3種Dawson型雜多酸對酪氨酸酶的抑制作用

謝樂芳，李莉莉，陳丙年，王力，*

（1.集美大學食品與生物工程學院，福建廈門361021；2.廈門大學附屬中山醫院演武分院，福建廈門361005）

3種Dawson型雜多酸對酪氨酸酶的抑制作用

謝樂芳1，李莉莉1，陳丙年2，王力1，*

（1.集美大學食品與生物工程學院，福建廈門361021；2.廈門大學附屬中山醫院演武分院，福建廈門361005）

合成3種Dawson型雜多酸H8[P2Mo17Zn（OH2）O61]、H8[P2Mo17Cu（OH2）O61]和H7[P2Mo17Fe（OH2）O61]（分別簡寫為P2Mo17Zn、P2Mo17Cu和P2Mo17Fe），并用紅外和紫外光譜進行結構表征。進而用酶動力學方法研究3種化合物對酪氨酸酶二酚酶的抑制作用（包括抑制效果、抑制機理、抑制類型）。結果表明：P2Mo17Zn、P2Mo17Cu和P2Mo17Fe 3種化合物對酪氨酸酶二酚酶均有明顯的抑制效果，對應的IC50值分別為0.346 2、0.361 5、0.383 1 mmol/L。3種化合物均屬于可逆競爭型，抑制常數KI分別為0.106 8、0.068 2、0.057 2 mmol/L。綜合比較，3種化合物的抑酶效果依次是P2Mo17Zn＞P2Mo17Cu＞P2Mo17Fe。

酪氨酸酶；抑制作用；雜多酸；酶動力學

Abstract：Three kinds of Dawson-type heteropoly acids H8[P2Mo17Zn（OH2）O61]，H8[P2Mo17Cu（OH2）O61]and H7[P2Mo17Fe（OH2）O61]were synthesised（abbreviated as P2Mo17Zn，P2Mo17Cu and P2Mo17Fe）.The structures of these compounds were characterized by the UV and IR spectroscopy.And then these compounds'inhibitory effect on tyrosinase were studied by enzyme kinetic method （including inhibition effects，inhibition mechanism and inhibition type）.The results showed that three compounds had obvious inhibitory effects on tyrosinase，and the IC50values of P2Mo17Zn，P2Mo17Cu and P2Mo17Fe were 0.346 2，0.361 5 and 0.383 1 mmol/L，respectively.Moreover，the three kinds of compounds were reversible competitive inhibitiors，and their inhibition constants（KI）were 0.106 8，0.068 2 and 0.057 2 mmol/L，respectively.Comprehensive comparison，the order of the inhibiting ability of three kinds of compounds on tyrosinase was P2Mo17Zn＞P2Mo17Cu＞P2Mo17Fe.

Key words：tyrosinase；inhibitory effect；heteropoly acid；enzyme kinetic method

酪氨酸酶（tyrosinase，EC 1.14.18.1）結構復雜，含有多個亞基，其活性中心含有銅離子，是一種氧化還原酶[1-3]。微生物、動植物以及人體中都分布有酪氨酸酶，它是生物體合成黑色素的關鍵限速酶，兼具單酚酶和二酚酶活性[4-6]：催化L-酪氨酸羥基化為L-多巴和氧化L-多巴形成多巴醌[3-4，7-8]，多巴醌經進一步復雜反應生成黑色素。而黑色素的過量表達則會引起色素沉著等相關疾病[1-2，8]和果蔬的酶促褐變，嚴重影響美觀和經濟效益。因此通過抑制酪氨酸酶活性來控制黑色素的生成量，進而治療或防止色素沉著和延緩酶促褐變的研究也越來越多[7]。目前，抑制酪氨酸酶活性的研究主要集中在天然提取物[5，7-11]、人工合成的有機化合物[2-3，6，11-13]以及少量的無機化合物[14]。因此，研發和尋找高效無毒、特異性強的酪氨酸酶抑制劑已成為醫藥、農學、食品等領域的研究熱點[5]。

多金屬氧酸鹽（Polyoxometalates，簡寫為 POMs），是一類分子金屬氧化物，具有結構多樣性和特殊的物理化學性質，在催化、分子基功能材料、磁性分子、仿生學和多功能材料[15]方面已經有廣泛的應用。尤其是，多金屬氧化簇能夠接受額外的電子進行可逆的氧化還原反應，同時保持結構不變[16]。這些性質使其能夠成為具有吸引力的氧化還原催化劑，作為分子材料和設備的功能單位[17]。不僅如此，許多研究發現多金屬氧酸鹽可能成為潛在的有效酶抑制劑[18-19]。為此，本實驗室對多金屬氧酸鹽用于抑制酪氨酸酶活性進行了研究，發現Keggin型多金屬氧酸鹽對酪氨酸酶具有很好的抑制作用[20-25]，為進一步研究其他類型多酸對酪氨酸酶的抑制作用，對Dawson型多酸的抑酶效果進行研究，以期研制出更新穎、更安全有效的酪氨酸酶抑制劑，為擴展多金屬氧酸鹽的應用以及果蔬保鮮甚至色素沉著性疾病的治療提供有用信息。因此，本文按照文獻方法合成并研究了 H8[P2Mo17Zn（OH2）O61]、H8[P2Mo17Cu（OH2）O61]和H7[P2Mo17Fe（OH2）O61]（分別簡寫為P2Mo17Zn、P2Mo17Cu和P2Mo17Fe）對酪氨酸酶的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

