李果實褐腐病病原菌產生細胞壁降解酶條件優化及其致病機理

張 婕，凡先芳，姚世響,2，鄧麗莉,2，曾凱芳,2,*

李果實褐腐病病原菌產生細胞壁降解酶條件優化及其致病機理

張 婕1，凡先芳1，姚世響1,2，鄧麗莉1,2，曾凱芳1,2,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400715）

研究李果實褐腐病病原菌產生細胞壁降解酶的種類及其產酶最佳條件，并探討其導致果實發病的作用機制。以Monilinia fructicola為研究菌株，通過 單因素試驗和正交試驗優化M. fructicola產生細胞壁降解酶條件；通過損傷接種粗酶液，研究其對李果實的致病作用。結果表明：M. fructicola產細胞壁降解酶的最佳條件為：培養時間6 d、培養基pH 6.0、碳源 為3.5%蔗糖、氮源為2.5%硝酸鉀；粗酶液處理能夠導致李果實發生褐腐病，同時引起果實多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、果膠甲基半乳糖醛酸酶（pectin methylgalacturonase，PMG）活力的上升，使果實原果膠物質轉化為可溶性果膠，同時造成其纖維素含量下降，加速果實的軟化腐爛進程。

褐腐病；細胞壁降解酶；李果實；致病機理

青脆李屬薔薇科核果類，是我國西南地區的特色水果之一。其肉質致密、味甜汁多、營養豐富，是李樹的優良品種，深受消費者喜愛。青脆李果實成熟時期正值盛夏高溫、高濕季節（每年7～8月），加之其果皮較薄，汁液豐富，損傷后極易受病原微生物的侵染導致腐爛。其中由Monilinia spp.引起的褐腐病是李果實采后的主要侵染性病害[1]。Monilinia spp.主要分為以下3 種：美澳型核果褐腐病菌（M. fructicola (Winter) Honey）、果生鏈核盤菌（Monilinia fructigena (Aderh. et Ruhl.)Honey）、核果鏈核盤菌（Monilinia laxa (Aderh. et Ruhl.)Honey），其中，M. fructicola是李果實褐腐病的最主要致病菌[2-4]。

病原菌致病因子研究是人們探索植物與病原菌互作關系的重要內容之一。宿主細胞壁是阻止病原真菌侵入的一道屏障。病原真菌通過分泌多種細胞壁降解酶，降解組成宿主細胞壁的各種多糖物質，從而破壞細胞壁和胞間層，或導致細胞分離，組織潰散[5]。細胞壁降解酶具有雙重作用，一方面作為病原物侵染宿主的致病因子，另一方面酶解產物能誘導宿主防御反應，為寄主-病原物之間的互作提供一定的參考[6]。大多數病原真菌都能分泌各種細胞壁降解酶，主要包括果膠酶、纖維素酶等[5,7]。果膠酶是作用于果膠質的一類酶的總稱，主要功能是通過裂解或消去作用切斷果膠質中的糖苷鍵，使果膠質裂解為多聚半乳糖醛酸。其主要分為果膠酯酶、原果膠酶、果膠裂解酶 和聚半乳糖醛酸酶等幾大類[8]。病原菌主要可以分泌果膠酶中的多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、果膠甲基半乳糖醛酸酶（pectin methylgalacturonase，PMG），破壞果實的細胞壁。Chiu等[9]研究表明，褐腐菌在致病的過程中，與PG相關的果膠基因大量的表達，這證實了果膠酶在致病過程中發揮了重要的作用。纖維素酶是一類能降解纖維素的水解酶。纖維素酶是一組由幾種酶構成的一類酶，分別為內1,2-β-D-葡聚糖酶（endoglucanase，EG）、1,4-β-D-葡聚糖纖維二糖水解酶（4-β-D-glucanase，CX）和β-葡萄糖苷酶[7]。薛蓮等[10]發現活體外蘋果炭疽菌產生的胞外酶中均能夠檢測到羧甲基纖維素酶（4-β-D-glucanase，CX），并且活體內接種有炭疽病的果實CX活力顯著高于健康果實，這在一定程度上證實了CX在炭疽病病原菌致病過程中的作用。另外，在果實軟化早期，β-半乳糖苷酶含量豐富，能夠參與降解細胞壁半乳糖苷鍵，導致細胞壁的不完整性[11]。

