“砍傷法”所結人工沉香的質量評價Δ

李浩洋，楊芳，劉瓊瑜，張憲臣（中山出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，廣東中山528400）

“砍傷法”所結人工沉香的質量評價Δ

李浩洋＊，楊芳，劉瓊瑜，張憲臣#（中山出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，廣東中山528400）

目的：對“砍傷法”所結人工沉香進行質量評價，為其科學種植與采摘提供參考。方法：采用氣相色譜-質譜聯用法和高效液相色譜法，對3批“砍傷法”所結人工沉香（編號為1、2、3號，分別結香5、10、20年）的揮發性成分、液相特征圖譜、沉香四醇和醇溶性浸出物含量進行檢測。結果：3批人工沉香的揮發性成分主要為芳香族類化合物、倍半萜類化合物、脂肪酸類化合物和色酮類化合物；2、3號樣品的液相特征圖譜與沉香對照品基本一致；3批樣品的沉香四醇含量為0.078%～0.254%，醇溶性浸出物含量為12.4%～20.8%。1號樣品的液相特征圖譜與沉香四醇含量不符合2015年版《中國藥典》（一部）相關規定。結論：“砍傷法”所結人工沉香與天然沉香具有相似的揮發性化學成分，結香10年以上的人工沉香質量符合2015年版《中國藥典》（一部）中“沉香”項下的規定，可以代替天然沉香入藥。

砍傷法；人工沉香；質量評價；氣相色譜-質譜聯用法；高效液相色譜法

國產沉香為瑞香科植物白木香[Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg]含樹脂的木材，主產于我國海南、廣東等地，是我國傳統的名貴藥材和天然香料，具行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘之功效[1]。長期以來由于對沉香資源的過度采伐，白木香植物資源日漸枯竭，現被列為國家二級保護野生植物，并載入《世界自然保護聯盟瀕危物種紅色名錄》[2]。

在自然界中，只有當白木香受到刺激或損傷時，才會產生沉香，結香過程往往需要幾十年甚至上百年時間，遠遠不能滿足臨床用藥需求，因此人工結香技術得到迅速發展。根據結香誘導物質的不同，人工結香技術主要分為三大類：物理法（砍傷法、打釘法和鑿洞法）、生物法和化學法，其中砍傷法作為最古老的人工結香技術，自古以來就得到廣泛應用，并成為現今主要的人工結香技術之一[3-4]。

評價沉香質量的主要參數為揮發性成分、液相特征圖譜、特征組分沉香四醇和醇溶性浸出物含量。2015年版《中國藥典》（一部）對沉香的液相特征圖譜、特征組分沉香四醇、醇溶性浸出物含量作了相關的規定[1]，同時揮發性成分作為沉香發揮藥效的主要成分，其組成和相對含量與沉香藥材的質量直接相關[5]，而目前關于利用揮發性成分、液相特征圖譜和沉香四醇含量評價“砍傷法”所結人工沉香質量的研究尚未見文獻報道。因此，本研究擬通過測定“砍傷法”所結人工沉香的揮發性成分、液相特征圖譜、沉香四醇和醇溶性浸出物含量，對其質量進行評價，以期為砍傷法所結人工沉香的科學種植與采摘提供參考。

1 材料

1.1 儀器

TSQ Quantum XLS系列氣相色譜-質譜（GC-MS）聯用儀及其工作站（美國賽默飛世爾科技有限公司）；1200高效液相色譜（HPLC）儀，包括二極管陣列（DAD）檢測器（美國Agilent公司）。

1.2 試劑

沉香對照品（批號：121222-201203，供鑒定用）、沉香四醇對照品（批號：111980-201501，純度：96.8%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

“砍傷法”所結人工沉香樣品3批，由中山市元一沉香產業投資有限公司利用“砍傷法”生產，并由中山市國林沉香科學研究所所長張小花工程師鑒定，其沉香原植物均為瑞香科沉香屬白木香[Aquilaria sinensis（Lour．）Gilg]。將樣品編號為1～3號，其結香時間分別為5、10、20年。

2 方法與結果

2.1 揮發性成分的分析

2.1.1 GC-MS條件 色譜條件為色譜柱：HP-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣方式：不分流進樣；進樣口溫度：250℃；載氣：99.999%He；柱流量：1.2 mL/min；柱溫：程序升溫（初始溫度40℃，保持1 min；以10℃/min升至190℃，保持1 min；再以2℃/min升至220℃，保持1 min；再以5℃/min升至290℃，保持3 min）；進樣量：1 μL。MS條件為離子源溫度：250 ℃；電離模式：電子轟擊電離；質譜傳輸線溫度：280℃；溶劑延遲時間：3.0 min；掃描方式：全掃描監測掃描（SCAN）；掃描范圍：m/z 30～m/z 500。

