SERS檢測三聚氰胺的不確定度分析

劉曉瑩，鄭大威，張萍，*，師煒，林太鳳，王惠琴，曹智

（1.北京工業大學生命科學與生物工程學院，北京100124；2.北京市密云區食品藥品監督管理局，北京 101500）

SERS檢測三聚氰胺的不確定度分析

劉曉瑩1，鄭大威1，張萍1，*，師煒2，林太鳳1，王惠琴1，曹智1

（1.北京工業大學生命科學與生物工程學院，北京100124；2.北京市密云區食品藥品監督管理局，北京 101500）

不確定度是一類表征測試結果可靠性的重要參數，對于規范試驗操作具有重要意義。表面增強拉曼光譜技術（surface enhanced Raman spectroscopy，SERS）作為一種用于物質定性和半定量分析的分子振動光譜，具有快速、簡便和靈敏度高等特點，在食品安全與質量控制領域中廣泛應用。利用SERS技術對三聚氰胺進行測定試驗，并對該方法的不確定度進行分析。經辨識，確認715 cm-1處的峰為三聚氰胺的特征峰，該峰的峰強與三聚氰胺的濃度呈正相關。選取675 cm-1處的峰為內標峰，在0.1 μg/mL～5.0 μg/mL范圍內，以I715/I675和濃度為參數進行線性回歸分析。標準方程相關系數達到0.995 4，該方法的檢出限為0.068 6 μg/mL。圍繞標準工作曲線的建立，分析SERS測定三聚氰胺結果的不確定度來源并對其進行評定。通過不確定度分析，為確保測定結果的可比性與溯源性提供了參考價值。

表面增強拉曼光譜；三聚氰胺；不確定度

Abstract：Uncertainty is a class of important parameters to represent the reliability of the measurement results.It has an important significance to standardize the experimental operation.Surface enhanced Raman spectroscopy（SERS）is a molecular vibrational spectroscopy for both qualitative and semi-quantitative detection of analytes.Recently，SERS had been widely used in the food safety and quality control areas owning to its several merits of fast detection，simple sample preparation，high sensitivity，etc.The quantitative detection of melamine had been established using SERS，and the uncertainty of SERS method had been analyzed meanwhile.Melamine showed the characteristic Raman peak at 715 cm-1steadily when mixed with Au nanoparticles.And the peak intensity of 715 cm-1had a positive relationship with the concentration of melamine.Taken 675 cm-1as the internal standard peak，there was a linear regression between I715/I675and the concentration of melamine in the range of 0.1 μg/mL-5.0 μg/mL.The correlation coefficient was 0.995 4，and the detection limit reached 0.068 6 μg/mL.The major uncertainty of SERS method was calculated and which mainly arise from the establishing of the standard curve by the least square method.Uncertainty analysis of SERS method would be benefit for the comparability and traceability of the measurement results.

Key words：surface enhanced Raman spectroscopy；melamine；uncertainty

近年來，食品污染事件頻發，嚴重威脅著人類的身體健康。為了滿足現場快速檢測的需求，各種快速檢測方法在逐步建立。表面增強拉曼光譜技術（surface enhanced Raman spectroscopy，SERS）是指吸附在粗糙化金屬表面的待測樣品的拉曼信號顯著增強的一種拉曼技術[1]。因其具有快速、簡便、可實現無損檢測等特點，在食品領域中廣泛地應用于添加劑[2-5]、農獸藥殘留[6-8]及食品微生物污染[9-11]等方面的檢測。2008年突發三聚氰胺事件之后，有關部門調查發現，在許多食品中都出現了三聚氰胺非法添加現象。針對這一現象，已經有學者利用SERS技術建立三聚氰胺的快速檢測方法。陳安宇等[12]第一個采用增強拉曼檢測技術實現牛奶中三聚氰胺的快速檢測；徐晨曦[13]、湯俊琪[14]等也進行了相關方面的研究。程劼等[15]應用SERS技術，在5 min內實現對寵物飼料中三聚氰胺的快速檢測，發現在55個批次寵物飼料中，有7個含量超標的樣品，與傳統的氣相色譜質譜聯用法（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法相比，結果準確可靠。Cheng等[16]在30 min內實現對雞蛋中三聚氰胺污染的SERS檢測，為蛋制品的質量控制及市場流通監控提供可能。Mecker等[17]使用便攜式拉曼光譜儀測定7種食品中非法添加的三聚氰胺，在無需復雜的樣品處理前提下，實現對食品中非法添加三聚氰胺的現場快速鑒別。他們的研究為保障食品安全建立各類食品中三聚氰胺SERS檢測方法，但對保證測定結果可靠性的不確定度沒有進一步分析。