然而，不同的病原菌所分泌的細胞壁降解酶是不同的，并且不同的降解酶在致病過程中發揮的作用也不同。目前，對于影響病原菌產酶作用的報道并不多。有研究表明，環境pH值和碳、氮源種類均會對病原分泌細胞壁水解酶產生影響[12-13]。已有研究表明，褐腐菌在侵入果實組織后，會產生相關細胞壁水解酶[14]，但是對褐腐菌產生細胞壁降解酶的培養條件、主要產生何種酶以及其對果實結構物質的影響鮮見相關報道。因此，本實驗以褐腐菌為研究對象，從培養時間、培養基pH值、碳源、氮源4方面先后進行單因素試驗、正交試驗，研究褐腐菌產生細胞壁降解酶的最佳條件以及產酶種類；同時，將制得的粗酶液損傷接種青脆李果實，研究其對果實發病以及相關結構物質含量的影響，為進一步明確褐腐菌產生細胞壁降解酶的致病作用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗所用李果實品種為“青脆李”（Prunus salicina Lindell cv. ‘Qingcuili’），于2015年 7月采收于重慶市北碚區縉云山果園，所有果實均采收當天運至實驗室，挑選大小均勻、成熟度一致、無機械傷和無病蟲害的果實，預冷后，放入0 ℃冷庫中貯藏待用。

褐腐病病原菌（M. fructicola）為本實驗室自行分離、鑒定和保存菌種。

葡萄糖、蔗糖、果糖、羧甲基纖維素（carboxymethyl cellilose，CMC）（均為分析純） 成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

BS-4G振蕩培養箱 金壇市富華儀器有限公司；dHP-9082電熱恒溫培養箱 上海齊欣科學儀器有限公司；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海東亞壓力容器制造有限公司；680溫控型酶標儀 美國基因公司。

1.3 方法

1.3.1 培養基組成

種子培養基：分別稱取酵母膏5 g、蛋白胨5 g、NaCl 5 g，用蒸餾水溶解后，定容至1 000 mL，然后分裝于250 mL三角瓶中，121℃條件下滅菌15 min。

液體培養基：KCl 0.5 g，KNO32.0 g，K2HPO41.0 g，FeSO40.01 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CMC 10 g，蒸餾水1 000 mL。培養液pH值調至5.0后，分裝于250 mL三角瓶中，每瓶裝50 mL，121 ℃條件下滅菌15 min。

1.3.2 粗酶液制備

將褐腐菌接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基（200 g去皮馬鈴薯加水煮沸20 min后過濾，濾液中加入20 g葡萄糖、20 g瓊脂粉，定容至1 000 mL，121 ℃滅菌15 min）上，于25 ℃條件下培養6 d后，挑取大小均勻的菌塊接入種子培養基中，在22 ℃、140 r/min條件下培養2 d，用滅菌紗布濾去菌液，用無菌水沖洗兩遍，將菌絲研磨后用滅菌蒸餾水配成5%菌懸液。吸取1 mL菌懸液接入液體培養基，于22 ℃、140 r/min條件下培養6 d，真空抽濾除去菌絲，于4 ℃、10 000 r/min條件離心15 min，棄去沉淀，留上清液（粗酶液）備用。

1.3.3 單因素試驗設計

1.3.3.1 培養時間對褐腐菌產酶的影響

在50 mL液體培養基中接入1 mL的種子液，于22 ℃、140 r/min搖床中分別培養0、2、4、6、8 d，按照1.3.2節的方法提取粗酶液，測定PG、PMG、CX和β-葡萄糖苷酶的活力。每個處理重復3 次。

1.3.3.2 培養基起始pH值對褐腐菌產酶的影響

分別在pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的50 mL液體培養基中接入1 mL的種子液，于22 ℃、140 r/min搖床中按照1.3.3.1節得出的最適培養溫度和培養時間培養。按照1.3.2節的方法提取粗酶液，測定PG、PMG、CX和β-葡萄糖苷酶的活力。每個處理重復3 次。

1.3.3.3 碳源對褐腐菌產酶的影響

改變液體培養基中碳源種類和用量：蔗糖、葡萄糖、果糖、CMC（質量分數1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%），于140 r/min搖床中，在1.3.3.1、1.3.3.2節得出的最佳培養時間、pH值條件下培養。按照1.3.2節的方法提取粗酶液，測定PG、PMG、CX和β-葡萄糖苷酶的活力。每個處理重復3 次。

