驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊中紫鉚素對(duì)人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT增殖及細(xì)胞分泌因子的影響Δ

王志杰，高莉，霍仕霞，譚雪，羅靜鶯，閆明#（1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆石河子83003；.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所/新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830049）

驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊中紫鉚素對(duì)人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT增殖及細(xì)胞分泌因子的影響Δ

王志杰1＊，高莉2，霍仕霞2，譚雪2，羅靜鶯2，閆明2#（1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆石河子832003；2.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所/新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830049）

目的：研究驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊（VW）中紫鉚素對(duì)人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT的增殖及細(xì)胞分泌因子的影響，初步探討VW中紫鉚素治療白癜風(fēng)的機(jī)制。方法：采用MTT法測(cè)定0（空白對(duì)照）、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 μg/mL紫鉚素作用于HaCaT細(xì)胞48 h后的細(xì)胞存活率；采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定0.5、1.0、5.0 μg/mL紫鉚素作用于HaCaT細(xì)胞48 h后培養(yǎng)液中細(xì)胞分泌因子內(nèi)皮素1（ET-1）、ET-3、黑素細(xì)胞刺激素（MSH）、干細(xì)胞因子（SCF）、堿性纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）的含量。結(jié)果：與空白對(duì)照比較，0.1～5.0 μg/mL紫鉚素作用48 h后細(xì)胞存活率均有不同程度升高，而10.0 μg/mL紫鉚素作用后細(xì)胞存活率降低；0.5、1.0、5.0 μg/mL紫鉚素作用48 h后培養(yǎng)液中ET-1、SCF、bFGF含量均顯著增加（P＜0.01），1.0、5.0 μg/mL紫鉚素作用48 h后培養(yǎng)液中ET-3、MSH含量顯著增加（P＜0.01）。結(jié)論：紫鉚素可促進(jìn)HaCaT細(xì)胞的增殖，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)細(xì)胞分泌因子ET-1、ET-3、MSH、SCF、bFGF的分泌有關(guān)。

驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊；紫鉚素；人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞；增殖；細(xì)胞因子

驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊[Vernonia anthelmintica（L.）Willd]為菊科（Compositae）斑鳩菊屬一年生草本植物[1]，可用于治療痰飲浮腫、濕痹疼痛、腸內(nèi)寄生蟲(chóng)、白癜風(fēng)等[2]。白癜風(fēng)白斑的形成主要有兩種機(jī)制：一種是黑素合成能力下降或因傳輸障礙使其不能傳輸?shù)街車(chē)琴|(zhì)細(xì)胞；另一種是黑素細(xì)胞部分或全部缺失[3]。臨床研究結(jié)果表明，驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊注射液、復(fù)方驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊搽劑均對(duì)白癜風(fēng)有較好的療效[4-5]，但具體的藥效成分及作用機(jī)制不明。有研究驗(yàn)證實(shí)，驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊中紫鉚素可以使黑素細(xì)胞增殖并促進(jìn)黑素合成，具有抗白癜風(fēng)的作用[6-7]。角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞是人表皮中兩種重要的組成細(xì)胞，其在結(jié)構(gòu)和功能上有密切的聯(lián)系[8]。角質(zhì)形成細(xì)胞可通過(guò)分泌一些生長(zhǎng)因子或者細(xì)胞基質(zhì)成分，直接或間接地對(duì)黑素細(xì)胞的增殖、黑素合成和轉(zhuǎn)運(yùn)等活動(dòng)進(jìn)行調(diào)節(jié)[9]。本研究擬考察驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊中紫鉚素對(duì)人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT的增殖以及細(xì)胞分泌因子的影響，初步探討驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊中紫鉚素治療白癜風(fēng)的藥理作用機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

Bm-37xay倒置顯微鏡（上海光學(xué)儀器六廠）；1510全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；SQP電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）。

1.2 藥品與試劑

紫鉚素（新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所自制[7]，批號(hào)：20151208，純度：≥98%）；DMEM干粉培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（美國(guó)HycLone公司）；黑素細(xì)胞刺激素（MSH）、干細(xì)胞因子（SCF）、堿性纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、內(nèi)皮素1（ET-1）、ET-3酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司，批號(hào)：GR201609-1）；MTT（美國(guó)Amresco公司）；二甲基亞砜（DMSO，天津市光復(fù)化工研究所）；其余試劑均為分析純。

1.3 細(xì)胞

人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢大學(xué)細(xì)胞庫(kù)）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

復(fù)蘇HaCaT細(xì)胞后，加入含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液在37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后更換新鮮的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)、傳代。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖活性

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用1.0 mL 0.25%胰酶消化制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104mL－1，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種100 μL。將細(xì)胞置于37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜。然后棄培養(yǎng)基，依次加入終質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 μg/mL的紫鉚素含藥培養(yǎng)液，200 μL/孔，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)8個(gè)復(fù)孔；同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，每孔加入等體積的DEME完全培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，于結(jié)束前4 h，每孔加入20 μL 5 g/L的MTT溶液，棄上清液，加入DMSO 200 μL/孔，振蕩10 min，使結(jié)晶完全溶解。采用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率（%）＝加藥孔OD值/空白對(duì)照孔OD值×100%。

