星點設計-響應面法優(yōu)化氯諾昔康納米結構脂質載體處方Δ

高珊珊，李寧，田寶成，呂青志，史亞楠，李珂珂（濱州醫(yī)學院藥學院，山東煙臺264003）

星點設計-響應面法優(yōu)化氯諾昔康納米結構脂質載體處方Δ

高珊珊＊，李寧，田寶成，呂青志，史亞楠，李珂珂#（濱州醫(yī)學院藥學院，山東煙臺264003）

目的：優(yōu)化氯諾昔康納米結構脂質載體（LN-NLC）處方。方法：采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備LN-NLC，以藥脂比、大豆磷脂用量、液脂比（液態(tài)脂質占總脂質比例）、乳化劑用量為因素，以粒徑、Zeta電位、包封率為指標計算總評歸一值作為綜合指標，通過星點設計-響應面法優(yōu)化處方，并考察所制LN-NLC的外觀形態(tài)和穩(wěn)定性。結果：最優(yōu)處方為藥脂比1∶50，大豆磷脂用量162.5 mg，液脂比25%，乳化劑用量958.2 mg。所制LN-NLC的粒徑為（96.9±3.3）nm、Zeta電位為（－16.1±0.3）mV、包封率為（60.1±0.9）%（n＝3），與預測值的相對誤差分別為2.47%、－4.55%、－0.17%；LN-NLC呈圓球形，4℃下密封保存30 d后粒徑和Zeta電位無明顯變化，包封率僅降低了1.2%。結論：成功優(yōu)化LN-NLC處方，所制LN-NLC穩(wěn)定性良好。

星點設計-響應面法；氯諾昔康；納米結構脂質載體；穩(wěn)定性

氯諾昔康（Lornoxicam，LN）屬昔康類非甾體抗炎藥，具有較強的鎮(zhèn)痛、抗炎作用，臨床用于治療各種急慢性疼痛和風濕性疾病引起的關節(jié)疼痛和炎癥[1]。目前上市劑型有片劑和注射劑，但片劑易引起胃痛、惡心、腹瀉、血清尿素氮和肌酐升高及肝功能異常等不良反應，個別患者可出現(xiàn)胃潰瘍、胃穿孔、消化道出血，且首關效應明顯；注射劑給藥不方便，安全性、依從性不佳。經(jīng)皮給藥可克服藥物的肝臟首關效應，安全性、依從性好，同時可增大藥物在靶組織（如肌肉、肌鍵、鍵鞘、關節(jié)等）的濃度。目前已有LN透皮貼劑、普朗尼克磷脂有機凝膠劑、類脂囊泡凝膠劑、醇質體凝膠劑的初步研究[2-5]。

納米結構脂質載體（Nanostructured lipid carriers，NLC）是在固體脂質納米粒（SLN）的基礎上逐漸發(fā)展起來的以一定比例的液態(tài)油或混合脂質代替固體脂質而得到的納米微粒。NLC作為經(jīng)皮給藥系統(tǒng)載體的主要優(yōu)點是具有較高的載藥量；可避免藥物的泄漏及降解，增強制劑和藥物的穩(wěn)定性；粒徑小，可增強皮膚水合作用，使活性物質更易通過皮膚滲透屏障；對皮膚的刺激和毒性較低；可控制藥物釋放[6]。這些優(yōu)勢使得NLC在經(jīng)皮給藥領域應用前景廣闊[7-8]。本文以NLC作為藥物載體，采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備LN-NLC，運用星點設計（Central composite design）-響應面法（Response surface method）[9]優(yōu)化處方，并評價其質量。

1 材料

1.1 儀器

TU-1901型紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；JEOL100CX-Ⅱ型透射電子顯微鏡（日本電子光學公司）；Zetasizer Nano ZS型納米粒度、Zeta電位和絕對分子量分析儀（英國馬爾文公司）。

1.2 藥品與試劑

大豆磷脂（上海太偉藥業(yè)有限公司，批號：20101012）；LN原料藥（常州市湖濱醫(yī)藥原料有限公司，批號：20100501，純度：99.3%）；LN對照品（揚州制藥有限公司，批號：20081001，純度：99.63%）；聚山梨酯80、硬脂酸甘油酯（國藥集團工業(yè)股份有限公司）；辛酸癸酸甘油三酯（法國Gattefosse公司）；泊洛沙姆188（P188，德國Basf公司，批號：WPC1514B）；其余試劑均為市售分析純，水為蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 LN-NLC的制備

