STAT3小分子抑制劑HJC0152抑制人頭頸部鱗癌細胞株侵襲遷移能力的研究*

李召卿 王宇 喬宇 武傳強 趙明慧 孫姍姍 張侖

STAT3小分子抑制劑HJC0152抑制人頭頸部鱗癌細胞株侵襲遷移能力的研究*

李召卿 王宇 喬宇 武傳強 趙明慧 孫姍姍 張侖

目的：探討新型信號轉導和轉錄活化因子3（signal transducer and activator of transcription，STAT3）抑制劑HJC0152對人頭頸部鱗癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）細胞株侵襲和遷移能力的影響及可能機制。方法：實驗分為二甲基亞砜（DMSO）組和HJC0152組。Western blot檢測細胞總蛋白中STAT3、p-STAT3 Tyr705/Ser727、MMP-2/9、N/E-cadherin、TWIST1和vi?mentin蛋白表達水平及核漿蛋白中的STAT3和p-STAT3 Tyr705/Ser727蛋白表達水平；劃痕實驗和Transwell實驗檢測細胞侵襲、遷移能力；免疫熒光實驗觀察N/E-cadherin蛋白的表達和亞細胞定位。結果：HJC0152組細胞總蛋白和核漿蛋白p-STAT3 Tyr705表達水平均受到顯著抑制，而STAT3、p-STAT3 Ser727未見明顯變化；總蛋白MMP-2/9、N-cadherin、TWIST1和vimentin表達水平降低，E-cadherin水平升高。HJC0152組細胞向劃痕中央移動的距離明顯短于DMSO組，通過Transwell小室聚碳酸酯膜的細胞較DMSO組也顯著減少。結論：HJC0152可有效抑制頭頸鱗癌細胞STAT3 Tyr705的磷酸化，阻礙其發(fā)揮轉錄因子的作用，抑制其下游基因表達，從而干預HNSCC侵襲和遷移能力。

小分子抑制劑 人頭頸部鱗癌 腫瘤浸潤 上皮-間質轉化 STAT3轉錄因子

AbstractObjective:This study aims to explore the anticancer effects and potential mechanisms of HJC0152,a novel STAT3 inhibitor,on the invasion and migration capacities of human head and neck squamous cell carcinoma(HNSCC)cell linesin vitro.Methods:Cells were divided into two groups,the dimethyl sulfoxide(DMSO)group and the HJC0152 group in which HNSCC cell lines UM-1 and SCC-15 were treated with DMSO or HJC0152 for 24 h.The total expression levels of STAT3,p-STAT3(Tyr705/Ser727),MMP-2/9,N/E-cadherin,TWIST1,and vimentin;and the cytoplasm and nuclear expression levels of STAT3 and p-STAT3(Tyr705/Ser727)were detected by Western blot assay.Wound healing and Transwell assays were employed to detect the invasion and migration abilities of the UM-1 and SCC-15 cells.The expression and location of N/E-cadherin were visualized by immunofluorescence staining.Results:Western blot indicated that the total expression of p-STAT3(Tyr705),MMP-2/9,N-cadherin,TWIST1,and vimentin were significantly declined and that E-cadherin was remarkably elevated in the HJC0152 group cells compared with that of the DMSO group,with no difference in STAT3 or p-STAT3(Ser727).Cytoplasm and nuclear STAT3(Tyr705)were also inhibited by HJC0152.Wound healing and Transwell assays indicated that tumor invasion and migration capacities were impressively attenuated in the HJC0152 group cells compared to that of the DMSO group.Conclusion:HJC0152 suppresses the phosphorylation of STAT3 at Tyr705 in the HNSCC cell lines,leading to impair transcription activity,deplete expression levels of target genes,and subsequently inhibit migration and invasion capabilities of HNSCC.