1.3.3.4 氮源對褐腐菌產酶的影響

以1.3.3.3節得出的最佳結果為碳源，改變培養基中氮源種類和用量：蛋白胨、酵母膏、尿素、銷酸鉀（質量分數0.5%、1.0%、1.5%、2.0%），于140 r/min搖床中，按照1.3.3.1、1.3.3.2節得出的最佳培養時間、pH值條件下培養。按照1.3.2節的方法提取粗酶液，測定PG、PMG、CX和β-葡萄糖苷酶的活力。每個處理重復3 次。

1.3.4 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，選擇培養時間（A）、培養基起始pH值（B）、碳源用量（C）、氮源用量（D）為4 個試驗因素，按正交表L16（45）設計正交試驗，分別測定PG、PMG、CX和β-葡萄糖苷酶的活力，如表1所示。

表1 正交試驗因素與水平設計Tabllee 11 Factors and their coded levels used for orthogonal array dessiiggnn

1.3.5 粗酶液中纖維素酶、果膠酶活力測定

纖維素酶CX、β-葡萄糖苷酶，果膠酶PG、PMG活力測定參考董小梅[15]的方法。

1.3.6 粗酶液對采后李果實發病情況的影響

按照1.3.4節得到的條件培養褐腐菌，得到菌懸液，并按照1.3.2節操作制得粗酶液，備用。將李果實用清水清洗，自然晾干。用無菌打孔器在果實赤道部位均勻刺2個孔（直徑5 mm，深3 mm），在每個傷口分別接種40 μL以下溶液：Ⅰ無菌水（對照）；Ⅱ粗酶液。待液體吸收后，單果包裝，貯藏在20 ℃、相對濕度85%～90%環境下，并用PE膜覆蓋保濕處理。每天統計發病率和病斑直徑。每個處理10 個果實，重復3 次。

1.3.7 粗酶液對采后李果實細胞壁降解酶以及相關結構物質的影響

1.3.7.1 樣品的處理

果實用自來水沖洗干凈，自然晾干。用無菌鐵釘在果實赤道部位均勻刺2 個孔（直徑5 mm，深3 mm），在每個傷口分別接種40 μL以下溶液：Ⅰ無菌水（對照）；Ⅱ粗酶液。待處理液吸收干凈后，單果包裝，貯藏在20 ℃、相對濕度85%～90%環境下，于貯藏0、12、24、36、48、60、72、84 h取果實傷口處組織進行各項相關指標測定。每個處理重復3 次，每個重復10 個果實，整個實驗重復2 次。

1.3.7.2 果實中纖維素酶、果膠酶的測定

纖維素酶CX、β-葡萄糖苷酶和果膠酶PG、PMG活力測定參考董小梅[15]的方法。1.3.7.3 果膠物質的測定

果實原果膠和可溶性果膠含量參照Manganaris等[16]的方法測定。

1.3.7.4 纖維素的測定

采用質量法測定李果實纖維素含量[17]。

1.4 數據分析

Excel 2016統計分析所得數據，并計算標準誤、制圖；用SPSS 21.0軟件對數據進行方差分析（ANOVA），利用鄧肯式多重比較對差異顯著性進行比較分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 培養時間、培養基pH值對褐腐菌產細胞壁降解酶的影響

圖1 培養時間（A）和培養基pH值（B）對褐腐菌產生細胞壁水解酶的影響Fig. 1 Effect of culture time and pH of culture medium on CWDE production

由圖1A可知，褐腐菌在培養8 d內均可產生纖維素酶和果膠酶，PG和PMG兩種酶活力呈先上升、后下降趨勢，而β-葡萄糖苷酶、CX活力變化不明顯。其中果膠酶活力明顯高于纖維素酶，培養6 d時，β-葡萄糖苷酶、PG、PMG 3種酶活力達到峰值，隨后下降。由以上結論可知，褐腐菌產生胞壁降解酶的培養時間選擇6 d最好。由圖1B可知，褐腐菌在pH 2.0～6.0范圍內都會產生CX、β-葡萄糖苷酶、PG和PMG。其中果膠酶活力明顯高于纖維素酶。當pH 4.0時，4 種酶活力均達到峰值，分別達到6.01、6.26、16.44、22.84 U/mL。由以上結論可知，褐腐菌產生胞壁降解酶的培養基pH 4.0較好。