H8[P2Mo17Zn（OH2）O61]、H8[P2Mo17Cu（OH2）O61]和 H7[P2Mo17Fe（OH2）O61]按文獻方法自行合成，用紅外、紫外光譜進行結構表征[26-28]；酪氨酸酶（2 687 U/mg）、L-3，4-二羥基苯丙氨酸（L-DOPA）、二甲基亞砜（DMSO）：Sigma-Aldrich化學公司；其它試劑均為分析純；實驗用水均為超純水。

Cintra 2020型紫外-可見分光光度計：澳大利亞GBC儀器公司；Nicolet Avatar 330型傅立葉變換紅外光譜儀：美國Thermo Electron公司。

1.2 方法

1.2.1 二酚酶抑制活性測定

根據文獻[29]對酪氨酸酶活力進行測定，原理是基于L-DOPA經酪氨酸酶催化生成的黑色素在475 nm處有最大吸收峰，吸收系數ε=3 700 L/（cm·mol）。在1 cm比色皿中，臨時配制3 mL NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液（50 mmol/L，pH=6.8）測活體系：首先加入 0.1 mL不同濃度的抑制劑（溶于DMSO，終濃度為3.33%），然后加入2.8 mL經30℃水浴10 min的0.5 mmol/L的多巴底物，最后加入0.1 mL酪氨酸酶溶液（對照組為0.1 mL DMSO），立即混勻，測定反應體系的吸光度值隨時間變化的曲線，根據直線的斜率計算酶活力。

1.2.2 二酚酶抑制活性的動力學分析

運用上述3 mL測活體系，改變加入的酶量和抑制劑量，測定反應體系的酶活力，從而判定抑制劑對酪氨酸酶的抑制機理。通過改變加入的底物濃度，測定不同濃度抑制劑作用下的酪氨酸酶活力，經Lineweaver-Burk作圖，以所得直線的斜率和Y軸的截距分別對抑制劑濃度進行二次作圖，可求得抑制劑常數KI（游離酶）和KIS（酶－底物絡合物），從而判斷抑制劑對酪氨酸酶的抑制類型[22]。

1.3 數據統計與分析

采用Origin 8.0統計分析軟件進行數據整理和分析，用SPSS17.0軟件進行統計學顯著性分析，顯著差異水平：顯著（P＜0.05）；極顯著（P＜0.01）。

2 結果與分析

2.1 抑制劑的光譜表征

用紅外光譜和紫外光譜對化合物進行結構表征，P2Mo17Zn、P2Mo17Cu和 P2Mo17Fe的紅外譜圖（圖 1）和紫外譜圖（圖2）如圖所示。

圖1 P2Mo17Zn（A）、P2Mo17Cu（B）和P2Mo17Fe（C）的紅外譜圖Fig.1 IR spectrum of P2Mo17Zn（A），P2Mo17Cu（B）and P2Mo17Fe（C）

從紅外譜圖可以看出，在4 000 cm-1～400 cm-1范圍內可以觀察到有Dawson結構的特征吸收峰，以P2Mo17Fe為例：3 429.0 cm-1是水分子的彎曲振動、1 618.0 cm-1是O-H伸縮振動、1 062.5 cm-1對應P-Oa鍵反對稱伸縮振動、954.5 cm-1對應Mo-Od鍵反對稱伸縮振動、871.5 cm-1對應Mo-Ob鍵反對稱伸縮振動、790.5 cm-1對應Mo-Oc鍵反對稱伸縮振動。P2Mo17Zn和P2Mo17Cu在對應的波數范圍內也出現了相應的特征吸收峰，與參考文獻相符[26-27]。

圖 2 P2Mo17Zn（A）、P2Mo17Cu（B）和 P2Mo17Fe（C）的紫外譜圖Fig.2 UV spectrum of P2Mo17Zn（A），P2Mo17Cu（B）and P2Mo17Fe（C）

由圖2可看出，P2Mo17Zn、P2Mo17Cu和 P2Mo17Fe的紫外譜圖均在213 nm波長附近出現了強的吸收峰，對應于Dawson型結構多酸的特征吸收峰，與參考文獻相符[26-27]，說明所合成的化合物確實為Dawson型多酸。

2.2 抑制劑對酪氨酸酶二酚酶抑制活性的影響

P2Mo17Zn（A）、P2Mo17Cu（B）和 P2Mo17Fe（C）對酪氨酸酶的抑制效果如圖3所示。

圖3 P2Mo17Zn（A）、P2Mo17Cu（B）和P2Mo17Fe（C）對酪氨酸酶的抑制效果Fig.3 Inhibitory effects of P2Mo17Zn（A），P2Mo17Cu（B）and P2Mo17Fe（C）on tyrosinase

