高效液相色譜法測定豬腎臟中赭曲霉毒素A

李玉平，侯亞莉，程千川，蘇亮

（重慶市動物疫病預防控制中心，重慶401120）

高效液相色譜法測定豬腎臟中赭曲霉毒素A

李玉平，侯亞莉，程千川，蘇亮

（重慶市動物疫病預防控制中心，重慶401120）

建立高效液相色譜法測定豬腎臟中赭曲霉毒素A（OTA）的含量。采用免疫親和柱凈化，Zorbax SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱，乙腈-2%乙酸為流動相，激發波長（λem）為 332 nm，發射波長（λex）為 460 nm。結果顯示，赭曲霉毒素A在0.1 ng/mL～10 ng/mL范圍內線性關系良好（R2=0.999 9），平均加樣回收率為77.3%～84.4%，平均相對標準偏差（RSD）為0.8%～1.3%。該方法簡便、準確性好、靈敏度高，可用于豬腎臟中赭曲霉毒素含量的測定。

赭曲霉毒素A；免疫親和柱；高效液相色譜法

Abstract：The orhratoxin A（OTA）content in the kidney of pigs was determined by high performance liquid chromatography.The Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）column was used with the mobile phase of acetonitrile-2%acetic acid and the detection of extraction wavelength 332 nm and emission wavelength 460 nm，and purified by immunoaffinity column.The results showed that the OTA content had good linear relationship in the range of 0.1 ng/mL-10 ng/mL（R2=0.999 9），the average recovery was 77.3%-84.4%，and relative standard deviation （RSD）was 0.8%-1.3%.The method was simple，accurate and sensitive for the determination of ochratoxin in the kidney of pigs.

Key words：ochratoxin A；immunoaffinity column；high performance liquid chromatography

赭曲霉毒素A（ochratoxins A，OTA）是由曲霉菌屬和青霉菌屬的某些細菌產生的一種有毒真菌次生代謝產物[1]，對動物和人類具有腎臟毒性、肝毒性、致突變、致畸性、致癌性和免疫抑制作用[2]。OTA廣泛分布于各種飼料及飼料原料中，動物食用了含OTA的飼料后會導致體內蓄積，尤其是動物的肝臟、腎臟、肌肉及血液，殘留在動物產品中的OTA可通過食品鏈傳遞給消費者，進而嚴重威脅著人類的健康。

目前，檢測OTA常用方法有薄層色譜法（TLC）、酶聯吸附免疫法（ELISA）、高效液相色譜法（HPLC）和液相色譜-質譜聯用法（LC-MS/MS）[3-8]。TLC法為半定量方法，靈敏度較低、方法繁瑣、重復性差，且在提取過程中所需有機溶劑種類多、用量大，易污染環境，對人體也有較大危害。ELISA法測定結果受試劑盒種類、儀器靈敏度和實驗溫度等條件影響較大，假陽性率高。LC-MS/MS法省時、高效、靈敏，但成本高。HPLC法可進行定性和定量分析，靈敏度較高、回收率高、重復性好、定量結果準確，成為最常用的檢測方法。近年來，我國對谷類、糧食等植物產品方面采用HPLC法測定OTA含量的研究較多，也制定了相關的檢測標準和限量標準[9-10]，而對動物性產品中OTA檢測方面的研究報道較少，因此建立快速、靈敏、簡便的HPLC法，完善我國畜產品的OTA檢測標準和限量標準是有必要的。參考國外相關文獻[11-14]，本試驗建立了采用免疫親和柱凈化，高效液相色譜-熒光檢測法檢測豬腎臟中的OTA含量的方法。該方法操作簡便、檢測結果準確、可靠，可為我國動物產品制定檢測標準和限量標準提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

免疫親和柱：北京華安麥科生物技術有限公司；OTA標準品：美國Sigma公司；甲醇、乙酸、乙腈、乙酸乙酯：色譜純，美國Fisher公司；氯化鈉、碳酸氫鈉、吐溫-20：分析純，重慶邁克公司；水由Milli-Q純水儀制造。

1.2 儀器與設備

Waters e2695高效液相色譜儀-2475熒光檢測器：美國Waters公司；ML204電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；TTL-Dcll型氮吹儀：北京同泰聯科技發展公司；SIGMA 3K30高速離心機：德國SIGMA公司；SIR 4渦旋振蕩器：德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

OTA標準儲備溶液的配制：稱取適量的OTA標準品，用苯-乙酸（99∶1，體積比）配制成 0.10 μg/mL 的標準儲備溶液，于4℃冰箱內保存備用。

淋洗緩沖液：稱取12.5 g氯化鈉、5 g碳酸氫鈉溶于水中，加入0.1 mL吐溫-20，用水稀釋至1.0 L。

洗脫液：甲醇∶乙酸=49∶1（體積比）配制。

1.3.2 液相色譜分析條件

色譜柱：ZorbaxSB-C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；柱溫：30℃；流動相：乙腈-2%乙酸（45∶55，體積比）；流速：1.0 mL/min；熒光檢測器：激發波長（λex）332 nm，發射波長為（λem）460 nm；進樣量：50 μL。

1.3.3 樣品的提取

將樣品勻漿混勻，準確稱取2.0 g（精確到0.01 g）于50 mL離心管中，加入0.6 mL濃度為1.0 mol/L的磷酸溶液（調節pH值約至2.5），再加入5.0 mL乙酸乙酯，混勻。以4 000 r/min離心5 min，移出上清液，重復提取3次，合并3次上清液。上清液中加入5.0 mL濃度為0.5 mol/L的碳酸氫鈉（NaHCO3）試液，振蕩提取3 min，4 000 r/min離心5 min，棄去上層提取液。剩余的提取液中加正己烷適量，靜置，棄去正己烷層，用磷酸溶液調節pH值約至8.4，備用。