采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備LN-NLC。稱定LN原料藥7.5 mg及處方量的硬脂酸甘油酯、大豆磷脂、聚山梨酯80、辛酸癸酸甘油三酯，加入甲醇3 mL，加熱至70℃，作為油相。將處方量P188溶于30 mL水中，加熱至70℃，作為水相。以3 mL/min的速度將水相注入油相中，以600 r/min轉速攪拌40 min后，冰浴1 h，即得LN-NLC混懸液。取適量LN-NLC混懸液，以葡萄糖為凍干保護劑，進行冷凍干燥，得到LN-NLC凍干粉。

2.2 包封率的測定

2.2.1 對照品溶液的制備 稱取LN對照品5.0 mg，置于100 mL量瓶中，加入pH 7.4的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）制成50 mg/L的對照品溶液。

2.2.2 方法學考察 采用紫外分光光度法測定，在378 nm波長處測定LN的吸光度（A）。按方法學相關要求進行考察。以A對質量濃度（c）進行回歸分析，得回歸方程A＝0.048 4c－0.003 6（r＝0.999 9），LN檢測質量濃度的線性范圍為2.5～17.5 mg/L；5、10、15 mg/L的LN對照品溶液的日內RSD分別為0.13%、0.03%、0.07%（n＝5），日間RSD分別為1.22%、1.19%、1.55%（n＝5），回收率分別為（98.26±0.68）%、（98.32±0.73）%、（98.97±0.49）%[RSD分別為0.69%、0.74%、0.50%（n＝3）]；10 mg/L的LN對照品溶液12 h內穩(wěn)定性試驗的RSD為1.03%（n＝7），重復性試驗的RSD為0.73%（n＝5）。

2.2.3 包封率的測定 吸取“2.1”項下制備的LN-NLC混懸液1 mL，用pH 7.4的PBS稀釋后置于超濾管（截留分子量：10 000）中，于4 ℃下6 000 r/min（離心半徑：107 mm）離心20 min，采用紫外-可見分光光度計在378 nm波長處測定下層水相中LN的吸光度，計算含量，即得游離藥物量。另取制得的LN-NLC混懸液適量，置于10 mL量瓶中，用甲醇破乳并稀釋至刻度，同法測得藥物總量。計算包封率，包封率＝（藥物總量－游離藥物量）/藥物總量×100%[10]。

2.3 粒徑及Zeta電位的測定

將樣品分別置于粒徑比色皿和Zeta電位池中，通過Zetasizer Nano ZS型納米粒度、Zeta電位和絕對分子量分析儀測定其粒徑和Zeta電位。

2.4 星點設計-響應面法優(yōu)化LN-NLC的處方

2.4.1 星點設計 單因素試驗結果表明，液脂比（液態(tài)脂質占總脂質比例）為10%～30%，藥脂比（m/m）為1∶20～1∶80，大豆磷脂用量為 50～200 mg，聚山梨酯80-P188比例為3∶1，乳化劑用量為600～1 800 mg范圍內所制備的LN-NLC的平均粒徑在130 nm以內且分布較窄，Zeta電位絕對值、包封率均較高。在此基礎上，參考文獻[10-12]，以液脂比（X1，%）、藥脂比（X2）、大豆磷脂用量（X3，mg）、乳化劑用量（X4，mg）作為因素，根據(jù)星點設計原理，每個因素設定5個水平，以平均粒徑（Y1）、Zeta電位（Y2）、包封率（Y3）為指標計算總評歸一值（Overall desirability，OD）（Y4），作為綜合指標進行處方優(yōu)化。因素與水平見表1。均數(shù)，得OD[11]。公式如下：式中n為指標數(shù)。對于取值越大越好的指標（如包封率），計算公式如下：dimax＝（Yi－Ymin）/（Ymax－Ymin），式中Yi為實測值，Ymax和Ymin分別為各評價指標可接受的最大及最小值。當Yi≥Ymax時，將di設為 1；反之，Yi＜Ymin時設為 0。對于取值越小越好的指標（如粒徑、Zeta電位），計算公式如下：dimin＝（Ymax－Yi）/（Ymax－Ymin）。當Yi＞Ymax時，di＝0；反之，Yi≤Ymin時，di＝1。粒徑、Zeta電位、包封率的取值范圍分別為：70～130 nm、－25～0 mV、50%～70%。根據(jù)公式計算出各指標di后，計算OD值。星點設計與結果見表2。2.4.3 模型擬合 根據(jù)表2結果，采用Design Expert 8.0.6軟件，以Y4為因變量，將X1、X2、X3、X4（自變量）對Y4進行二項式方程擬合，得二項式擬合方程為Y4＝1.074－0.029 32X1+22.32X2－4.738×10－3X3－1.052×10－3X4－0.085 02X1X2+1.987×10－4X1X3－2.483×10－5X1X4－0.112 5X2X3+0.034 76X2X4－2.175×10－7X3X4+9.684×10－4X12－861.1X22+2.371×10－5X32+3.271×10－7X42（R2＝0.925 2，P＜0.000 1）。對該模型進行方差分析，結果見表3。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