2.2 碳源對褐腐菌產細胞壁降解酶的影響

圖2 碳源對褐腐菌產細胞壁降解酶活力的影響Fig. 2 Effect of carbon source in the culture medium on the activities of CX, β-glycosidase, PG, and PMG produced by M. fructicola

由圖2可知，褐腐菌在4 種不同碳源（CMC、蔗糖、葡萄糖、果糖）培養基中均能產生CX、β-葡萄糖苷酶、PG和PMG。在以蔗糖為碳源的培養基中，CX、β-葡萄糖苷酶、PMG 3種酶活力均表現為較高水平，PG活力則在以葡萄糖為碳源的培養基中表現為較高水平。且當蔗糖用量為2.5%時，CX、β-葡萄糖苷酶和PMG活力均達較高水平，分別為257.68、303.96、280.55 U/mL，PG則在2%達到最高水平132.63 U/mL。在以CMC為碳源的培養濾液中，CX、β-葡萄糖苷酶、PG和PMG 4 種酶活力均為最低。由以上結論可知，2.5%蔗糖為褐腐菌產生細胞壁降解酶的最佳碳源。

2.3 氮源對褐腐菌產細胞壁降解酶的影響

圖3 氮源對褐腐菌產細胞壁降解酶的影響Fig. 3 Effect of nitrogen source in the culture medium on the activities of CX, β-glycosidase, PG, and PMG produced by M. fructicola

由圖3可知，褐腐菌在4 種不同氮源（硝酸鉀、蛋白胨、酵母膏、尿素）培養基中均能產生CX、β-葡萄糖苷酶、PG和PMG。在以硝酸鉀為氮源培養的濾液中，4 種酶活力顯著高于其他3種氮源培養基，且在1.5%硝酸鉀為氮源時， CX、β-葡萄糖苷酶、PG和PMG 4 種酶活力最高，分別達到90.35、89.97、118.31、115.04 U/mL。此外，尿素最不利于PG和PMG的產生，蛋白胨最不利于CX、β-葡萄糖苷酶的產生。由以上結論可知，1.5%硝酸鉀為褐腐菌產生細胞壁降解酶的最佳氮源。

2.4 褐腐菌分泌細胞壁降解酶條件優化

表2 正交試驗設計與結果Table 2 Orthogonal array design with experimental results

從表2可以看出，培養時間、pH值、碳源用量、氮源用量這4 種不同因素對褐腐菌產生細胞壁降解酶活力的影響各不相同。以各酶總活力為指標，得到最優組合為A2B4C3D2，CX、β-葡萄糖苷酶、PG和PMG活力分別為567.55、503.07、509.21 U/mL和560.27 U/mL。因此，培養時間6 d、培養基pH 6.0、3.5%蔗糖、2.5%硝酸鉀為褐腐菌產生細胞壁降解酶的最佳培養條件。

2.5 粗酶液對采后李果實發病情況的影響

圖4 粗酶液對采后李果實發病情況的影響Fig. 4 Disease incidence and lesion diameter of plum fruits treated with the crude enzymes

由圖4可以看出，對照組李果實在整個貯藏期間未發病，粗酶液處理組李果實在發病隨時間變化呈上升趨勢。貯藏48 h，粗酶液處理組果實開始發病，在96 h時發病率達到95%，病斑直徑達到34.77 mm。由照片也可以看出，經過粗酶液處理的果實發病情況較對照組明顯。這表明，粗酶液處理可以導致李果實發病，酶液是導致李果實褐腐病發病的關鍵因素之一。

2.6 粗酶液對采后李果實纖維素酶和果膠酶活力的影響

由圖5A可以看出，貯藏前期，粗酶液處理組果實CX活力呈波動性，但是整體變化不大，對照組果實CX活力在貯藏60 h后呈先上升、后下降趨勢，這一階段對照組果實CX活力較粗酶液處理組高。由圖5B可知，貯藏前72 h，對照組和粗酶液處理組李果實β-葡萄糖苷酶活力未呈明顯規律性，貯藏72 h后，粗酶液處理組果實β-葡萄糖苷酶活力較對照組高。由圖5C可知，整個貯藏期間粗酶液處理組果實PG活力顯著高于對照組（P＜0.05）。由圖5D可知，貯藏12～60 h內，對照組和粗酶液處理組PMG活力無明顯差異（P＞0.05）；貯藏60～84 h內，粗酶液處理組果實PMG活力逐漸上升，而對照組果實呈先下降后上升趨勢，且粗酶液處理組果實PMG活力顯著高于（P＜0.05）對照組。