2.1.2 揮發性成分的提取 將人工沉香樣品用超純水洗凈、晾干，粉碎后過三號篩，精密稱取0.5 g，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇10 mL，冷浸過夜，超聲（功率：300 W，頻率：40 kHz）50 min，放冷，過濾。濾液置80℃水浴蒸至無醇味，用甲醇溶解并定容至1 mL量瓶中，搖勻，即得。

2.1.3 揮發性成分的分析 將“2.1.2”項下提取的揮發性成分，按照“2.1.1”項下條件進樣測定。通過Thermo Xcalib化學工作站數據分析系統，由峰面積歸一化法計算各成分相對含量。以Nist Ms Search 2.0系統進行檢索，并進行人工譜圖解析。沉香樣品主要揮發性成分及相對含量見表1。

表1 3批樣品的揮發性成分及其相對含量（%%）Tab 1 Volatile ingredients and relative contents of 3 batches of samples（%%）

由表1可知，1號樣品共鑒定出27個化合物，其中芳香族類化合物2個，相對含量0.55%；倍半萜類化合物6個，相對含量16.72%；脂肪酸類化合物6個，相對含量20.47%；色酮類化合物12個，相對含量26.76%。2號樣品共鑒定出29個化合物，其中芳香族類化合物2個，相對含量0.69%；倍半萜類化合物6個，相對含量17.43%；脂肪酸類化合物7個，相對含量14.51%；色酮類化合物13個，相對含量38.90%。3號樣品共鑒定出36個化合物，其中芳香族類化合物5個，相對含量3.16%；倍半萜類化合物6個，相對含量20.37%；脂肪酸類化合物7個，相對含量12.78%；色酮類化合物16個，相對含量39.83%。

2.2 特征圖譜的測定

參照2015年版《中國藥典》（一部）“沉香”項下方法進行測定。

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，15%～20%A；10～19 min，20%～23%A；19～21 min，23%～33%A；21～39 min，33%A；39～40 min，33%～35%A；40～45 min，35%A；45～50 min，95%A；50～60 min，15%A）；流速：0.7 mL/min；檢測波長：252 nm；柱溫：30 ℃，進樣量：10 μL。2.2.2 對照品溶液的制備 稱取沉香對照品（過三號篩）約0.2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入乙醇10 mL，稱定質量，浸泡30 min，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）1 h，放冷，用乙醇補足損失的質量，搖勻，靜置，取上層清液過濾，取濾液，即得。

2.2.3 樣品溶液的制備 稱取3批人工沉香樣品，其余操作同“2.2.2”項下，制得樣品溶液。

2.2.4 樣品的測定 分別精密吸取“2.2.2”“2.2.3”項下溶液各10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄其特征圖譜，結果見圖1。

圖1 HPLC特征圖譜Fig 1 HPLC chromatogram overlays

由圖1可知，沉香對照品共有6個特征峰，與2015年版《中國藥典》（一部）中沉香對照特征圖譜整體相似，表明本研究采用的沉香對照品滿足《中國藥典》中的要求。1號樣品僅顯示出1個特征峰（峰1），不符合《中國藥典》規定；2、3號樣品的6個特征峰與沉香對照品一一對應，且峰1的保留時間約為16.4 min，與沉香對照品中峰1的保留時間基本一致，說明2、3號樣品的特征圖譜符合2015年版《中國藥典》（一部）中“沉香”項的規定。

2.3 沉香四醇的測定

參照2015年版《中國藥典》（一部）“沉香”項下方法進行測定。

2.3.1 對照品溶液的制備 精確稱取沉香四醇對照品，用乙醇配制成質量濃度為1 000 mg/L的對照品貯備液，4℃保存備用。臨用時用乙醇逐級配制為質量濃度分別為20.0、40.0、60.0、100.0、140.0、200.0 mg/L的系列對照品溶液。

2.3.2 系統適用性試驗 精密量取“2.3.1”項下對照品溶液、“2.2.3”項下樣品溶液各10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定。結果，沉香四醇峰理論板數均大于6 000，且峰形良好，保留時間穩定，符合2015年版《中國藥典》（一部）相關規定。