分別以P2Mo17Zn、P2Mo17Cu和P2Mo17Fe為抑制劑，研究其對酪氨酸酶二酚酶催化L-DOPA生成黑色素的活力的影響，由圖3可看出，隨著抑制劑濃度的增大，酪氨酸酶的相對酶活力不斷下降，存在明顯的劑量效應，說明P2Mo17Zn、P2Mo17Cu和P2Mo17Fe 3種化合物對酪氨酸酶均有明顯的抑制效果。根據抑制曲線可得導致酶活力下降50%時P2Mo17Zn、P2Mo17Cu和P2Mo17Fe的濃度（IC50）分別為 0.346 2、0.361 5、0.383 1 mmol/L，表明3種化合物對酪氨酸酶確實有明顯的抑制作用，且P2Mo17Zn對酪氨酸酶的抑制效果優于P2Mo17Cu，P2Mo17Cu優于P2Mo17Fe。

2.3 抑制劑對酪氨酸酶二酚酶的抑制機理

分別以不同濃度的P2Mo17Zn、P2Mo17Cu和P2Mo17Fe為抑制劑，改變加入的酶量，測定不同濃度抑制劑作用下酪氨酸酶的酶活力，結果如圖4所示。

由圖4可以看出，以酶活力對加入的酶量作圖，得到的一組直線均經過原點，且隨著抑制劑濃度的增加，直線斜率不斷減小，說明3種化合物對酪氨酸酶進行可逆抑制，即3種化合物均是與酶進行非共價可逆結合，從而降低酪氨酸酶的活力。

圖 4 P2Mo17Zn（A）、P2Mo17Cu（B）和 P2Mo17Fe（C）對酪氨酸酶二酚酶抑制機理的測定Fig.4 Inhibitory mechanism of P2Mo17Zn（A），P2Mo17Cu（B）and P2Mo17Fe（C）on tyrosinase

2.4 抑制劑對酪氨酸酶二酚酶的抑制類型及其抑制常數

在3 mL 50 mmol/L的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液（pH=6.8）測活體系中，通過改變加入的底物和抑制劑濃度，測定不同濃度抑制劑作用下酪氨酸酶酶活力，結果如圖5所示。

圖 5 P2Mo17Zn（A）、P2Mo17Cu（B）和 P2Mo17Fe（C）對酪氨酸酶二酚酶抑制類型及其抑制常數的測定Fig.5 Inhibitory types and the inhibitory constants of P2Mo17Zn（A），P2Mo17Cu（B）and P2Mo17Fe（C）on tyrosinase

通過Lineweaver-Burk雙倒數作圖，得到一組相交于一點的直線，交點非常接近Y軸，并且隨著抑制劑濃度的增加，直線斜率增大，米氏常數Km值增大，由此判斷3種化合物對酪氨酸酶的抑制類型為競爭型，即抑制劑與底物競爭酪氨酸酶的活性結合位點。進一步以直線的斜率對抑制劑的濃度作圖，從圖中可計算得到3種化合物對酪氨酸酶游離酶的抑制常數KI分別為 0.106 8、0.068 2、0.057 2 mmol/L（見圖 5插圖）。

3 結論

通過酶動力學方法研究3種不同過渡金屬取代的Dawson型磷鉬酸對酪氨酸酶二酚酶的抑制效果、機理以及類型。結果表明：3種化合物對酪氨酸酶均有明顯的抑制作用（與經典酪氨酸酶抑制劑熊果甙IC50=5.30 mmol/L[30]比較），其 IC50分別為 0.346 2、0.361 5、0.383 1 mmol/L。3種化合物對酪氨酸酶的抑制均屬于可逆競爭型抑制，抑制常數KI分別為0.106 8、0.068 2、0.057 2 mmol/L。綜合比較，P2Mo17Zn對酪氨酸酶的抑制作用優于其他兩種化合物。因此，本試驗可能為研制出更新穎、更安全有效的酪氨酸酶抑制劑，為擴展多金屬氧酸鹽的應用以及果蔬保鮮甚至色素沉著性疾病的治療提供有用信息。

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The Inhibition of Three Kinds of Dawson-type Heteropoly Acids on Tyrosinase

XIE Le-fang1，LI Li-li1，CHEN Bing-nian2，WANG Li1，*
（1.Food and Bioengineering College of Jimei University，Xiamen 361021，Fujian，China；2.YanWu Affiliated Hospital of Zhongshan Hospital Xiamen University（Xiamen University Hospital），Xiamen 361005，Fujian，China）

2017-01-16

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.038

國家自然科學基金項目（21371072）

謝樂芳（1992—），女（漢），在讀碩士研究生，研究方向：生物學。

*通信作者：王力，教授，博士，研究方向：多酸化學。