JNK/FOXO3信號(hào)通路介導(dǎo)黃連素促人肺腺癌PC-9細(xì)胞凋亡的研究

劉紅崗 賴遠(yuǎn)陽(yáng) 朱以芳 同李平 董小平 許娟 張勇 郭海華 李小飛 閆小龍

JNK/FOXO3信號(hào)通路介導(dǎo)黃連素促人肺腺癌PC-9細(xì)胞凋亡的研究

劉紅崗 賴遠(yuǎn)陽(yáng) 朱以芳 同李平 董小平 許娟 張勇 郭海華 李小飛 閆小龍

目的：探討黃連素（berberine，Ber）誘導(dǎo)肺腺癌PC-9細(xì)胞凋亡及c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）/轉(zhuǎn)錄因子叉頭蛋白3（forkhead box protein O3，F(xiàn)OXO3）信號(hào)通路的作用機(jī)制。方法：實(shí)驗(yàn)采用完全隨機(jī)化的分組方法，分為對(duì)照組、Ber組（30、60 μM），分別檢測(cè)各組PC-9細(xì)胞活力值、凋亡率、ROS含量、caspase 3活性、線粒體膜電位，以及JNK/FOXO3通路和凋亡相關(guān)蛋白含量的變化。SP600125特異性抑制JNK（磷酸化）激活后，Ber（0、60 μM）處理細(xì)胞24 h，重復(fù)上述檢測(cè)。結(jié)果：Ber有效抑制PC-9細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡（P＜0.05），顯著降低PC-9細(xì)胞線粒體膜電位，增加ROS含量和caspase 3活性（P＜0.05），并呈濃度依賴效應(yīng)；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示Ber上調(diào)p-JNK、FOXO3和Bax的含量（P＜0.05），下調(diào)p-FOXO3和Bcl-2的含量（P＜0.05）；SP600125特異性抑制JNK激活后，拮抗Ber下調(diào)p-FOXO3含量及其促PC-9細(xì)胞凋亡作用（P＜0.05）。結(jié)論：Ber可有效抑制肺腺癌PC-9細(xì)胞活力、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷，作用機(jī)制可能與上調(diào)p-JNK、FOXO3含量和抑制FOXO3磷酸化有關(guān)。

黃連素 肺腺癌 PC-9 JNK FOXO3 凋亡

AbstractObjective:To investigate the pro-apoptotic effect of berberine(Ber)on human lung adenocarcinoma PC-9 cell line,and to detect the role of c-Jun N-terminal kinase(JNK)/forkhead box protein O3(FOXO3)signaling in this process.Methods:The PC-9 cells were randomly divided into the control group and the Ber group,which was treated with 30 and 60 μM Ber.The survival rate,apoptotic rate,ROS generation,caspase-3 activity,and mitochondrial membrane potential of cells were detected.Western blot was performed to detect the expression of JNK/FOXO3 signaling and apoptosis-related proteins.A JNK-specific activation inhibitor,SP600125,was used to block the phosphorylation of FOXO3 in PC-9 cells,and then treated with Ber(30 and 60 μM)for further detection after 24 h.Results:Ber treatment resulted in an obvious reduction in cell viability,promotion of cell apoptosis,downregulation of mitochondrial membrane potential,and an increase of ROS and caspase-3 in a dose-dependent manner.Western blot analysis demonstrated that Ber treatment resulted in a significant upregulation of p-JNK,FOXO3,and Bax expression,and a downregulation of p-FOXO3 and Bcl2 levels.Moreover,the inhibition of JNK activation by SP600125 antagonized the anti-FOXO3 phosphorylation role and the pro-apoptotic role of Ber on PC-9 cells.Conclusion:Ber treatment effectively inhibits the viability of PC-9 cells and enhances apoptosis and oxidative stress injury,which may be related to the upregulation of p-JNK and FOXO3 and the downregulation of p-FOXO3.

