間接阻抗法檢測酸性罐藏食品商業無菌的研究

杜寒春，葉開富，劉紹剛，徐蟬，蘇梅清，譚學才，*

（1.廣西壯族自治區分析測試研究中心，廣西南寧530022；2.廣西民族大學化學化工學院，廣西高校食品安全與藥物分析化學重點實驗室，廣西南寧530008）

間接阻抗法檢測酸性罐藏食品商業無菌的研究

杜寒春1，葉開富1，劉紹剛2，徐蟬1，蘇梅清1，譚學才2，*

（1.廣西壯族自治區分析測試研究中心，廣西南寧530022；2.廣西民族大學化學化工學院，廣西高校食品安全與藥物分析化學重點實驗室，廣西南寧530008）

建立間接阻抗法快速檢測酸性罐藏食品商業無菌的方法。選取酸性罐藏食品中易污染的多粘芽孢桿菌、腸膜明串珠菌和異常漢遜酵母作為試驗菌株，對間接阻抗法的臨界值、適用性、靈敏度、測量持續時間及罐頭樣品取樣量等應用條件進行研究，并與國標法GB 4789.26-2013《食品安全國家標準食品微生物學檢驗商業無菌檢驗》進行比對。研究表明，建立的間接阻抗法與國標法的檢測結果完全一致，但比常規方法縮短7 d，3 d內即可判定樣品是否為商業無菌。

間接阻抗法；酸性罐藏食品；商業無菌

Abstract：A method for rapid detection of commercial sterility in acid canned food was established by indirect impedance method.The microorganisms which are easily contaminated in acid canned foods，such asPaenibacillus polymyxa，Leuconostoc mesenteroidesandHansenula anomalawere selected as experimental strains to study of the threshold，applicability，sensitivity，measurement duration and sample volume of canned food of the indirect impedance method.Compared with the national standard method GB 4789.26-2013＜National food safety standard Food microbiological examination：Examination of commercial sterility＞，the study showed that the testing results of the indirect impedance method were completely consistent with that of national standard method.Meanwhile，the detection time was shorter than that of conventional method of 7 days.The sample could be determined whether is commercial sterility within 3 days.

Key words：indirect impedance method；acid canned food；commercial sterility

罐藏食品是我國食品工業最重要的出口產品，在國際市場上幾乎處于壟斷地位[1]。在食品安全問題日益嚴峻和競爭日益激烈的今天，保證其質量安全衛生尤為重要。罐藏食品依據pH值的不同可分為低酸性罐藏食品和酸性罐藏食品。其中酸性罐藏食品是指殺菌后平衡pH值小于或等于4.6的罐藏食品，其商業無菌的檢驗是通過將樣品保溫觀察10 d后，再做內容物感官檢驗、pH值測定和涂片鏡檢，以確證罐頭食品中有無微生物增殖[2]。其檢驗過程要求較長的保溫時間，此外還需要大容量的培養設備，顯然該方法已無法滿足現代食品質量安全檢測的要求，很有必要尋找一種快速的能與傳統商業無菌檢驗等同效果、但更為準確、快速的檢測方法。

微生物自動快速檢測系統BacTrac4300是基于電阻抗原理設計生產的一種微生物快速檢測儀，通過測量微生物代謝引起的電特性變化來測定樣品微生物含量[3]。根據測量技術原理，電阻抗法又可分為直接阻抗測量法和間接阻抗測量法。間接阻抗法是通過檢測微生物代謝產生的CO2引起的阻抗變化來記錄微生物活力水平。在這個過程中，微生物產生的CO2被電極周圍的KOH溶液吸收，生成碳酸鉀，因而增加溶液的電阻抗。因此測量信號指示的是一個負進程，適合于檢測產氣芽殖微生物[3-4]。酸性罐藏食品中的腐敗菌主要有耐酸芽孢菌、非芽孢耐酸菌、酵母及霉菌[5-13]，均代謝產生終產物CO2，適合采用間接阻抗法。目前間接阻抗法已被應用于檢測食品中的金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、植物乳桿菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌、熱帶假絲酵母和枯草芽孢桿菌等微生物[4，14-18]，而在酸性罐藏食品商業無菌快速檢測中的應用卻鮮有報道。

擬選取酸性罐藏食品中易污染的多粘芽孢桿菌、腸膜明串珠菌和異常漢遜酵母作為試驗菌株，對間接阻抗法在酸性罐藏食品商業無菌的應用進行探索和研究，以期建立一種快速、靈敏、準確、可靠的快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多粘芽孢桿菌（CICC 22649）、腸膜明串珠菌（CICC 21861）：中國工業微生物菌種保藏管理中心；異常漢遜酵母（GIM2.94）：廣東省微生物菌種保藏中心。

酸性肉湯、麥芽浸膏湯、營養瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂、結晶紫染色液、蛋白胨緩沖液：北京陸橋技術有限責任公司；氯化鈉、含4%碘的乙醇溶液、氫氧化鉀（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