2.3.3 標準曲線的繪制 取“2.3.1”項下系列對照品溶液，按“2.2.1”項下方法進樣測定，以沉香四醇的質量濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸，得回歸方程y＝36.11x－22.20（r＝0.999 8）。結果表明，沉香四醇在質量濃度為20～200 mg/L內線性關系良好。

2.3.4 方法學考察 按照相關要求進行操作。結果，精密度試驗、穩定性試驗、重復性試驗中沉香四醇峰面積的RSD均不大于2%（n＝6），加樣回收率在98.6%～104.7%之間（RSD＝10.3%，n＝9），符合方法學要求。

2.3.5 樣品含量的測定 取人工沉香樣品各3份，按“2.2.3”項方法制備樣品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定。結果，1、2、3號樣品中沉香四醇的含量分別為0.078%、0.155%、0.254%，RSD分別為1.67%、1.95%、1.34%（n＝3）。其中2、3號樣品符合2015年版《中國藥典》（一部）規定的沉香四醇含量不低于0.10%的要求。

2.4 醇溶性浸出物含量的測定

按照2015年版《中國藥典》（四部）中“浸出物測定法（醇溶性浸出物）”測定。取人工沉香樣品各3份，每份約3 g，精密稱定，置于100 mL錐形瓶中，精密加入乙醇50 mL，密塞，稱定質量，靜置1 h后，連接回流冷凝管，于80～85℃加熱至沸騰，并保持微沸1 h。放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱定質量，用乙醇補足，搖勻，用干燥濾器濾過。精密量取濾液25 mL，置于已干燥至恒質量的蒸發皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3 h，再置于干燥器中冷卻30 min，迅速稱定質量。計算醇溶性浸出物的含量（干燥品質量/人工沉香樣品質量×100%）。結果表明，1、2、3號樣品中醇溶性浸出物的含量分別為12.4%、17.4%、20.8%，RSD分別為1.52%、1.03%、1.21%（n＝3），均符合2015年版《中國藥典》（一部）規定的醇溶性浸出物含量不低于10.0%的要求。

3 討論

天然沉香的揮發性成分主要為芳香族類化合物、倍半萜類化合物、脂肪酸類化合物和色酮類化合物等[6-7]，且芳香族類化合物芐基丙酮和倍半萜類化合物白木香醛與沉香的結香機制有關[8-9]，而色酮類化合物沉香四醇是沉香的特征成分[1]。因此，這3個化合物在沉香真偽鑒定中具有極其重要的作用。本試驗中3批“砍傷法”所結人工沉香的揮發性成分主要由芳香族類化合物、倍半萜類化合物、脂肪酸類化合物和色酮類化合物組成，雖然所含各類成分組成和含量存在差異，但均與天然沉香具有相似的揮發性成分，且均含有芐基丙酮、白木香醛和沉香四醇，并隨著結香時間的延長其含量呈增加的趨勢。

由于沉香在白木香植物中的形成是一個長期積累、演變的復雜過程，因此，不同沉香樣品的成分組成及含量都會有所不同。本試驗發現，隨著結香時間的延長，“砍傷法”所結人工沉香的揮發性成分愈加豐富，且芳香族類化合物、倍半萜類化合物和色酮類化合物的含量也隨之增長。芳香族類成分芐基丙酮具有止咳作用，沉香螺旋醇等有活性的倍半萜類成分具有中樞抑制性鎮靜催眠作用和健胃作用，色酮類成分則具有一定的抗癌和抗腫瘤作用[10-12]。這說明結香時間越長，其所結沉香的藥效和質量越好。而白木香植物成分脂肪酸含量的逐步降低，則說明沉香的結香過程就是白木香成分逐漸轉化為沉香成分的過程。

2015年版《中國藥典》（一部）中規定，沉香的液相特征圖譜應呈現6個特征峰，并與沉香對照品特征圖譜整體相似，且沉香四醇和醇溶性浸出物含量須大于0.10%和10.0%[1]。本試驗3批“砍傷法”所結人工沉香中，2、3號樣品的液相特征圖譜、沉香四醇和醇溶性浸出物含量均符合2015年版《中國藥典》（一部）的規定；而1號樣品的醇溶性浸出物含量雖符合規定，但其液相特征圖譜和沉香四醇達不到《中國藥典》的要求。由此可知，“砍傷法”所結人工沉香必須經過一定的結香時間，才能生產出合格的產品。這也符合沉香在白木香植物中積累時間越長、品質越佳的規律。

4 結論

本試驗通過測定3批“砍傷法”所結人工沉香的揮發性成分、液相特征圖譜、沉香四醇和醇溶性浸出物含量，對“砍傷法”所結人工沉香的質量進行了評價。研究結果表明，經過適當的結香時間，“砍傷法”所結人工沉香與天然沉香具有相似的揮發性化學成分，結香10年以上產品的質量符合2015年版《中國藥典》（一部）中“沉香”項下的規定，可以代替天然沉香入藥。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：185-186.