1978年由國際計量局提出不確定度概念，其意義是指與測量結果相關聯的，表征合理地賦予被測量之值的分散性的參數[18]，主要通過測定數據與已有信息來進行計算，具有可操作性，現多用于保證測定結果的可比性和溯源性[19]。不確定度分析對于物質測量至關重要，目前我國已經出臺相關政策，要求實驗室在物質測量方面進行不確定度分析[20]。在三聚氰胺檢測方面的不確定度分析，主要是針對于液相色譜方法[21]進行的，而對SERS檢測方面的研究比較少。本文根據國家技術監督局發布的JJF1059-2012《測量不確定度評定與表示》[18]，討論應用SERS方法檢測三聚氰胺過程中多種因素的不確定度，在實際工作中具有較高的參考價值。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

CAS108-78-1三聚氰胺標準品（純度99%）：sigma；AL204 電子天平：Mettler Toledd 公司；JW-1 型號便攜式拉曼光譜儀：北京芥微科技有限公司；超聲波清洗機：昆山市超聲儀器有限公司；UH4150紫外可見近紅外分光光度計：日本日立公司；動態光散射粒度儀：法國Cordouan公司。

1.2 三聚氰胺標準溶液的配制

配制過程見圖1。準確稱取0.010 0 g三聚氰胺標準品于容量瓶中，用超純水制成1 000 μg/mL母液。準確吸取1 mL母液于100 mL容量瓶中，用超純水制得10 μg/mL標準儲備液。用10 μg/mL標準儲備液配制出5.0、2.0、1.0、0.5、0.1 μg/mL 的標準工作液。配制過程中使用的10 mL和100 mL A級單標線容量瓶和1、2、5 mL A級分度吸管，均來自于BOMEX公司。

圖1 三聚氰胺標準溶液配制過程示意圖Fig.1 Preparation process of melamine standard solution

1.3 納米金溶膠的合成

參考Lee等[22]的文獻研究，本試驗采用檸檬酸鈉還原法合成SERS檢測用納米金溶膠。合成的納米金溶膠，呈紅棕色，紫外可見最大吸收峰在532 nm左右，平均粒徑為45 nm。

1.4 SERS檢測及數據分析

便攜式拉曼光譜儀（長寬高為45 cm×30 cm×20 cm）的檢測條件：激發光波長為785 nm，200 mW，掃描光譜范圍為 400 cm-1～1 800 cm-1，分辨率為 2 cm-1，積分時間為10 s，每個樣品重復掃描3次取平均值。取100 μL合成的金納米溶膠至樣品瓶內，再取10 μL樣品與其混勻后，立即檢測。利用便攜式拉曼光譜儀自帶軟件對原始圖譜進行基線校正、峰形擬合等預處理，以特征峰和內標峰的峰強比與質量濃度作線性擬合。數據處理及繪圖分別用GraphPad 5.0或Origin 8.0軟件進行。

