響應(yīng)，包括抗菌肽MBP-1（編號82）、Bet v I過敏原（編號85）、P21 蛋白（編號86）、主要乳膠蛋白22（編號87）、發(fā)病機制相關(guān)蛋白1（編號88）、推測的防御素（編號89）及2個幾丁質(zhì)酶（編號83及84）。與貯藏物質(zhì)保護(hù)相關(guān)蛋白的表達(dá)模式相似，除了Bet v I過敏原蛋白（B）在發(fā)育前、后期均顯著積累外（表1），剩下的所有病蟲害響應(yīng)相關(guān)蛋白（15個，D及E）均在發(fā)育后期顯著表達(dá)（表2）。

2.7 其他脅迫響應(yīng)相關(guān)蛋白的表達(dá)特性

如表1所示，34個涉及其他脅迫響應(yīng)的蛋白在籽粒發(fā)育過程中顯著差異表達(dá)，主要包括一系列的晚期胚胎豐富蛋白（LEA），如2個LEA 1（編號95及96）、3個LEA D-34（編號100—102）及3個LEA 3（編號104—106）。此外，還主要包含2個膜聯(lián)蛋白（編號90及91）、3個脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白（107—109）、6個非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白（編號110—115）及4個脂氧合酶（編號120—123）（表1）。分層聚類分析顯示8個（A）蛋白在發(fā)育前期顯著積累，5個（B）蛋白在發(fā)育前、中期均顯著積累，而絕大多數(shù)蛋白（21個，D及E）均隨著籽粒發(fā)育上調(diào)表達(dá)，并且在發(fā)育后期達(dá)到最高（表2）。

3 討論

3.1 玉米籽粒中的蛋白質(zhì)組特性

玉米籽粒發(fā)育是一個復(fù)雜的生理與分子過程。探討籽粒發(fā)育的分子調(diào)控機理是解析籽粒發(fā)育過程的重要手段。轉(zhuǎn)錄組學(xué)[16-17]分析表明大量基因在玉米籽粒發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄表達(dá)，涉及籽粒的基礎(chǔ)代謝和脅迫響應(yīng)。相比于轉(zhuǎn)錄組學(xué)，蛋白質(zhì)組水平上的研究相對較少，并且過去蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要依靠凝膠為基礎(chǔ)的試驗技術(shù)，如雙向電泳及熒光雙向電泳[18-21]。這些技術(shù)存在鑒定通量低、定量不準(zhǔn)確等限制因素，如利用雙向電泳技術(shù)，玉米胚乳[20]及胚胎[21]中僅分別鑒定到504及111個蛋白。較少的蛋白數(shù)量必然限制對玉米籽粒整體蛋白質(zhì)組特性的認(rèn)識。本研究中，借助iTRAQ技術(shù)，玉米籽粒中成功鑒定出4 751個蛋白，其數(shù)量顯著高于過去以凝膠電泳為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[18-21]，充分表明iTRAQ技術(shù)的高通量特性。GO注釋顯示玉米籽粒蛋白涉及多種生物過程與分子功能，其中代謝過程與分子過程是最主要的兩個生物過程，而催化活性與綁定功能是最主要的兩個分子功能類別（圖2）。這些結(jié)果與水稻籽粒中的研究相似[14]，表明這些生物過程與分子功能對籽粒發(fā)育具有重要作用。值得注意的是一部分蛋白僅僅在單個生物學(xué)重復(fù)中被檢測到（圖1），這可能是由個體差異或者每一次獨立試驗中蛋白肽段提取不一致所導(dǎo)致。