Keywords:small molecular inhibitor,human head and neck squamous cell carcinoma(HNSCC),neoplasm invasiveness,epithelial–mesenchymal transition(EMT),STAT3 transcription factor

作者單位：天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院頜面耳鼻喉科，國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學研究中心（天津市300060）

人頭頸部鱗狀細胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）在全球惡性腫瘤的發(fā)病率居第6位，患者的5年總生存率約為50%［1］，超過70%的頭頸部鱗狀細胞癌患者出現(xiàn)不同程度的復發(fā)或轉移［2-3］。因此，針對HNSCC治療的相關研究非常重要。

信號轉導和轉錄活化因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）與腫瘤的侵襲和轉移相關［4-5］。當被上游激活信號觸發(fā)后，STAT3先后經(jīng)歷磷酸化、同源二聚化以及進入細胞核并與相關DNA序列結合等過程，介導下游靶基因的轉錄［6］。大量證據(jù)表明，STAT3第705位酪氨酸殘基磷酸化在HNSCC中被異常激活，并可作為一個負向的調節(jié)因素影響HNSCC的預后［7］。因此，STAT3是HN?SCC潛在的治療靶點。

HJC0152是氯硝柳胺的衍生物，對STAT3信號傳導相較氯硝柳胺有更明顯的抑制作用。Chen等［8］通過熒光素酶報告實驗證明，HJC0152可以降低STAT3的轉錄活性，并在動物實驗中證明，HJC0152可以顯著抑制MDA-MB-231細胞移植瘤的生長。為探究HJC0152抑制HNSCC侵襲轉移的作用，本研究進行了一系列體外實驗。實驗證明，HJC0152有顯著的抗癌作用，可有效地抑制HNSCC細胞的侵襲轉移能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人類UM-1和SCC-15頭頸部鱗癌細胞系購于美國菌種保藏中心（ATCC）。

1.1.2 實驗試劑 DMEM/F-12培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清購于美國Gibco公司。MMP-2抗體、MMP-9抗體購于美國Santa Cruz公司。STAT3抗體、p-STAT3 Tyr705抗體、p-STAT3 Ser727抗體、vimentin抗體、TWIST1抗體購于美國Abcam公司。E-cad?herin抗體、N-cadherin抗體購于美國BD公司。組蛋白H3抗體購于美國Cell Signaling Technology公司。GAPDH抗體、山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗購于北京中杉金橋公司。BCA蛋白試劑盒購于美國Thermo Fisher公司。Matrigel基質膠購于美國BD公司。多聚甲醛和結晶紫購于美國Solorbio公司。Transwell小室購于美國Corning公司。HJC0152由美國德克薩斯大學醫(yī)學部的周嘉博士提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和實驗分組 UM-1/SCC-15細胞系以含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基在37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化細胞，2～3d傳代1次，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。實驗分為2組，二甲基亞砜（DMSO）組：將與HJC0152組中HJC0152等體積的DMSO加入UM-1和SCC-15的細胞培養(yǎng)基內；HJC0152組：以HJC0152終濃度為3.481 μM（半數(shù)抑制濃度IC50）和2.749 μM（IC50）的培養(yǎng)基處理UM-1和SCC-15。

1.2.2 MTT法檢測HJC0152對UM-1/SCC-15細胞的增殖抑制作用 取對數(shù)生長期細胞消化離心，重懸后，調整細胞濃度為2.5×105/mL，以200 μL/孔接種于96孔板，貼壁過夜后按照0、0.01、0.1、1、2、5、10、20、50、100 μmol/L濃度加入HJC0152，設置6個復孔。加藥后培養(yǎng)24 h，然后每孔加入MTT（5 mg/mL）20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩10 min使晶體充分溶解，酶標儀（490 nm波長）測得每孔光密度（optical density，OD）值。

1.2.3 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 取對數(shù)生長期UM-1和SCC-15細胞接種于6孔板，待細胞融合度達到80%～90%后用無菌20 μL槍頭垂直于6孔板平面進行劃痕，用無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）洗去刮掉的細胞，然后加入不含血清的培養(yǎng)基。實驗孔加入HJC0152，使其終濃度達到3.5 μM（UM-1）或2.75 μM（SCC-15），對照孔加入等量的DMSO。此時記為劃痕0 h，分別在0 h和培養(yǎng)48 h時于倒置顯微鏡觀察并拍照，測量各組細胞向劃痕中央遷移的距離。