2 結果與討論

2.1 三聚氰胺SERS圖譜及標準曲線的建立

不同質量濃度的三聚氰胺標準溶液經過基線校正的SERS原始圖譜見圖2。

由圖2（a）中可以看出，715 cm-1為三聚氰胺的特征峰，為三聚氰胺的環面內變形振動，其峰強度會隨著質量濃度的增加而逐漸增強。選取675 cm-1作為內標峰，以 I715/I675峰強比作線性擬合（見表1），圖 2（b）為計算得到I715/I675峰強比與質量濃度間的標準曲線。標準方程為 y=（0.816 8±0.154）x+（0.481 9±0.037 9），在0.1 μg/mL～5.0 μg/mL 內，其相關系數 r2=0.995 4。對標準方程進行顯著性檢驗，在顯著水平0.01下，計算得到P＜0.000 1，說明三聚氰胺的I715/I675峰強比與濃度間線性關系極顯著相關。

圖2 三聚氰胺標準溶液的SERS圖譜及標準曲線Fig.2 SERS spectra of melamine solution and standard curve

利用檢出限、精密度與準確度3個指標分別對檢測方法進行評價。檢出限主要是通過CL=KiSi公式[23]進行計算，式中Ki為置信因子，一般取值為3；Si為重復測量10次同一份濃度接近于空白值的標準溶液的標準偏差。本試驗用水配制三聚氰胺標準溶液，通過對溶劑重復測定10次，計算得到該方法的檢出限CL為0.068 6μg/mL。

精密度一般用相對標準偏差RSD[23]來表示，其公式為，式中：s為方法的標準偏差；Xi為第i次測定值；X為n次測定值的平均值；n為測定次數。通過對1.0 μg/mL三聚氰胺水溶液重復測定10次，計算得到該方法的RSD為0.126。

2.2 不確定度來源的評定

利用便攜式拉曼光譜儀進行三聚氰胺的SERS檢測過程中，主要是從三聚氰胺母液的配制、標準工作溶液的配制以及標準工作曲線線性擬合等方面引入不確定度。

2.2.1 配制母液產生的相對標準不確定度u1rel（X）[24]

配制母液產生的相對標準不確定度u1rel（X）主要包括標準品純度產生的相對標準不確定度u11rel（X）、稱量標準品產生的相對標準不確定度u12rel（X）和母液定容體積產生的相對標準不確定度u13rel（X）三部分。

2.2.1.1 標準品純度產生的相對標準不確定度u11rel（X）

三聚氰胺的純度≥99%，不確定度半寬a1=1%，可認為服從均勻分布，所以

其相對標準不確定度為

2.2.1.2 稱量標準品產生的相對標準不確定度u12rel（X）

稱量標準品時，使用的是分辨率為0.1 mg的電子天平，檢定證書中表明該天平的最大允許誤差為±0.1mg，采用均勻分布，所以

稱取三聚氰胺標準品的重量為10.0 mg，相對標準不確定度為

2.2.1.3 母液定容體積產生的相對標準不確定度u13rel（X）

1）容量瓶校準產生的標準不確定度u13-1（X）

根據JJG196-2006《常用玻璃量器檢定規程》[25]，10 mL容量瓶的容量允許誤差為0.020 mL，則：u13-1（X）=

2）容量瓶定容溫度與校準溫度不同產生的標準不確定度u13-2（X）

容量瓶的校準溫度為20℃，定容時假定實驗室溫度在（20±5）℃范圍內，水的膨脹系數為2.1×10-4/℃，則溫度變化引起的體積變化范圍為u13-2（X）=±5℃×

假定其為均勻分布，則定容母液時產生的標準不確定度為

其相對標準不確定度為

綜上分析，配制母液產生的相對標準不確定度為

2.2.2 配制標準工作溶液產生的相對標準不確定度u2rel（X）

配制工作液的過程中用到1、2、5 mL的A級分度吸管、10 mL和100 mL的A級容量瓶，其允許誤差分別為 0.008、0.012、0.025、0.020、0.10 mL。