圖5 粗酶液對采后李果實CX（AA）、β-葡萄糖苷酶（BB）、PG（C）、PMG（D）活力的影響Fig. 5 Effect of inoculation with the crude enzymes on the activities of CX (A), β-glycosidase (B), PG (C), and PMG (D) in postharvest plum fruits during storage

2.7 粗酶液對采后李果實果膠物質的影響

由圖6A可以看出，貯藏36 h內，粗酶液處理組果實可溶性果膠含量較對照組高；貯藏36～84 h內，粗酶液處理組果實可溶性果膠含量較對照組低。由圖6B可以看出，貯藏48 h內，粗酶液處理組果實原果膠含量較對照組果實低；貯藏48～84 h內，粗酶液處理組果實原果膠含量較對照組高。

圖6 粗酶液對采后李果實可溶性果膠（A）和原果膠（B）含量的影響Fig. 6 Effect of inoculation with the crude enzymes on the contents of pectin and protopectin in postharvest plum fruits during storage

2.8 粗酶液對采后李果實纖維素的影響

圖7 粗酶液對采后李果實纖維素的影響Fig. 7 Effect of inoculation with the crude enzymes on cellulose activity of postharvest plum fruits during storage

由圖7可以看出，貯藏48 h內，對照組李果實纖維素含量顯著高于粗酶液處理組（P＜0.05）。貯藏12 h時，粗酶液處理組果實纖維素質量分數較對照組果實低74%。貯藏48～84 h內，對照組和粗酶液處理組之間纖維素含量差異不顯著（P＞0.05）。

3 討 論

本實驗研究表明，M. fructicola在離體條件下可以產生果膠酶和纖維素酶，這些酶類對采后李果實相關結構物質有降解作用，是M. fructicola的重要致病因子。這與Manganaris等[16]將M. fructicola接入桃果實后作用結果相似。在入侵寄主的過程中，M. fructicola首先產生的細胞壁降解酶，如果膠酶和纖維素酶，破壞李果實細胞壁結構和相關組織，加速了病原菌的入侵與營養吸收作用，后與果實建立寄生關系，大量繁殖，進而導致李果實褐腐病的發生。

環境條件會影響病原菌產生細胞壁降解酶。本研究單因素試驗研究結果表明，以培養時間和培養基pH值為變量因子時，果膠酶（PG、PMG）活力高于纖維素酶（CX、β-葡萄糖苷酶）；以培養基中碳源和氮源為變量因子時，4 種酶活力均變化較大，其中以蔗糖為碳源、硝酸鉀為氮源的培養基中，M. fructicola產酶能力最強。酸性條件下，褐腐菌產生細胞壁降解酶的能力增強，從而其致病性也增強，這一結果與de Cal等[12]的研究一致。Chou等[13]研究發現，半乳糖醛酸或葡萄糖作為碳源培養褐腐真菌時，果膠酶相關的基因獲得較高的表達，這一結果與本實驗研究不相符，可能原因為果膠酶相關的基因表達受培養環境pH值的調控，pH值在3.5～5之間時，果膠酶基因表達加強，而本實驗所采用的最佳pH 6.0，因此其基因表達出現差異。此外，當真菌在硝酸銨或酵母提取物作為氮源培養時，與果膠相關的基因表達也顯著升高，因此，硝酸鹽是有利于M. fructicola和生長以及分泌胞外酶[18]。此外，在正交試驗中可以得出，M. fructicola分泌果膠酶和纖維素酶的最佳條件為：培養時間6 d、pH 6.0、碳源3.5%蔗糖、氮源2.5%硝酸鉀。