1.2.4 Transwell實驗檢測細胞侵襲遷移能力 檢測細胞遷移能力和侵襲能力分別使用無Matrigel和有Matrigel包被的Transwell小室。小室用Matrigel膠包被后放入24孔板中，置于孵箱內過夜。取對數(shù)生長期UM-1和SCC-15細胞，根據(jù)實驗分組處理24 h后，胰酶消化，PBS清洗后用不含血清的培養(yǎng)基重懸，以5.0×104/孔細胞量接種于Transwell上室中，下室加600 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基。孵箱內培養(yǎng)16 h后，用4%多聚甲醛固定跨膜的細胞，并用0.1%結晶紫染色。使用倒置顯微鏡采集圖像，對4個不同視野的穿過膜細胞計數(shù)，求平均值。

1.2.5 Western blot分析相關蛋白的表達 常規(guī)培養(yǎng)對數(shù)生長期口腔鱗癌細胞UM-1和SCC-15，按實驗分組分別處理細胞24 h，PBS清洗2遍，在細胞中加入含1%PMSF和1%蛋白磷酸酶抑制劑的RIPA，裂解30 min，離心后收取上清液。應用凱基核漿蛋白提取試劑盒按說明書提取細胞核漿蛋白。用BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品用4×loading buffer稀釋，然后95℃加熱10 min。聚丙烯酰胺凝膠電泳（載30μg蛋白），用孔直徑為0.45 μm的PVDF膜轉膜。5%的脫脂奶粉封閉1 h，在 4℃分別孵 STAT3、p-STAT3 Tyr705、p-STAT3 Ser727、MMP-2、MMP-9、E-cadherin、N-cadherin、vi?mentin和TWIST1的一抗（1：1 000稀釋）以及GAPDH（1：2 000稀釋）一抗過夜，用加Tween的Tris-HCl緩沖鹽溶液（TBST）漂洗3次后，孵辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（1：2 000）1 h，TBST漂洗后，加ECL發(fā)光試劑用C-DiGit印記掃描儀（LI-COR）檢測結果。

1.2.6 免疫熒光法檢測UM-1/SCC-15細胞內N/E-cadherin的表達 取對數(shù)期細胞接種于24孔板中的無菌玻片爬片，每孔約2萬個細胞。按實驗分組處理細胞48 h，PBS洗3次后用4%多聚甲醛固定15 min，再用10%BSA室溫封閉30 min，加鼠抗人單克隆N/E-cadherin抗體（1∶200），4℃孵育過夜，再用FITC標記的抗小鼠IgG二抗（1∶500）室溫孵育1 h，于488 nm激光下觀察熒光強度。

1.3 統(tǒng)計學分析

每個實驗至少重復3次，應用SPSS 22軟件進行統(tǒng)計學分析，結果采用±s表示，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HJC0152對HNSCC IC50的測定

MTT法測得HJC0152對UM-1和SCC-15的IC50分別為3.481 μM和2.749 μM（圖1），本研究將此作為干預HNSCC細胞的藥物濃度。

圖1 MTT法測定UM-1和SCC-15細胞系中HJC0152的半數(shù)抑制率Figure 1 IC50of HJC0152 in UM-1 and SCC-15 determined by MTT

2.2 HJC0152對p-STAT3水平的影響

Western blot結果表明，經(jīng)HJC0152處理后，細胞總蛋白中p-STAT3 Tyr705水平明顯下降，而p-STAT3 Ser727水平未見改變；細胞核蛋白和漿蛋白中STAT3磷酸化水平的變化與總蛋白一致（圖2）。

圖2 HJC0152對STAT3蛋白活性位點磷酸化的影響Figure 2 Effect of HJC0152 on STAT3 phosphorylation level