3.2 籽粒發(fā)育過程中蛋白修飾相關(guān)蛋白的表達(dá)特性

籽粒發(fā)育過程中的生理代謝受到蛋白的直接調(diào)控，而穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)是其行使功能的首要基礎(chǔ)。熱激蛋白可作為分子伴侶對新生蛋白進(jìn)行折疊修飾，特別在脅迫條件下能夠穩(wěn)定蛋白構(gòu)象、阻止蛋白聚集、對變性及錯誤修飾的蛋白進(jìn)行重新折疊修飾[22]。基于熱激蛋白的特性，其廣泛參與多種分子過程如蛋白代謝、脅迫響應(yīng)與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[22]。本研究中，8個熱激蛋白在籽粒發(fā)育過程中顯著差異表達(dá)且具有不同的表達(dá)模式，其中兩個70 kDa熱激蛋白的亞型（編號10及11）分別在發(fā)育前、中期積累，另一個亞型（編號32）與16.9 kDa I類熱激蛋白、17.5 kDa II類熱激蛋白、熱激蛋白101及推測的熱激蛋白20伴侶家族蛋白在發(fā)育后期顯著積累，而熱激蛋白1在發(fā)育前、后期均顯著積累。小麥[13]、水稻[14]籽粒蛋白質(zhì)組學(xué)研究中同樣觀察到熱激蛋白多樣的表達(dá)模式。這些結(jié)果反映出不同類型的熱激蛋白可能通過不同的表達(dá)模式在籽粒發(fā)育過程中行使多重功能。此外，9個肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶及3個蛋白二硫鍵異構(gòu)酶同樣顯著差異表達(dá)（表1）。這兩種類型蛋白均參與蛋白的修飾過程，在穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮重要作用[23]。值得注意的是除一個肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶亞型（編號24）在發(fā)育前、中期均顯著表達(dá)外，剩下8個蛋白亞型均在發(fā)育后期顯著積累（表1），表明肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶主要在籽粒發(fā)育后期發(fā)揮重要作用。總之，本研究結(jié)果顯示蛋白修飾相關(guān)蛋白在籽粒不同發(fā)育階段協(xié)同表達(dá)，這有利于穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)，進(jìn)而保證蛋白在不同階段的功能調(diào)控。

3.3 籽粒發(fā)育過程中的活性氧（ROS）體內(nèi)平衡調(diào)控

ROS平衡體系對維護(hù)植物發(fā)育過程中生理及分子代謝的正常進(jìn)行具有重要作用，而ROS平衡被打破會導(dǎo)致植物細(xì)胞積累過多的ROS，進(jìn)而氧化細(xì) 胞膜，對細(xì)胞結(jié)構(gòu)及重要調(diào)控蛋白造成不可逆的損傷[24]。為維持細(xì)胞體內(nèi)的ROS平衡，控制過多ROS帶來的毒性影響，植物建立了多重的抗氧化酶系 統(tǒng)[24]。本研究中，31個差異表達(dá)的脅迫相關(guān)蛋白涉及ROS的體內(nèi)平衡，包含不同的抗氧化酶系如1-Cys過氧化物酶、抗壞血酸過氧化物酶、多酚氧化酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、超氧化物歧化酶及硫氧還原蛋白（表1）。ROS相關(guān)蛋白種類的多樣性表明多重抗氧化酶系統(tǒng)參與玉米籽粒發(fā)育過程的ROS調(diào)控。表達(dá)分析顯示，除1個ROS相關(guān)蛋白在中期顯著表達(dá)外，有8個和16個蛋白分別在發(fā)育前、后期顯著積累以及有6個蛋白在發(fā)育前、后期均顯著積累（表2）。分析其原因，一方面在籽粒發(fā)育前期，由于籽粒表皮發(fā)育還未成熟，外界氧氣易通過滲透作用進(jìn)入籽粒內(nèi)部而造成籽粒氧含量過高[25]；另一方面在籽粒發(fā)育后期，由于水分含量迅速下降易擾亂細(xì)胞膜穩(wěn)定性及破環(huán)電子傳遞鏈，進(jìn)而導(dǎo)致ROS的顯著積累[26]。因此，玉米籽粒在這兩個階段激活多重的抗氧化酶系統(tǒng)維持了自身ROS的體內(nèi)平衡。同時，同一蛋白的不同亞型（如谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、超氧化物歧化酶及硫氧還原蛋白）具有不同的表達(dá)模式（表1），表明在籽粒不同發(fā)育階段不同的蛋白亞型發(fā)揮作用。此外，鋅金屬硫II類蛋白屬于金屬硫蛋白家族，而該蛋白家族涉及穩(wěn)定金屬離子平衡，解毒、調(diào)控ROS平衡等過程[27]。本研究中一個鋅金屬硫II類蛋白（編號40）在50 DAP的表達(dá)水平與3 DAP相比上調(diào)高于44倍（表1），顯示其在籽粒發(fā)育后期發(fā)揮重要作用。總之，進(jìn)一步深入分析這些抗氧化酶的生化反應(yīng)，將有助于我們理解玉米籽粒發(fā)育過程中的ROS調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

3.4 籽粒發(fā)育過程中的貯藏物質(zhì)保護(hù)及對生物脅迫的響應(yīng)