Keywords:berberine,lung adenocarcinoma,PC-9,JNK,FOXO3,apoptosis

黃連素又稱小檗堿（berberine，Ber），是從毛莨科植物黃連等中藥中提取的異喹啉類生物堿［1-2］，具有抗乳腺癌、肺癌及胃腸道腫瘤等作用，其機(jī)制與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制增殖等相關(guān)［2-4］。轉(zhuǎn)錄因子叉頭蛋白3（forkhead box protein O3，F(xiàn)OXO3）作為抑癌因子參與抑制乳腺癌、肺癌等多種腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［5-6］。c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員之一，持續(xù)活化（磷酸化）的JNK可以激活Bcl-2超家族（Bax、Bim、BAD），抑制FOXOs超家族磷酸化后出核降解，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［7-8］。研究發(fā)現(xiàn)Ber可激活FOXO3促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡［9］，激活JNK促進(jìn)乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞凋亡［10］。然而，Ber在肺腺癌中的作用機(jī)制尚未明確。本研究觀察Ber對(duì)肺腺癌PC-9細(xì)胞活力、凋亡及JNK/FOXO3通路的影響，研究JNK/FOXO3信號(hào)通路是否參與Ber誘導(dǎo)的PC-9細(xì)胞凋亡過(guò)程，為拓展Ber及靶向JNK/FOXO3信號(hào)通路抗肺腺癌提供理論基礎(chǔ)。

作者單位：空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院胸外科（西安市710038）

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 肺腺癌PC-9細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所細(xì)胞庫(kù)。黃連素（Ber），2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA），二甲基亞砜（DMSO），噻唑藍(lán)（MTT）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。JNK，p-JNK（Thr183/Tyr185），F(xiàn)OXO3，p-FOXO3；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2），Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）和β-肌動(dòng)蛋白（βactin）抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。JNK抑制劑SP600125購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）購(gòu)自江蘇南京碧云天試劑公司。TUNEL檢測(cè)試劑盒購(gòu)自德國(guó)Roche公司。ROS檢測(cè)試劑盒及Caspase-Glo?3/7定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng) PC-9細(xì)胞使用含10%胎牛血清、0.1 mg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2濕化孵箱中。細(xì)胞融合后，使用0.25%胰蛋白酶消化，根據(jù)實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞接種于不同的培養(yǎng)板中。

1.2 方法

1.2.1 噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞活力值 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、Ber（30、60 μM）組、處理24 h組。Ber先以DMSO溶解，使用時(shí)以無(wú)血清DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋，使DMSO濃度低于0.1%，濾菌后4℃保存?zhèn)溆?。以每?×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，各處理24 h后，棄去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次。加入100 μL無(wú)血清的高糖DMEM和10 μL的MTT試劑，37℃孵育4 h后，棄去培養(yǎng)液，加入100 μL的DMSO原液，振蕩15 min，使結(jié)晶完全溶解，用酶標(biāo)儀（波長(zhǎng)為490 nm）測(cè)定其吸光值（OD值），該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞培養(yǎng)于共聚焦皿中，于4℃用4%的多聚甲醛固定15 min。PBS洗滌3次，0.1%的Triton X-100打孔15 min，PBS洗滌1次。嚴(yán)格按照TUNEL法試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作。在共聚焦顯微鏡下觀察，其中凋亡細(xì)胞為綠色熒光，細(xì)胞核為藍(lán)色熒光，隨機(jī)選取10個(gè)視野計(jì)數(shù)，計(jì)算凋亡率。

1.2.3 JC-1染色檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位 細(xì)胞培養(yǎng)3×105個(gè)/L種于共聚焦皿中，進(jìn)行相應(yīng)處理后，加入JC-1染色工作液，細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 min，配置適量JC-1染色緩沖液（1×）放置冰浴，染色結(jié)束后采用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2次，加入細(xì)胞培養(yǎng)液在共聚焦顯微鏡下觀察，其中低線粒體膜電位細(xì)胞為綠色熒光，正常線粒體膜電位細(xì)胞為紅色熒光，隨機(jī)選取10個(gè)視野計(jì)數(shù)，計(jì)算低線粒體膜電位細(xì)胞數(shù)目比值。

1.2.4 caspase 3活性測(cè)定 以每孔3×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，各組細(xì)胞處理結(jié)束后，收集細(xì)胞并裂解提取細(xì)胞蛋白。之后每孔加入100 μL Caspase-Glo⑧3/7工作液和一定量的細(xì)胞裂解液，室溫下避光孵育1 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度（波長(zhǎng)為400～405 nm）。

1.2.5 ROS含量測(cè)定 熒光探針DCFH-DA檢測(cè)ROS水平：根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組處理后將細(xì)胞消化并懸浮于DCFH-DA濃度為20 mol/L的PBS中，CO2培養(yǎng)箱孵育細(xì)胞2 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)其熒光強(qiáng)度（激發(fā)光波長(zhǎng)設(shè)為485 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)設(shè)為530 nm）。酶活性=實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度×100%。