2.3 HJC0152對人頭頸部鱗癌細胞株侵襲遷移能力的影響

實驗結果表明，劃痕48 h后，HJC0152組的頭頸鱗癌細胞系向中央遷移的距離較DMSO組明顯減少（圖3）。UM-1細胞DMSO組和HJC0152組向劃痕中央遷移的距離分別為（505.5±39.94）μm和（189.45±18.29）μm，P＜0.01；SCC-15細胞DMSO組和HJC0152組向劃痕中央遷移的距離分別為（499.28±49.35）μm和（228.76±28.56）μm，P＜0.01。

Transwell實驗結果顯示，不論是侵襲實驗還是遷移實驗，HJC0152組的細胞相比DMSO組穿過Transwell小孔的細胞數(shù)都明顯減少（圖3）。在遷移實驗中，UM-1細胞DMSO組和實驗組穿過小室的細胞數(shù)分別是（439±25.9）個/視野和（94±19.9）個/視野，P＜0.01；SCC-15細胞DMSO組和實驗組穿過小室的細胞數(shù)分別是（227±49.6）個/視野和（48.5±12.6）個/視野，P＜0.01。在侵襲實驗中，UM-1細胞DMSO組和實驗組穿過小室的細胞數(shù)分別是（108±24.7）個/視野和（39±12.7）個/視野，P＜0.01；SCC-15細胞DMSO組和實驗組穿過小室的細胞數(shù)分別是（191±37.1）個/視野和（64±14.7）個/視野，P＜0.01。此外，Western blot顯示，HJC0152組MMP-2和MMP-9表達水平也顯著降低（圖4）。

2.4 HJC0152對上皮-間質轉化（epithelial-mesen?chymal transition，EMT）進程的影響

經(jīng)HJC0152處理后，UM-1和SCC-15細胞中TWIST1蛋白和vimentin蛋白的表達均下降，此外，N-cadherin蛋白表達量明顯下降，而E-cadherin蛋白表達上升（圖4）。免疫熒光顯示，HJC0152處理后，細胞內E-cadherin蛋白表達增強，N-cadherin蛋白表達減弱（圖5）。

圖3 HJC0152對人頭頸部鱗癌遷移侵襲能力的影響Figure 3 Effect of HJC0152 on migration and invasion capacities in human HNSCC

圖4 HJC0152對侵襲性和EMT相關標志蛋白表達的影響Figure 4 Effect of HJC0152 on invasion and the expression of EMT biomarkers

圖5 免疫熒光檢測HJC0152對N-cadherin和E-cadherin表達水平的影響Figure 5 Effect of HJC0152 on the expression levels of N-cadherin and E-cadherin detected by immunofluorescence staining

3 討論

腫瘤局部侵犯與遠處轉移是HNSCC患者的主要死因之一，多數(shù)患者在就診時已發(fā)生區(qū)域淋巴結轉移（43%）或遠處播散（10%），失去手術治療的機會，預后較差。據(jù)統(tǒng)計，HNSCCⅠ期患者的生存率可達到80%，Ⅲ期和Ⅳ期患者的生存降至40%［9］，而遠處轉移患者的病死率約90%［10］。因此，腫瘤的侵襲轉移對腫瘤患者的預后有非常重要的影響。

STAT3是經(jīng)典的信號轉導與轉錄激活因子，在各組織細胞中廣泛表達。一方面，正常細胞內，STAT3受白介素、表皮生長因子等激活，在細胞的增殖、分化、存活、凋亡、轉化和細胞免疫等方面發(fā)揮著重要作用［11］；另一方面，在許多人類的惡性腫瘤中，都發(fā)現(xiàn)有異常激活的STAT3通路，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究證實，STAT3信號通路的異常激活與人頭頸部鱗癌的生長［12］、耐藥［13］和侵襲轉移［14］都密切相關。