淀粉、蛋白及油脂是玉米籽粒的貯藏物質(zhì)，其在籽粒灌漿期開始合成與積累，并且在籽粒萌發(fā)期間分解，為幼苗生長提供必要的碳、氮資源。本研究中，17個貯藏物質(zhì)保護(hù)相關(guān)蛋白被鑒定，包括多種蛋白酶水解抑制劑，如α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑、胰蛋白酶抑制劑、枯草桿菌蛋白酶抑制劑及半胱氨酸蛋白酶抑制劑（表1）。這些蛋白能夠防止貯藏蛋白的水解，其中α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑還能防止淀粉的水解退化[28]。除2個推測的半胱氨酸蛋白酶抑制劑（編號77及78）外，剩下的所有蛋白酶水解抑制劑均在籽粒灌漿期開始上調(diào)表達(dá)，并且在發(fā)育后期到達(dá)最高（表1），這也與淀粉及貯藏蛋白的積累模式相一致。此外，2個油脂體蛋白及1個油脂體固醇蛋白也在發(fā)育后期顯著積累（表1）。油脂體蛋白及油脂體固醇蛋白是植物油脂體的主要修飾蛋白，而油脂體是植物儲藏油脂的主要場所[29]。在籽粒發(fā)育后期，由于水分含量迅速下降，油脂體會相互聚集，顯著積累這兩種蛋白可能通過調(diào)節(jié)油脂體大小以及防止油脂體聚集，進(jìn)而保證油脂的正常積累[29]。總之，這些貯藏物質(zhì)保護(hù)相關(guān)蛋白的協(xié)同表達(dá)保證了貯藏物質(zhì)正常的合成與積累。

籽粒發(fā)育除了受到非生物脅迫，還會受到一些生物脅迫如細(xì)菌、真菌感染[4-5]。本研究中，抗菌肽MBP-1、Bet v I過敏原、P21蛋白、主要乳膠蛋白22、發(fā)病機制相關(guān)蛋白1、推測的防御素及2個幾丁質(zhì)酶被鑒定參與籽粒病蟲害響應(yīng)。其中，幾丁質(zhì)酶能夠水解真菌細(xì)胞壁，轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因顯著提高棉花對枯萎病和黃萎病的抗性[30]。與貯藏物質(zhì)保護(hù)相關(guān)蛋白的表達(dá)模式相似，除了Bet v I過敏原蛋白在發(fā)育前、后期均顯著積累外，剩下的所有病蟲害響應(yīng)相關(guān)蛋白均在發(fā)育后期顯著積累（表2）。這些協(xié)同表達(dá)的蛋白顯著增強籽粒對生物脅迫的抗性。

3.5 其他脅迫響應(yīng)相關(guān)蛋白對籽粒發(fā)育具有重要作用

本研究中，34個顯著差異表達(dá)的蛋白涉及其他的脅迫響應(yīng)，其中包括一系列LEA，并且這些蛋白均在發(fā)育后期顯著積累（表1），這也與小麥[13]、水稻[14]中的研究結(jié)果一致。研究表明水稻中顯著積累LEA可提升籽粒后期的耐脫水性[31]。玉米中，這些蛋白還被認(rèn)為是籽粒保持高活力的必要因子[32]。此外，應(yīng)對多種生物與非生物脅迫，LEA也會被誘導(dǎo)積累[33]。因此，LEA可以保護(hù)籽粒應(yīng)對多重脅迫，特別是水分迅速下降所帶來的干燥脅迫，顯著積累這些蛋白提升了玉米籽粒的耐脫水能力。

除了LEA，2個膜聯(lián)蛋白、3個脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白、6個非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白及4個脂氧合酶也在籽粒發(fā)育過程中顯著差異表達(dá)（表1）。膜聯(lián)蛋白與脂氧合酶的活性在脅迫環(huán)境下顯著增強，表明這兩類蛋白在脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用[34-35]，其中脂氧合酶還可以通過合成茉莉酸而直接調(diào)控脅迫信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[36]。本研究中，2個膜聯(lián)蛋白及4個脂氧合酶中的3個亞型（編號120—122）均在發(fā)育前期顯著積累（表1），表明膜聯(lián)蛋白與脂氧合酶主要在此階段發(fā)揮重要作用。脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白及非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白能夠調(diào)控脂類化合物的跨膜運輸，廣泛參與植物的多重脅迫響應(yīng)，如低溫、干燥、氧化脅迫及微生物感染[37]。本研究中，2個脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白亞型（編號107及109）在發(fā)育前期顯著表達(dá)，5個非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白亞型（編號110及112—115）在發(fā)育后期顯著積累，而1個脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白亞型（編號108）及1個非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白亞型（編號111）在發(fā)育前、中期均顯著積累（表1）。不同的表達(dá)模式反映出脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白及非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白在籽粒不同發(fā)育階段發(fā)揮不同功能。