本實驗中，將粗酶液接種到李果實后，李果實發生褐腐病，這與楊海清等[19]研究結果不一致，在其實驗中，果膠酶液不能使桃果實發生褐腐病，可能原因為：本實驗采用的是混合酶液，而楊海清等[19]使用的是單一的果膠酶液，然而為何混合酶液會對果實產生致病作用，具體原因需進一步研究得出。接入酶液后，李果實中PG和PMG活力明顯升高，而CX和β-葡萄糖苷酶未成明顯規律性，可能是由于李果實組織中果膠物質含量較高，胞外酶表現底物特異性，因此，PG、PMG活力較強。這一結論同時說明，褐腐菌主要產生果膠酶發揮致病作用，而纖維素酶作用不強[20]。外源果膠酶能影響果實果膠多糖成分、特殊片段以及化學結構，甚至導致果實直接遭受病害[21-22]。

李果實接種粗酶液后其關結構物質發生變化。結果表明，粗酶液處理能夠引起果實果膠和纖維素含量發生改變。這一結果與Faulkner[23]、Skamnioti[24]等研究結果一致。許多真菌穿透宿主細胞表皮層之后，通過細胞壁相關降解酶分解果皮、果肉組織中的果膠和纖維素，最后導致二者的降解，胞外纖維素酶則通過綁定到外層膜組分降解纖維素[25]。然而，真菌侵染是一個復雜的過程，涉及其他細胞壁降解酶和毒素等致病因素，如激發子、胞外多糖等，這些物質是如何協同發揮作用導致李果實褐腐病的發生，需進一步的研究[26-30]。

由以上研究可以得出：M. fructicola產細胞壁降解酶的最佳條件為：培養時間6 d、pH 6.0、碳源3.5%蔗糖、氮源2.5%硝酸鉀；粗酶液能夠導致李果實發生褐腐病，使果實快速腐爛；酶液引起果實PG、PMG活力的上升，加速果實可溶性果膠物質的溶出，以及原果膠物質轉化為可溶性果膠，同時，會引起李果實纖維素含量的下降，加速果實的軟化腐爛進程。

[1] KARACA H, PéREZ-GAGO M B, TABERNER V, et al. Evaluating food additives as antifungal agents against M. fructicola in vitro and in hydroxypropyl methylcellulose–lipid composite edible coatings for plums[J]. International Journal of Food Microbiology, 2014, 179∶ 72-79. DOI∶10.1016/j.ijfoodmicro.2014.03.02.

[2] LATORRE B A, DIAZ G A, VALENCIA A L, et al. First report of Monilinia fructicola causing brown rot on stored Japanese plum fruit in Chile[J]. Plant Disease, 2014, 98(1)∶ 160. DOI∶10.1094/PDIS-06-13-0647-PDN.

[3] VASIC M, DUDUK N, IVANOVIC M S. First report of brown rot caused by Monilia polystroma on apple in Serbia[J]. Plant Disease,2013, 97(1)∶ 145. DOI∶10.1094/PDIS-07-12-0670-PDN.

[4] YIN Liangfen, CHEN Shuning, CHEN Guokang, et al. Identifi cation and characterization of three Monilinia species from plum in China[J]. Plant Disease, 2015, 99(12)∶ 1775-1783. DOI∶10.1094/PDIS-12-14-1308-RE.

[5] M?KEL? M R, DONOFRIO N, VRIES R P, et al. Plant biomass degradation by fungi[J]. Fungal Genetics and Biology, 2014, 72∶ 2-9.DOI∶10.1016/j.fgb.2014.08.010.

[6] 趙蕾, 張天宇. 植物病原茵產生的降解酶及其作用[J]. 微生物學通報, 2002, 29(1): 89-93. DOI:10.3969/j.issn.0253-2654.2002.01.022.

[7] NAGENDRAN S, HALLEN-ADAMS H E, PAPER J M, et al.Reduced genomic potential for secreted plant cell-wall-degrading enzymes in the ectomycorrhizal fungus Amanita bisporigera, based on the secretome of Trichoderma reesei[J]. Fungal Genetics & Biology,2009, 46(5)∶ 427-435. DOI∶10.1016/j.fgb.2009.02.001.

[8] JAROSZUK-SCISEL J, KUREK E, SLOMKA A, et al. Activities of cell wall degrading enzymes in autolyzing cultures of three Fusarium culmorum isolates∶ growth-promoting, deleterious and pathogenic to rye (Secale cereale)[J]. Mycologia, 2011, 103(5)∶ 929-945.DOI∶10.3852/10-300.