1.2.6 Western blot檢測(cè) 肺腺癌PC-9細(xì)胞在裂解緩沖液中勻漿裂解，以12 000 r/min，離心15 min。收集上清液，根據(jù)蛋白定量試劑盒說(shuō)明測(cè)定蛋白含量，并調(diào)各組蛋白濃度一致。高溫水煮變性冷卻后，蛋白行SDS-聚丙烯凝膠電泳（PAGE）并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，將膜浸入含20%脫脂奶粉的TBST緩沖液，室溫封閉2 h，分別用對(duì)應(yīng)的一抗4℃孵育12 h。洗膜后用對(duì)應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，洗滌3次，最后用電化學(xué)發(fā)光試劑顯影，并用軟件分析蛋白的相對(duì)表達(dá)量（Bio-Rad，West Berkeley，Cal?ifornia，USA），重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞活性檢測(cè)

不同濃度Ber（30、60 μM）處理 PC-9細(xì)胞 24 h后，相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)（圖1A）。可見(jiàn)Ber可使PC-9細(xì)胞變圓、收縮甚至脫落，且Ber濃度越高，變化越明顯。MMT法檢測(cè)各組細(xì)胞活力值的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，相較于對(duì)照組，可見(jiàn)Ber呈濃度依賴有效抑制PC-9細(xì)胞的活力（P＜0.05，圖1B）。

2.2 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

與對(duì)照組相比，不同濃度Ber（24 h）可以有效誘導(dǎo)PC-9細(xì)胞凋亡（P＜0.05），且呈濃度依賴性（圖2）。

圖1 不同濃度Ber處理24 h抑制PC-9細(xì)胞活力Figure 1 Ber treatment inhibited PC-9 cell viability(24h)

圖2 不同濃度Ber處理24 h對(duì)各組細(xì)胞凋亡率的影響Figure 2 Effect of Ber treatment on the apoptosis of PC9 cells(24 h)

2.3 線粒體膜電位JC-1染色、ROS含量及caspase3活性測(cè)定

與對(duì)照組相比，不同濃度Ber（24 h）可以使PC-9細(xì)胞線粒體膜電位降低，ROS含量增加，caspase 3活性升高（P＜0.05），并呈濃度依賴性（圖3）。

2.4 Western blot檢測(cè)

不同濃度Ber處理PC-9細(xì)胞24 h后，提取總蛋白并行Western blot檢測(cè)JNK/FOXO3通路和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，Ber處理組細(xì)胞p-JNK、FOXO3和Bax的表達(dá)量上升，而p-FOXO3和Bcl-2的表達(dá)下降，且Ber濃度越高變化越明顯（P＜0.05），說(shuō)明Ber處理可以激活JNK信號(hào)通路、促進(jìn)FOXO3表達(dá)且抑制FOXO3磷酸化進(jìn)而促進(jìn)PC-9細(xì)胞凋亡（圖4）。

2.5 20 μM SP600125抑制PC-9細(xì)胞JNK磷酸化后各項(xiàng)檢測(cè)

不同處理組（20 μM SP600125，Control，60 μM Ber，20 μM SP600125+60 μM Ber）處理PC-9細(xì)胞24 h后，相比于Control組，PC-9細(xì)胞細(xì)胞活力結(jié)果為（97.651±4.130%，100.000±0.000%，53.654±7.825%，75.611±8.625%，P＜0.05）、caspase3活性檢測(cè)結(jié)果為（98.214±10.690% ，100.000±0.000% ，288.514±27.381%，180.403±24.560%，P＜0.05）。結(jié)果表明與對(duì)照組相比，20 μM SP600125單獨(dú)處理對(duì)PC-9細(xì)胞活力和caspase3活性無(wú)顯著影響（P＞0.05）；然而，應(yīng)用20 μM SP600125處理抑制JNK激活后，Ber降低PC-9細(xì)胞活力及增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)caspase3活性的能力受到明顯抑制。JNK/FOXO3通路和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，相比于60 μM Ber組，20 μM SP600125+60 μM Ber組p-JNK、Bax的表達(dá)明顯減少，p-FOXO3和Bcl-2表達(dá)顯著提高（P＜0.05）；而JNK和FOXO3表達(dá)無(wú)顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明SP600125抑制JNK磷酸化可上調(diào)FOXO3的磷酸化水平，進(jìn)而拮抗Ber的促凋亡作用（圖5）。

圖3 不同濃度Ber處理24 h對(duì)各組細(xì)胞JC-1線粒體膜電位、ROS含量及caspase3活性的影響Figure 3 Effect of Ber treatment on JC-1 mitochondrial membrane potential,ROS content,and caspase-3 activity of PC9 cells(24 h)