2.3 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞分泌因子水平

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用適量的0.25%胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104mL－1，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，500 μL/孔。將細(xì)胞置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)過(guò)夜，然后依次加入終質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、5.0 μg/mL的紫鉚素含藥培養(yǎng)液，500 μL/孔，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)8個(gè)復(fù)孔；同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，每孔加入等體積的DEME完全培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，將培養(yǎng)板每孔中的培養(yǎng)液分別移至EP管中，采用ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液上清液中細(xì)胞分泌因子ET-1、ET-3、MSH、SCF、bFGF的含量，具體操作嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 紫鉚素對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖活性的影響結(jié)果

與空白對(duì)照比較，0.1 μg/mL紫鉚素對(duì)細(xì)胞增殖的影響不明顯；10.0 μg/mL紫鉚素對(duì)細(xì)胞增殖有抑制作用；0.5、1.0、5.0 μg/mL紫鉚素對(duì)細(xì)胞增殖有明顯的促進(jìn)作用，可明顯升高細(xì)胞存活率，OD值明顯增加（P＜0.05），結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同質(zhì)量濃度紫鉚素對(duì)細(xì)胞存活率的影響Tab 1 Effect of different mass concentration butin on survival rate of cells

3.2 紫鉚素對(duì)HaCaT細(xì)胞ET-1、ET-3分泌的影響結(jié)果

與空白對(duì)照比較，0.5、1.0、5.0 μg/mL 的紫鉚素與細(xì)胞共孵育48 h后，培養(yǎng)液中ET-1含量顯著增加（P＜0.01）；1.0、5.0 μg/mL紫鉚素與細(xì)胞共孵育48 h后，細(xì)胞培養(yǎng)液中ET-3含量顯著增加（P＜0.01），結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同質(zhì)量濃度紫鉚素對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中ET-1、ET-3含量的影響（±s，n＝8，pg/mL）Tab 2 Effects of different mass concentration butin on the contents of ET-1，ET-3 in cell culture medium（±s，n＝8，pg/mL）

表2 不同質(zhì)量濃度紫鉚素對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中ET-1、ET-3含量的影響（±s，n＝8，pg/mL）Tab 2 Effects of different mass concentration butin on the contents of ET-1，ET-3 in cell culture medium（±s，n＝8，pg/mL）

注：與空白對(duì)照比較，＊＊P＜0.01Note：vs.blank control，＊＊P＜0.01

紫鉚素質(zhì)量濃度，μg/mL 0（空白對(duì)照）0.5 1.0 5.0 ET-3 8.93±1.34 11.16±1.93 18.46±2.36＊＊28.16±1.01＊＊ET-1 67.62±19.03 104.09±15.80＊＊131.63±32.03＊＊217.72±29.21＊＊

3.3 紫鉚素對(duì)HaCaT細(xì)胞分泌SCF、bFGF、MSH的影響結(jié)果

與空白對(duì)照比較，紫鉚素作用48 h后細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞分泌因子SCF、bFGF、MSH的含量均有所增加；其中0.5、1.0、5.0 μg/mL紫鉚素孔細(xì)胞培養(yǎng)液中 SCF、bFGF含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），1.0、5.0 μg/mL 紫鉚素孔細(xì)胞培養(yǎng)液中MSH的含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同質(zhì)量濃度紫鉚素對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中SCF、bFGF、MSH含量的影響（±s，n＝8，pg/mL）Tab 3 Effects of different mass concentration butin on the contents of SCF，bFGF，MSH in culture medium（±s，n＝8，pg/mL）

表3 不同質(zhì)量濃度紫鉚素對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中SCF、bFGF、MSH含量的影響（±s，n＝8，pg/mL）Tab 3 Effects of different mass concentration butin on the contents of SCF，bFGF，MSH in culture medium（±s，n＝8，pg/mL）

注：與空白對(duì)照比較，＊＊P＜0.01Note：vs.blank control，＊＊P＜0.01

紫鉚素質(zhì)量濃度，μg/mL 0（空白對(duì)照）0.5 1.0 5.0 MSH 690.47±65.35 693.44±60.49 959.74±66.98＊＊788.48±66.28＊＊SCF 50.30±8.64 70.56±11.26＊＊76.12±7.16＊＊107.16±11.42＊＊bFGF 88.47±14.35 141.90±19.31＊＊186.05±18.21＊＊126.28±18.93＊＊