[9] CHIU C M, YOU B J, CHOU C M, et al. Redox status-mediated regulation of gene expression and virulence in the brown rot pathogen M. fructicola[J].Plant Pathology, 2013, 62(4)∶ 809-819. DOI∶10.1111/ppa.12006.

[10] 薛蓮, 檀根甲, 徐先松, 等. 蘋果炭疽病菌對蘋果果實致病機制初探[J]. 安徽農業大學學報, 2006, 33(4): 522-525. DOI:10.3969/j.issn.1672-352X.2006.04.019.

[11] AND R L F, BENNETT A B. Role of Cell wall hydrolases in fruit ripening[J]. Annual Review of Plant Biology, 2003, 42(4)∶ 675-703.DOI∶10.1146/annurev.pp.42.060 191.003331.

[12] DE CAL A, SANDíN-ESPA?A P, MARTINEZ F, et al. Role of gluconic acid and pH modulation in virulence of M. fructicola on peach fruit[J]. Postharvest Biology and Technology, 2013, 86∶ 418-423. DOI∶10.1016/j.postharvbio.2013.07.012.

[13] CHOU Chienming, YU Fa ngyi, YU Peiling, et al. Expression of five endopolygalacturonase genes and demonstration that MfPG1 overexpression diminishes virulence in the brown rot pathogen M. fructicola[J]. PLos One, 2015, 10(6)∶ e 0132012. DOI∶10.1371/journal.pone.0132012.

[14] PRING R J, BYRDE R J W, WILLETTS H J. An ultrastructuralstudy of the infection of pear fruit by Monilinia fructigena[J].Physiologic al Plant Pathology, 1981, 19(1): 1-6. DOI:10.1016/S0048-4059(81)80002-1.

[15] 董小梅. 龍眼焦腐病菌細胞壁降解酶及其致病機理的研究[D].福州: 福建農林大學, 2010. DOI:10.7666/d.d116169.

[16] MANGANARIS G A, VASILAKAKIS M, MIGNANI I, et al.The effect of preharvest calcium sprays on quality attributes,physicochemical aspects of cell wall components and susceptibility to brown rot of peach fruits (Prunus persica L. cv. Andross)[J]. Scientia Horticulturae, 2005, 107: 43-50. DOI:10.1016/j.scienta.2005.06.005.

[17] 曹建康, 姜微波. 果蔬采后生理生化實驗指導[M]. 北京: 中國輕工業出版社, 2007.

[18] BARAD S, HOROWITZ S B, MOSCOVITZ O, et al. A Penicillium expansum glucose oxidase-encoding gene, GOX2, is essential for gluconic acid production and acidification during colonization of deciduous fruit[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI,2012, 25(6): 779-788. DOI:10.10 94/MPMI-01-12-0002.

[19] 楊海清. 桃褐腐病菌致病性及拮抗細菌生防機制的研究[D]. 呼和浩特: 內蒙古農業大學, 2007. DOI:10.7666/d.y1137957.

[20] AKIMITSU K, ISSHIKI A, OHTANI K, et al. Sugars and pH: A clue to the regulation of fungal cell wall-degrading enzymes in plants[J].Physiological & Molecular Plant Pathology, 2005, 65(6): 271-275.DOI:10.1016/j.pmpp.2005.03.001.

[21] BHATTACHARYA S, RASTOGI N K. Rheological properties of enzyme-treated mango pulp[J]. Journal of Food Engineering, 1998,36(3): 249-262. DOI:10.1016/S0260-8774(98)00067-3.

[22] KERMANI Z J, SHPIGELMAN A, BERNAERTS T M M, et al.The effect of exogenous enzymes and mechanical treatment on mango purée: effect on the molecular properties of pectic substances[J]. Food Hydrocolloids, 2015, 50: 193-202. DOI:10.1016/j.foodhyd.2015.03.033.

[23] FAULKNER C, ROBATZEK S. Plants and pathogens: pu tting infection strategies and defence mechanisms on the map[J]. Current Opinion in Plant Biology, 2012, 15(6): 699-707. DOI:10.1016/j.pbi.2012.08.009.

[24] SKAMNIOTI P, GURR S J. Magnaporthe grisea cutinase2 mediates appressorium diffe rentiation and host penetration and is require d for full virulence[J]. The Plant Cell, 2007, 19(8): 2674-2689.DOI:10.1105/tpc.107.051219.