4 結(jié)論

玉米籽粒中鑒定到4 751個蛋白，其中123個脅迫相關(guān)蛋白在玉米籽粒發(fā)育過程中顯著差異表達(dá)。這些蛋白主要參與蛋白修飾、活性氧（ROS）體內(nèi)平衡、貯藏物質(zhì)保護(hù)、病蟲害響應(yīng)及其他脅迫響應(yīng)過程。這些脅迫相關(guān)蛋白在籽粒不同發(fā)育階段顯著積累，構(gòu)建了一個協(xié)同、多樣、穩(wěn)定的防御調(diào)控機制，維護(hù)了籽粒正常的發(fā)育過程。

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（責(zé)任編輯 楊鑫浩）

Proteomic Analysis of Maize Reveals Expression Characteristics of Stress-Related Proteins During Grain Development

YU Tao, LI Geng, LIU Peng, DONG ShuTing, ZHANG JiWang, ZHAO Bin

(College of Agronomy, Shandong Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Biology, Taian 271018, Shandong)

【Objective】In order to understand the molecular regulation mechanism of defense system in maize grain, the expression characteristics of stress-related proteins during grain development were studied by using approach of plant proteomics.【Method】Denghai 661 (DH661) was used as experimental material and planted at 67 500 plants/hm2in field. The middle grains were harvested after flowering artificial saturation pollination at 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 d, respectively. The total proteins were extracted by the TCA-acetone precipitation method and then were analyzed by isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ) proteomics. The proteins in maize grain were identified by searching the Uniprot maize protein database and gene ontology (GO) annotation was used to classify the functions of these proteins according to the biological process, molecular function and cellular component. Quantitative analysis was applied to identify stress-related proteins that were significantly differentially expressed during grain development. Hierarchical cluster analysis was used to show the expression patterns of these stress-related proteins during grain development.【Result】A total of 4 751 proteins were identified in maize grain by matching the maize protein database, and these proteins were involved in diverse biological processes and molecular functions, of which the metabolic process and molecular processes were the main biological processes, and the catalytic activity and binding function were the main molecular categories, showing that these biological processes and molecular functions played important roles in maize grain development. Quantitative analysis detected 123 stress-related proteins were significantly differentially expressed during grain development, and these proteins were mainly involved in grain protein modification (33), reactive oxygen species (ROS) homeostasis (31), storage material protection (17), disease response (8) and other stress response process (34). The proteins related to protein modification mainly included a series of heat shock protein, peptidyl-prolyl cis-trans isomerase and protein disulfide isomerase, and these proteins significantly accumulated at different development stages, which played important roles in stability of protein structure. ROS related proteins contained a variety of antioxidants, and mainly significantly accumulated at both early and late development stages, which maintained the homeostasis of ROS. Storage material protection related proteins mainly contained a variety of protease inhibitors, oleosin and steroleosin, and the expression of these proteins were constantly raised with the grain development, which protected the synthesis and accumulation of storage material. The proteins involved in disease response also significantly accumulated at late development stage, which enhanced the grain resistance to biological stresses. Proteins involved in other stress response mainly included a series of late embryogenesis abundant protein (LEA), annexin, lipid transfer protein, nonspecific lipid transfer protein and lipoxygenase, of which all of the LEA significantly accumulated at late development stage, annexin and lipoxygenase significantly accumulated at early development stage, while lipid transfer protein and nonspecific lipid transfer proteins were accumulated at different development stages, showing that these proteins played important roles in different grain development stages.【Conclusion】Stress-related proteins were accumulated during maize grain different development stages, which constructed a harmonious, diverse and stable defense regulatory mechanism, and thus maintained the normal development of maize grain.

maize; grain development; iTRAQ proteomics; stress-related protein; protein function

2016-09-29；

2017-02-20

國家自然科學(xué)基金（31371576，31401339）、國家重點研發(fā)計劃項目（2016YFD0300106，2016YFD0300205）、國家科技支撐計劃項目（2013BAD07B06-2）、國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項經(jīng)費項目（201203100，201203096）、山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（SDAIT-02-08）、國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項目（CARS-02-20）、山東省高等學(xué)校科技計劃項目（J14LF10）、山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新課題、山東省玉米育種與栽培技術(shù)企業(yè)重點實驗室

劉鵬，E-mail：liupengsdau@126.com。通信作者董樹亭，E-mail：stdong@sdau.edu.cn

聯(lián)系方式：于濤，E-mail：yutaosdnd@163.com。