4 討論

由于本研究是初步探討紫鉚素對(duì)人角質(zhì)形成永生化細(xì)胞增殖的影響，從角質(zhì)細(xì)胞可通過(guò)自分泌和旁分泌多種細(xì)胞分泌因子而影響黑素細(xì)胞的增殖及黑素合成的角度展開(kāi)研究，目的是考察紫鉚素是否能夠通過(guò)促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞增殖及細(xì)胞分泌因子而激活黑素細(xì)胞，并不是進(jìn)行藥物藥效的研究。故在本研究中沒(méi)有進(jìn)行量效關(guān)系的考察，給藥濃度是按照倍數(shù)來(lái)設(shè)計(jì)，即以0.5 μg/mL為基數(shù)，給藥濃度分別是0.5 μg/mL的2、5、10倍。白癜風(fēng)是一種常見(jiàn)的由黑素細(xì)胞被選擇性破壞而引起的皮膚色素脫失性疾病，受到內(nèi)外因素的影響。黑素細(xì)胞在生長(zhǎng)、分化、增殖、遷移、凋亡等過(guò)程中某一個(gè)或者幾個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常，將導(dǎo)致黑素形成和沉著異常，發(fā)生色素障礙性疾病。雖然白癜風(fēng)病因尚不明確，但有組織病理學(xué)表明，白癜風(fēng)皮損處缺乏黑素細(xì)胞[10]。

ET-1、ET-3是角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的重要細(xì)胞因子之一，在白癜風(fēng)發(fā)病中起重要作用，皮膚內(nèi)的ET-1、ET-3升高會(huì)促使黑素細(xì)胞的游離及分裂增殖，從而促使白斑區(qū)的恢復(fù)。MSH可促進(jìn)黑素細(xì)胞增殖、產(chǎn)生黑素小體以及通過(guò)小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)黑素細(xì)胞分化，引起皮膚色素沉著。SCF對(duì)小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子MITF具有重要的調(diào)控作用，而黑素合成酶和黑素合成受黑素細(xì)胞特異性MITF基因的調(diào)控[11]。皮膚內(nèi)的SCF上調(diào)會(huì)使SCF信號(hào)傳導(dǎo)途徑達(dá)到正常發(fā)揮作用的水平，使黑素細(xì)胞的生物學(xué)功能趨于正常，從而使白斑區(qū)復(fù)色[12]。bFGF作為一種具有多種生物效應(yīng)的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，其可以促進(jìn)黑素細(xì)胞的生長(zhǎng)以及調(diào)整黑素的量，恢復(fù)皮損區(qū)的黑素細(xì)胞，使皮膚恢復(fù)正常的外觀和功能，從而達(dá)到治療白癜風(fēng)的目的[13]。本研究結(jié)果顯示，紫鉚素能夠促進(jìn)HaCaT細(xì)胞的增殖及細(xì)胞分泌因子ET-1、ET-3、MSH、SCF、bFGF的分泌。

綜上所述，紫鉚素抗白癜風(fēng)的作用機(jī)制可能與其促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖以及細(xì)胞分泌因子ET-1、ET-3、SCF、bFGF、MSH的分泌，從而促進(jìn)黑素細(xì)胞色素合成有關(guān)，但其更多的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Effects of Butin in Vernohia anthelmintica on Proliferation of Human Immortal Keratinocyte Cell Strain HaCaT and Cell Secretory Factors

WANG Zhijie1，GAO Li2，HUO Shixia2，TAN Xue2，LUO Jingying2，YAN Ming2（1.College of Pharmacy，Shihezi University，Xinjiang Shihezi 832003，China；2.Xinjiang Institute of Traditional Uighur Medicine/Xinjiang Laboratory of Uighur Medical Prescription，Urmuqi 830049，China）

OBJECTIVE：To study the effects of butin in Vernohia anthelmintica（VW）on proliferation of human immortal keratinocyte cell strain HaCaT and cell secretory factors，and explore the mechanism of butin in VW in the treatment of vitiligo.METHODS：MTT method was used to determine the survival rate of HaCaT cells cultured by 0（blank control），0.1，0.5，1.0，5.0，10.0 μg/mL of butin for 48 h.Enzyme-linked immunosorbent assay was used to determine the contents of cell secretory factors as endothelin 1（ET-1），ET-3，melanocyte stimulating hormone（MSH），stem cell factor（SCF），basic fibroblast growth factor（bFGF）in culture medium after HaCaT cells were cultured by 0.5，1.0，5.0 μg/mL of butin for 48 h.RESULTS：Compared with blank control，cell survival rate was increased to varying degrees after cultured by 0.1-5.0 μg/mL of butin for 48 h，while decreased after cultured by 10.0 μg/mL of butin.Contents of ET-1，SCF，bFGF in culture medium were significantly increased after cultured by 0.5，1.0，5.0 μg/mL of butin for 48 h（P＜0.01）；and contents of ET-3，MSH in culture medium were significantly increased after cultured by 1.0，5.0 μg/mL of butin for 48 h（P＜0.01）.CONCLUSIONS：Butin can promote the proliferation of HaCaT cells，the mechanism may be associated with promoting the secretion of cell secretory factors of ET-1，ET-3，MSH，SCF，bFGF.

Vernohia anthelmintica；Butin；Human immortal keratinocyte cell strain HaCaT；Proliferation；Cell factors

R751.05

A

1001-0408（2017）28-3904-03

2017-03-17

2017-07-19）
（編輯：林 靜）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81260689）

＊碩士研究生。研究方向：藥物分析、新藥研發(fā)。E-mail：1542658051@qq.com

#通信作者：研究員，碩士。研究方向：藥物分析、新藥研發(fā)。E-mail：yanming21cn@sohu.cn.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.28.05