HJC0152是一種新型的STAT3靶向抑制劑，對STAT3的轉錄活性有很強的抑制能力，并且水溶性和口服生物利用度較佳［8］。本研究中，經(jīng)HJC0152藥物處理后，HNSCC細胞株的STAT3和p-STAT3 Ser727水平不受影響，而p-STAT3 Tyr705水平明顯下降，說明HJC0152可特異性地抑制STAT3 Tyr705的磷酸化。據(jù)報道，Tyr705的磷酸化是STAT3轉錄激活的重要標志［15］，當Tyr705磷酸化受到抑制，STAT3作為轉錄因子的功能會被削弱。

MMP是腫瘤侵襲進程中的關鍵酶，參與腫瘤細胞外基質的降解，促進腫瘤的局部浸潤和遠處轉移，且其表達水平與淋巴結轉移相關，對判斷疾病預后有重要意義［16］。其中MMP-2和MMP-9作為重要的STAT3下游轉錄調控靶點，已被證實與HNSCC的侵襲轉移能力有關。通過HJC0152處理后，本研究觀察到UM-1和SCC-15細胞內MMP-2和MMP-9的表達水平顯著降低。與此同時，在Transwell侵襲實驗中，經(jīng)HJC0152處理的UM-1和SCC-15細胞侵襲能力較DMSO組明顯減弱。這提示藥物可有效地干預腫瘤細胞對外基質的降解，抑制腫瘤侵犯和轉移。

另一方面，EMT與腫瘤細胞的原位侵襲和遠處轉移有著密切的關系［17］，而STAT3的活化已被證明可通過介導EMT進程［18］，促進HNSCC的轉移［10，19］。為檢測HJC0152對HNSCC細胞株EMT的影響，本研究用Western blot法檢測HJC0152處理前后，UM-1和SCC-15細胞內EMT相關生物標志物的表達水平變化。TWIST1已被證實可通過調節(jié)細胞黏附相關基因的表達從而介導EMT［10］；而vimentin是間質細胞中控制細胞運動的細絲狀蛋白，vimentin高表達的原發(fā)HNSCC腫瘤轉移率顯著升高［20］；E-cadherin和N-cadherin是表達在膜表面的鈣黏蛋白，E-cadherin降低、N-cadherin升高被稱作“鈣黏蛋白轉換”，是EMT進程發(fā)動的重要標志。Western blot結果表明，HJC0152組vimentin、TWIST1和N-cadherin的表達量明顯下降，而E-cadherin明顯上升。這提示HJC0152通過抑制STAT3 Tyr705的磷酸化降低其轉錄活性，下調其下游基因TWIST1和VIM的表達，同時調節(jié)E-cadherin和N-cadherin蛋白的表達，從而逆轉EMT進程，抑制UM-1和SCC-15細胞侵襲和遷移的能力。

綜上所述，HJC0152作為STAT3的一個新型靶向抑制劑，可有效抑制STAT3第705位酪氨酸的磷酸化，影響其發(fā)揮轉錄調控與轉錄激活因子的作用，干預腫瘤降解細胞外基質的能力，削弱HNSCC細胞EMT趨勢，從而起到抑制HNSCC細胞侵襲轉移能力的抗腫瘤效果。

致謝：感謝美國德克薩斯大學醫(yī)學部的周嘉博士提供HJC0152藥物。

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（2017-04-20收稿）

（2017-08-10修回）

（編輯：武斌 校對：楊紅欣）

Anticancer effects and underlying mechanisms of HJC0152,a small-molecule STAT3 inhibitor,on tumor invasion and migration in human head and neck squamous cell carcinoma

Zhaoqing LI,Yu WANG,Yu QIAO,Chuanqiang WU,Minghui ZHAO,Shanshan SUN,Lun ZHANG

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.17.454

Correspondence to:Lun ZHANG;E-mail:zhanglunsubmission@163.com

Department of Maxillofacial and Ear Nose Throat Oncology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital;National Clinical Research Center for Cancer;Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin;Tianjin's Clinical Research Center for Cancer,Tianjin 300060,China

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81572492)

*本文課題受國家自然科學基金項目（編號：81572492）資助

張侖 zhanglunsubmission@163.com

李召卿 專業(yè)方向為人頭頸部鱗癌的基礎研究。

E-mail：idoclee@163.com