由表3可知，回歸模型的P＜0.000 1，具有極顯著性。失擬項P＞0.05，表明差異無統(tǒng)計學意義，說明數(shù)據(jù)中沒有異常點。X1、X1X2、X3X4和X12對 Y4的影響不顯著，

2.4.2 數(shù)據(jù)處理 以Y1、Y2、Y3為因變量，X1、X2、X3、X4為自變量，將各個指標按照優(yōu)選條件均標準化為0～1.0之間的歸一值（Desirability），對各指標歸一值求算幾何平可以舍去。采用Design Expert 8.0.6軟件進行分析，新生成二項式擬合方程為Y4＝0.803 3+23.08X2－4.816 49×10－3X3－1.051×10－3X4+2.204×10－4X1X3－2.159×10－5X1X4－0.112 5X2X3+0.034 76X2X4－900.4X22+2.125×10－5X32+2.886×10－7X42（R2＝0.904 2，P＜0.000 1）。模型的一次項X2、X3、X4及二次項 X2X4、X22對 Y4的影響極顯著，X1X3、X1X4、X2X3、X32、X42的影響達到顯著水平。

表2 星點設計與結果Tab 2 Central composite design and results

表3 方差分析結果Tab 3 Results of variance analysis

2.4.4 響應面優(yōu)化與預測 Y4與X1、X2、X3、X4的響應面圖見圖1。

圖1 Y4與X1、X2、X3、X4的響應面圖Fig 1 Response surface plot of Y4and X1，X2，X3，X4

由圖1A可知，在X2為1∶32、X4為1 200 mg時，隨著X1及X3的增加，Y4逐漸增大；由圖1B可知，在X1為20%、X4為1 200 mg時，隨著X2的增大，Y4有先增大后減小的趨勢。因此，可求得Y4最高時的各因素取值，結果最優(yōu)處方如下：X1為 25%，X2為 1 ∶50，X3為 162.5 mg，X4為958.2 mg。

2.4.5 處方驗證 將各因素最佳水平代入二項式擬合模型，求得各指標最佳預測值；并根據(jù)最優(yōu)處方，按照“2.1”項下方法制備LN-NLC，測定其粒徑、Zeta電位和包封率。結果，粒徑的預測值為99.35 nm，Zeta電位的預測值為－15.4 mV，包封率的預測值為60%；所制LN-NLC的粒徑的實測值為（96.9±3.3）nm，Zeta電位的實測值為（－16.1±0.3）mV，包封率的實測值為（60.1±0.9）%（n＝3），與預測值的相對誤差分別為2.47%、－4.55%、－0.17%。各指標相對誤差的絕對值均小于5%，說明本試驗所建立的模型擬合效果、預測性及重現(xiàn)性較好，可用于預測和優(yōu)化LN-NLC處方。LN-NLC的粒徑分布和Zeta電位分布見圖2。

2.5 外觀形態(tài)

通過透射電鏡觀察所制LN-NLC的外觀形態(tài)。結果顯示，LN-NLC呈圓球形。LN-NLC的透射電鏡圖見圖3。

2.6 初步穩(wěn)定性考察

將所制備的3批次LN-NLC凍干粉置于4℃密閉保存30 d，測定其復溶后各指標的變化。結果顯示，粒徑由（189.6±2.1）nm變?yōu)椋?94.3±2.9）nm，Zeta電位由（－17.1±0.3）mV變?yōu)椋ǎ?5.6±0.2）mV，包封率由（61.4±0.6）%變?yōu)椋?0.2±1.1）%。在1個月內，LN-NLC凍干粉的粒徑、Zeta電位均變化不大，其包封率僅降低了1.2%，表明LN-NLC凍干粉在該貯存條件下具有良好的穩(wěn)定性。