試驗過程中用到的6個10mL容量瓶和1個100 mL容量瓶，按均勻分布考慮，，則單個10 mL和100mL容量瓶的標準不確定度分別為0.012 mL和，相對標準不確定度梯度稀釋中使用的1、2、5 mL分度吸管，按三角分布考慮，，則單個1、2、5 mL分度吸管的標準不確定

2.2.3 標準工作曲線線性產生的相對標準不確定度

表1 標準曲線數據集Table 1 The dataset of the standard curve

對表1采用最小二乘法分析，得到標準工作曲線線性方程：y=（0.816 8±0.015 4）x+（0.481 9±0.037 9），其相關系數r2=0.995 4。

一份三聚氰胺樣液平行測定兩次，其計算得到的所得到的I715/I675分別為y1=1.378 7和y2=1.329 7，利用擬合得到的標準工作曲線計算得到三聚氰胺的濃度x分別為1.098 μg/mL和1.038 μg/mL，平均值=1.068 μg/mL。由最小二乘法擬合標準曲線所引入的標準不確定度為

標準曲線數據集見表1。表1中的y為計算得到的不同質量濃度下三聚氰胺標準溶液的I715/I675，每個質量濃度重復測定3次。度為

標準工作液稀釋過程中，用1 mL分度吸管移取1 mL溶液共4次，其引入的相對標準不確定度為

用5 mL分度吸管移取5 mL溶液共1次，其引入的相對標準不確定度為

用2 mL分度吸管移取2 mL溶液共1次，其引入的相對標準不確定度為

綜上分析，配制標準工作溶液產生的相對標準不確定度為

式中：X0為三聚氰胺樣液的濃度；Xi為擬合工作曲線的第i個標準溶液濃度；a為擬合工作曲線的斜率；b為擬合工作曲線的截距；P為樣品平行測定次數，P=2；n為標準曲線測定總次數，每個標準溶液測定3次為參與擬合標準曲線的三聚氰胺標準溶液的平均濃度；yi為第i次標準溶液計算得到的I715/I675峰強比。

將各參數代入以上兩個公式中，得到s=0.1030，標準不確定度u3（X）=0.0972，由標準工作曲線計算的三聚氰胺溶液相對標準不確定度為0.0565。

2.2.4 擴展不確定度

各分量的相對標準不確定度見表2。

表2 各分量的相對標準不確定度Table 2 The relative standard uncertainty of each component

SERS測定三聚氰胺含量的相對合成標準不確定度為

取k=2、置信水平為95%的條件下，其相對擴展不確定度為

利用SERS技術測定1份未知濃度的三聚氰胺樣品，經計算得到該樣品的I715/I675為1.354 2，根據標準曲線估算其濃度為1.068 μg/mL，則其擴展不確定度為U（X）=Urel（X）×1.068=0.123 1 μg/mL。說明在95%的置信水平下，利用SERS測定該三聚氰胺樣品，其濃度為0.944 9 μg/mL～1.191 1 μg/mL。

3 結論

本文利用SERS方法對三聚氰胺進行檢測，并對不確定度進行了分析。該方法結果準確，滿足食品領域中快速檢測的需求；通過不確定度分析，表征測定結果的可靠性，發現配制標準工作液和確定標準工作曲線是產生不確定度的主要來源。因此在試驗過程中，應嚴格規范操作、增加測試數據量，以減小誤差對測定結果造成的影響。

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Uncertainty Analysis of SERS Determination of Melamine

LIU Xiao-ying1，ZHENG Da-wei1，ZHANG Ping1，*，SHI Wei2，LIN Tai-feng1，WANG Hui-qin1，CAO Zhi1
（1.College of Life Science and Bioengineering，Beijing University of Technology，Beijing 100124，China；2.Food and Drug Administration of Beijing Miyun District，Beijing 101500，China）

2017-01-22

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.035

劉曉瑩（1993—），女（漢），碩士研究生，研究方向：生物醫學工程。

*通信作者：張萍，副教授，博士，研究方向：拉曼光譜快速檢測。