[25] WILSON D B. Evidence for a novel mechanism of microbial cellulose degradation[J]. Cellulose, 2009, 16(4): 723-727. DOI:10.1007/s10570-009-9326-9.

[26] JANISIEWICZ W J, BUYER J S. Culturable bacterial microflora associated with nectarine fruit and their potential for control of brown rot[ J]. Canadian Journal of Microbiology, 2010, 56(6): 480-486.DOI:10.1139/w10-031.

[27] JANISIEWICZ W J, JURICK Ⅱ W M, VICO I, et al. Culturable bacteria from plum fruit surfaces and their potential for controlling brown rot after harvest[J]. Postharvest Biology and Technology, 2013,76(2): 145-151. DOI:10.1139/w10-031.

[28] PIMENTA R S, DA SILVA J F M, BUYER J S, et al. Endophytic fungi from plums (Prunus domestica) and their antifungal activity against Monilinia fructicola[J]. Journal of Food Protection, 2012, 75(10):1883-1889. DOI:10.4315/0362-028X.JFP-12-156.

[29] JANISIEWICZ W J, JURICK Ⅱ W M, VICO I, et al. Culturable bacteria from plum fruit surfaces and their potential for controlling brown rot after harvest[J]. Postharvest Biology and Technology, 2013,76: 145-151. DOI:10.1016/j.postharvbio.2012.10.004.

[30] JANISIEWICZ W J, JURICK W M, PETER K A, et al. Yeasts associated with plums and their potential for controlling brown rot after harvest[J]. Yeast, 2014, 31(6): 207-218. DOI:10.1002/yea.3009.

Optimization of Culture Conditions of Monilinia fructicola for the Production of Cell Wall Degrading Enzymes and Their Involvement in Brown Rot Pathogenesis of Postharvest Plums

ZHANG Jie1, FAN Xianfang1, YAO Shixiang1,2, DENG Lili1,2, ZENG Kaifang1,2,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China;2. Chongqing Engineering Research Center for Special Food, Chongqing 400715, China)

The aims of this study were to optimize the culture conditions of Monilinia fructicola for the production of cell wall degrading enzymes (CWDE) and to clarify the role of the culture supernatant obtained as crude CWDE in the pathogenesis of brown rot caused by Monilinia fructicola in postharvest plums. The optimization of the culture conditions was carried out using one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods. Besides, the pathogenesis was investigated by wounding and inoculating plum fruits w ith the crude CWDE and observing the incidence of brown rot. The results showed that the optimal culture conditions were as follows∶ culture time, 6 d; pH, 6.0; 3.5% sucrose as carbon source; and 2.5% KNO3as nitrogen source. The crude enzymes produced by M. fructicola could cause brown rot of plum fruits. In addition, the activities of polygalacturonase (PG), pectin methylgalacturonase (PMG) in the fruits inoculated with the crude enzymes were enhanced, thereby leading to the conversion of insoluble protopectin to soluble pectin and cellulose reduced cellulose content and consequently accelerating the softening and rotting process.

brown rot; cell wall degrading enzymes; plum; pathogenesis

10.7506/spkx1002-6630-201720003

S436.639

A

1002-6630（2017）20-0012-08

張婕, 凡先芳, 姚世響, 等. 李果實褐腐病病原菌產生細胞壁降解酶條件優化及其致病機理[J]. 食品科學, 2017, 38(20):12-19. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201720003. http://www.spkx.net.cn

ZH ANG Jie, FAN Xianfang, YAO Shixiang, et al. Optimization of culture conditions of Monilinia fructicola for the production of cell wall degrading enzymes and their involvement in brown rot pathogenesis of postharvest plums[J]. Food Science, 2017,38(20)∶ 12-19. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720003. http∶//www.spkx.net.cn

2016-11-23

國家公益性行業（農業）科研專項（201303075）；重慶市研究生科研創新項目（CYS16071）

張婕（1990—），女，碩士研究生，研究方向為農產品加工與貯藏工程。E-mail：zhangjie_libra@163.com

*通信作者：曾凱芳（1972—），女，教授，博士，研究方向為農產品加工與貯藏工程。E-mail：zengkaifang@163.com