圖2 LN-NLC的粒徑分布和Zeta電位分布Fig 2 Distribution of particle size and Zeta potential of LN-NLC

圖3 LN-NLC的透射電鏡圖（×100 000）Fig 3 TEM photograph of LN-NLC（×100 000）

3 討論

由于LN是一種難溶性藥物，因此將LN溶解于含有乳化劑的油相中，采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備LN-NLC。NLC包封率的測定方法有超速離心法、透析法、葡聚糖微柱離心法等。透析法所用時間較長，且需要大量透析介質；采用葡聚糖微柱離心法測定包封率時，由于LN溶解性差，游離藥物較難洗脫。本試驗采用超速離心法測定包封率，具有簡便快速、數(shù)據(jù)精確度高等優(yōu)點[13]。

本研究采用星點設計-響應面法優(yōu)化制劑處方，但LN-NLC受多種因素影響。為保證試驗的最佳條件，首先采用單因素試驗篩選出對LN-NLC質量影響顯著的因素并確定因素水平，以減少試驗次數(shù)和誤差；再進行星點設計，并通過OD值考察各指標的綜合效果。結果表明，乳化劑及大豆磷脂用量、藥脂比、液脂比對LNNLC影響顯著；通過模型擬合與響應面優(yōu)化，能得到最優(yōu)LN-NLC處方。

Zeta電位用于表征膠體分散體系的穩(wěn)定性，本研究中LN-NLC的Zeta電位絕對值在16 mV左右，為避免微粒間發(fā)生聚集，將LN-NLC進行凍干處理。穩(wěn)定性試驗表明，LN-NLC的凍干粉在4℃保存1個月具有較好的穩(wěn)定性。

納米制劑凍干復溶后粒徑會有不同程度的增加[14-15]。LN-NLC混懸液凍干粉復溶后粒徑增加至190 nm左右，筆者用復溶后的樣品進行體外經(jīng)皮滲透試驗，其表現(xiàn)出較好的經(jīng)皮滲透性，此部分內容將另文發(fā)表。

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Formulation Optimization of Nanostructured Lipid Carriers Loaded with Lornoxicam by Central Composite Design-response Surface Method

GAO Shanshan，LI Ning，TIAN Baocheng，LYU Qingzhi，SHI Yanan，LI Keke（College of Pharmacy，Binzhou Medical University，Shandong Yantai 264003，China）

OBJECTIVE：To optimize the formulation of nanostructured lipid carriers loaded with lornoxicam（LN-NLC）.METHODS：Emulsification-solvent evaporation method was used to prepare the LN-NLC.Using drug-lipid ratio，dosage of soy lecithin，liquid-lipid ratio（proportion of liquid lipid to total lipid）and dosage of emulsifier as factors，the overall normalized value was calculated by particle size，Zeta potential and entrapment efficiency as indexes was used as comprehensive index.Central composite design-response surface method was used to optimize the formulation and investigate the appearance and stability of prepared LN-NLC.RESULTS：The optimal formulation were as follows as drug-lipid ratio of 1∶50，dosage of soy lecithin of 162.5 mg，liquid-lipid ratio of 25%and emulsifier dosage of 958.2 mg.The particle size of prepared LN-NLC was（96.9±3.3）nm，Zeta potential was（－16.1±0.3）mV，entrapment efficiency was（60.1±0.9）%（n＝3），which showed relative error of 2.47%，－4.55%，－0.17%with predicted value，respectively.The prepared LN-NLC was spherical.It had no obvious changes in particle size and Zeta potential in sealed storage for 30 d in 4℃，and the entrapment efficiency only declined 1.2%.CONCLUSIONS：The LN-NLC formulation is successfully optimized，and the LN-NLC has good stability.

Central composite design-response surface method；Lornoxicam；Nanostructured lipid carriers；Stability

R943

A

1001-0408（2017）28-3980-04

2016-12-26

2017-02-16）

（編輯：鄒麗娟）

山東省自然科學基金資助項目（No.ZR2014HL104、ZR2014HQ069）；煙臺市科技計劃項目（No.2010326）

＊碩士研究生。研究方向：藥物新劑型與新技術。電話：0535-6913406。E-mail：fly1991s@163.com

#通信作者：副教授，碩士。研究方向：藥物新劑型與新技術。電話：0535-6913406。E-mail：like_tju@aliyun.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.28.25