[2] Liu YY，Chen HQ，Yang Y，et al.Whole-tree agarwoodinducing technique：an efficient novel technique forproducing high-quality agarwood in cultivated Aquilaria sinensis trees[J].Molecules，2013，18（3）：3086-3106.

[3] 黃俊卿，魏建和，張爭，等.沉香結香方法的歷史記載、現代研究及通體結香技術[J].中國中藥雜志，2013，38（3）：302-306.

[4] 陳曉穎，高英，李衛民，等.不同結香方法與國產沉香揮發性化學成分的相關性研究[J].中國藥房，2012，23（11）：1017-1020.

[5] 郝蘭芳，李慧芬，周燁.沉香揮發油化學成分分析[J].中草藥，2010，41（2）：210-211.

[6] Chen HQ，Wei JH，Yang JS，et al.Chemical constituents of agarwood originating from the endemic genus Aquilaria plants[J].Chemistry&Biocliversity，2012，9（2）：236-250.

[7] 譚麗杰.中藥沉香研究進展[J].中國藥房，2011，22（39）：3738-3741.

[8] 高曉霞，周偉平，鐘兆健，等.沉香中芐基丙酮與浸出物含量相關性研究[J].中藥材，2012，35（6）：919-924.

[9] 戚樹源，陸碧瑤，朱亮鋒，等.白木香中白木香醛形成的研究：簡報[J].植物生理學通訊，1992，28（5）：336-339.

[10] 李紅念，梅全喜，林煥澤，等.沉香的化學成分、藥理作用和臨床應用研究進展[J].中國藥房，2011，22（35）：3349-3351.

[11] Liu J，Wu J，Zhao YX，et al.A new cytotoxic 2-（2-phenylethyl）chromone from Chinese eaglewood[J].Chinese Chem Lett，2008，19（8）：934-936.

[12] Yang L，Qiao LR，Xie D，et al.2-（2-phenylethyl）chromoneS from Chineseeaglewood[J].Phytochemistry，2012，76（12）：92-97.

Quality Assessment of Artificial Aquilaria sinensis by“Cutting Inducing Technique”

LI Haoyang，YANG Fang，LIU Qiongyu，ZHANG Xianchen（Inspection and Quarantine Technology Center，Zhongshan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Guangdong Zhongshan 528400，China）

OBJECTIVE：To conduct the quality assessment of artificial Aquilaria sinensis by“cutting inducing technique”，and provide reference for its scientific planting and harvest.METHODS：GC-MC and HPLC were adopted to detect the volatile ingredients，characteristic spectrum，incense tetraol and alcohol-soluble extract contents in 3 batches of artificial A.sinensis（Num.1，2，3，respectively for 5，10，20 years）by“cutting inducing technique”.RESULTS：The volatile ingredients of 3 batches of artificial A.sinensis mainly consisted of aromatic compounds，sesquiterpene compounds，fatty acid compounds and chromone compounds.The characteristic spectrums of samples 2，3 were basically the same with the reference substance of A.sinensis.The incense tetraol contents of 3 batches of samples were 0.078%-0.254%，and alcohol-soluble extract contents were 12.4%-20.8%.The characteristic spectrum and the incense tetraol content of sample 1 were not conformed to the standards in Chinese Pharmacopoeia（2015 edition，part 1）.CONCLUSIONS：Artificial A.sinensis by“cutting inducing technique”shows similar volatile ingredients to natural A.sinensis.The quality of artificial A.sinensis for more than 10 years is conformed to the standards in Chinese Pharmacopoeia（2015 edition，part 1），which can be used as medicine，replacing the natural A.sinensis.

Cutting inducing technique；Artificial Aquilaria sinensis；Quality assessment；GC-MS；HPLC

R282.5

A

1001-0408（2017）28-3996-04

2017-01-20

2017-07-30）

（編輯：劉明偉）

中山市科技計劃項目（No.2014A2FC241）

＊工程師。研究方向：中藥質量控制與評價。電話：0760-88887380。E-mail：13590719076@139.com

#通信作者：高級工程師。研究方向：中藥質量控制與評價。電話：0760-88887380。E-mail：496758046@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.28.29