圖4 Ber處理24 h對(duì)PC-9細(xì)胞JNK/FOXO3通路和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 4 Effect of Ber treatment on JNK/FOXO3 signaling and apoptosis-related proteins of PC9 cells(24 h)

圖5 不同處理方法處理PC細(xì)胞24 h對(duì)JNK/FOXO3通路和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Effect of different treatments on JNK/FOXO3 signaling and apoptosis-related proteins of PC9 cells(24 h)

3 討論

Ber是一種國(guó)內(nèi)臨床常用的中成藥，具有顯著的抑菌功效，多用于治療腸道細(xì)菌感染、細(xì)菌性痢疾等。此外，研究發(fā)現(xiàn)Ber對(duì)肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤具有明確的抑制作用［1-2］，其機(jī)制與抑制腫瘤細(xì)胞周期，下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抗腫瘤血管生成，減少基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)抗腫瘤轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激反應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞凋亡等作用有關(guān)［2-4，11-12］。本研究發(fā)現(xiàn)，Ber具有顯著的抗肺癌作用，可有效降低人肺腺癌PC-9細(xì)胞活力，提高氧化應(yīng)激標(biāo)志因子ROS含量，增強(qiáng)凋亡因子caspase3活性和降低細(xì)胞線粒體膜電位進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，以上結(jié)果提示Ber誘導(dǎo)的PC-9細(xì)胞凋亡與激活氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

FOXO3作為一種抑癌因子，其激活具有抗腫瘤作用，如抗乳腺癌、肝癌、肺癌等［5-6，13］。研究表明FOXO3進(jìn)入細(xì)胞核后可調(diào)控p21、p27、FasL、TRAIL、Bim等多種抑癌因子表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞周期、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移［5，13］。FOXO3具有多種化學(xué)修飾作用，如磷酸化、乙?；?、甲基化和泛素化［5，14］。FOXO3 的磷酸化可抑制 FOXO3 的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)其從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移并在細(xì)胞質(zhì)中被降解，從而抑制FOXO3的抗腫瘤作用［5］。JNK是MAPK家族成員之一，持續(xù)活化（磷酸化）的JNK可以抑制PI3K、Akt及14-3-3蛋白的激活，抑制PI3K、Akt及14-3-3蛋白對(duì)FOXOs磷酸化作用，減少FOXOs磷酸化后出核降解，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［7-8，15］。

既往研究表明Ber可激活JNK，轉(zhuǎn)錄后上調(diào)Bax含量、抑制Bcl-2表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞凋亡［10］，激活 FOXO3促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用Ber可以顯著提高p-JNK和FOXO3在肺腺癌PC-9細(xì)胞中的表達(dá)，下調(diào)p-FOXO3的含量，抑制FOXO3磷酸化后的降解進(jìn)而上調(diào)FOXO3含量。此外，應(yīng)用JNK特異性抑制SP600125后可明顯抑制JNK的激活并上調(diào)p-FOXO3含量，抑制Ber對(duì)PC-9細(xì)胞的促凋亡作用，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2含量并抑制促凋亡蛋白Bax表達(dá)。以上研究結(jié)果表明，Ber誘導(dǎo)的肺腺癌細(xì)胞凋亡作用可能與上調(diào)p-JNK、FOXO3含量和抑制FOXO3磷酸化有關(guān)。然而，Ber在抗肺腺癌中的具體作用機(jī)制尚未完全明確，Ber是如何激活JNK和上調(diào)FOXO3表達(dá)，以及JNK是否通過(guò)抑制PI3K、Akt及14-3-3蛋白的激活降低FOXO3磷酸化仍需深入研究。

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（2017-03-19收稿）

（2017-06-09修回）

Berberine exerts pro-apoptotic effects on PC-9 cells via activation of JNK/FOXO3 signaling

Honggang LIU,Yuanyang LAI,Yifang ZHU,Liping TONG,Xiaoping DONG,Juan XU,Yong ZHANG,Haihua GUO,Xiaofei LI,Xiaolong YAN

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.17.316

Correspondence to:Xiaolong YAN;E-mail:yanxiaolong@fmmu.edu.cn

Department of Thoracic Surgery,Tangdu Hospital,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710038,China

閆小龍 yanxiaolong@fmmu.edu.cn

劉紅崗 專業(yè)方向?yàn)樾赝饪瞥Ｒ?jiàn)病多發(fā)病的診治。

E-mail：drliuhg@163.com