1.3.4 樣品的凈化

將免疫親和柱置室溫下預先平衡，加入提取液，調節流速不超過1.0 mL/min，使其緩慢通過免疫親和柱。待柱內液體流干后，加入10.0 mL淋洗緩沖液進行淋洗，棄去全部流出液。把柱內殘余液體抽干，加入3.0 mL洗脫液，收集洗脫液于玻璃刻度試管中，氮氣50℃下吹干。精密加入1.0 mL流動相溶解，過濾膜后，采用高效液相色譜法測定。

2 結果與分析

2.1 標準品及樣品溶液色譜圖

根據1.3.2下色譜條件、1.3.3和1.3.4項下方法操作，得出OTA標準品溶液和樣品溶液的色譜圖，結果見圖1。

圖1 標準品（A）和樣品（B）溶液色譜圖Fig.1 HPLC of standard（A）and sample（B）

由圖1可知，所得OTA色譜峰形對稱，基線平穩，且樣品中的OTA和雜質的分離度好。

2.2 標準曲線及回歸方程

將0.1 μg/mL的OTA標準儲備溶液，用流動相分別稀釋制成濃度為 0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、10.0 ng/L 的標準溶液。根據相應的峰面積和對應的檢測濃度制作標準曲線（見圖2），此標準曲線的相關系數為R2=0.999 9，回歸方程是y=144 488x-154.59。

圖2 赭曲霉毒素A標準曲線Fig.2 Standard curve of ochratoxin A

2.3 檢測限

將標準品溶液適當稀釋后制得一系列不同濃度的標準品溶液，進樣分析，以信噪比S/N=3時的質量濃度作為檢出限，測得OTA的檢出限為0.1 ng/mL。

2.4 精密度試驗

取1.0 ng/mL的標準品溶液，連續進樣6次，每次進樣50 μL，根據峰面積計算其相對標準偏差（RSD），結果見表1。

表1 精密度試驗結果Table 1 Results of precision assay

由表1可知，樣品檢測結果的RSD=0.7%，表明該方法的精密度良好。

2.5 回收率試驗

稱取樣品約2.0 g，分別加入濃度為0.5、1.0、5.0 ng/mL赭曲霉毒素A標準品溶液各1.0 mL，按照1.3.3、1.3.4項下方法操作，1.3.2下色譜條件進行測定，每個濃度平行測定3次，測定其加標回收率及RSD（%），結果見表2。

表2 樣品回收率試驗結果Table 2 Results of recovery assay

由表2可知，3個不同濃度的平均回收率為77.3%～84.4%，其標準偏差（RSD）為0.8%～1.3%，表明本方法的準確度高，可滿足檢測的要求。

2.6 樣品含量測定

稱取10份樣品，每份2.0 g（精確至0.01 g），按1.3.3和1.3.4項下的方法處理后，再用1.3.2下色譜條件進行測定。結果發現有4份樣品中含有OTA，其余未檢出，測得其含量分別為 0.151、0.225、0.185、0.201 ng/mL。

3 結論與討論

3.1 提取溶劑的選擇

赭曲霉素A（OTA）溶于極性溶劑和稀碳酸氫鈉溶液，微溶于水，試驗中選擇甲醇、乙腈、乙酸乙酯等作為提取溶劑，結果發現用乙酸乙酯提取回收率較高，結合試劑費用和安全性考慮，選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。此外，依據OTA溶于稀碳酸氫鈉溶液的物理性質，試驗中又采用了0.5 mol/L的碳酸氫鈉試液對乙酸乙酯提取液進行了提取，進而更好的保證了OTA的提取。

3.2 凈化條件的選擇

肉制品及內臟組織中赭曲霉毒素的測定比谷物類食品中要困難很多，因為要去除大量小分子的蛋白質、干擾肽、磷脂和其他干擾物質，本文采用選擇性高的免疫親和柱來除去多數雜質成分，且使用時不需要活化。但免疫親和柱具有選擇性吸附的特性，樣品在凈化過程中，某些具有生物活性的雜質也會有少量吸附于柱子上，因此試驗過程中預先采用正己烷對提取的樣品進行了脫脂處理，從而提高了親和柱對OTA的吸附。

3.3 流動相條件的選擇

流動相對樣品中待測組分的峰形、分離度及靈敏度均有影響，試驗中分別考察了乙腈-水、乙腈-2%乙酸和甲醇-2%乙酸3種流動相的效果，結果表明選用乙腈-2%乙酸峰形較好。同時比較了不同比例的乙腈-2%乙酸（45∶55，體積比）、乙腈-2%乙酸（55∶45，體積比）的效果。因考慮到出峰時間、峰形及組分分離效果，故最后確定乙腈-2%乙酸（45∶55，體積比）作為流動相。

本文建立了一種使用高效液相色譜法測定動物腎臟中OTA的檢測方法，結果表明，本方法簡便易行，靈敏度和準確度高，線性關系良好，可以滿足對樣品中此種毒素的檢測要求。

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Determination of Ochratoxin A in Kidney of Pigs by High Performance Liquid Chromatography

LI Yu-ping，HOU Ya-li，CHENG Qian-chuan，SU Liang
（Animal Disease Control and Prevention Center of Chongqing，Chongqing 401120，China）

2017-02-17

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.033

李玉平（1986—），女（漢），獸醫師，碩士，從事獸藥質量及獸藥殘留檢測及研究工作。