微生物自動快速檢測系統BacTrac4300：奧地利SY-LAB公司；HVE-50全自動高壓滅菌鍋：Hirayama Manufacturing Corporation；PL602-S 電子天平、SG2 型pH計：梅特勒－托利多儀器有限公司；HH·B11電熱恒溫培養箱：上海躍進醫療器械廠；BCD-226STV冰箱：青島海爾股份有限公司；AESAP1068拍擊式均質器：法國AES公司；VORTEX-GENIE 120渦旋振蕩器：美國SCIENTIFIC INDUSTRIES公司；BX51熒光顯微鏡：日本OLYMPUS公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 常規方法

按GB 4789.26-2013《食品安全國家標準食品微生物學檢驗商業無菌檢驗》[2]進行檢驗。

1.3.2 間接阻抗法

1.3.2.1 試驗菌液的制備

取試驗菌株多粘芽孢桿菌接種于酸性肉湯培養基，36℃培養24 h；腸膜明串珠菌接種于酸性肉湯培養基，異常漢遜酵母接種于麥芽浸膏湯培養基，36℃培養72 h。將各培養物用無菌生理鹽水進行10倍系列稀釋，備用。

1.3.2.2 開啟酸性罐藏食品并制備樣品液

參照GB 4789.26-2013《食品安全國家標準食品微生物學檢驗商業無菌檢驗》[2]中的6.1、6.2、6.4方法開啟酸性罐藏食品，液體酸性罐藏食品搖勻后可直接作為樣品液使用，固體酸性罐藏食品稱取25 g，兩者皆有時則各取12.5 g加至225 mL滅菌蛋白胨緩沖液中進行均質混勻得到樣品液。

1.3.2.3 臨界值的確定

在聚苯乙烯測量瓶中加入1 mL新鮮制備的0.2%KOH溶液，各取1 mL試驗菌液分別接種至裝有5 mL相應培養基的內瓶中，內瓶完全開放，立即旋緊測量瓶，于15 min內將其放入BacTrac4300培養箱中進行檢測。各測量參數預設為培養溫度：36℃，測量間隔時間：10 min，測量持續時間：72 h，預熱時間：1 h，臨界值：-25%M，得到各試驗菌液測量曲線。另選取市場多種常見的酸性罐藏食品滅菌后，開啟，取1 mL樣品液接種至裝有5 mL酸性肉湯培養基的內瓶中，另取1 mL樣品液接種至裝有5 mL麥芽浸膏湯培養基的內瓶中，在相同條件下進行試驗，得到陰性樣品產生的基線最大漂移值。

1.3.2.4 間接阻抗法的適用性及靈敏度試驗

將臨界值更改為1.3.2.3確定得到的數值-45%M，其余參數不變，取1 mL系列稀釋的各試驗菌液分別按1.3.2.3的方法進行阻抗法檢測，記錄到達臨界值的阻抗檢測時間（Impedance Detection Time，IDT），同時將試驗菌液按GB 4789.2-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[19]進行平板菌落計數。以菌落總數的對數log（CFU）為縱坐標，對應的IDT值為橫坐標，將數據輸入系統自帶的數據處理軟件中即可得到標準曲線和回歸方程。

1.3.2.5 酸性罐藏食品的檢測

各取3 mL被測樣品液分別接種至裝有3 mL酸性肉湯培養基和3 mL麥芽浸膏湯培養基的內瓶中進行檢測，各測量參數設置為：培養溫度：36℃，測量間隔時間：10 min，測量持續時間：72 h，預熱時間：1 h，評價類型：M2；臨界值：-45%M。

1.3.2.6 留樣

按GB 4789.26-2013《食品安全國家標準食品微生物學檢驗商業無菌檢驗》中的6.5項進行留樣。

1.3.2.7 感官檢查和pH值測定

按GB 4789.26-2013《食品安全國家標準食品微生物學檢驗商業無菌檢驗》中的6.6、6.7項對酸性罐頭食品內容物進行感官檢查和pH值測定。

1.3.2.8 涂片染色鏡檢

按GB 4789.26-2013《食品安全國家標準食品微生物學檢驗商業無菌檢驗》中的6.8項對留樣內容物和內瓶的培養液進行涂片染色鏡檢。

1.3.2.9 結果的判定

檢測結束后，當儀器測量結果為無IDT值時，表明被測酸性罐藏食品中無微生物增殖，經感官檢查、pH值測定、涂片染色鏡檢確證無微生物增殖現象時，可報告該被測酸性罐藏食品為商業無菌；當儀器測量結果IDT＞0時，表明被測酸性罐藏食品中有微生物增殖，經感官檢查、pH值測定、涂片染色鏡檢確證有微生物增殖現象時，可報告該被測酸性罐藏食品為非商業無菌。

2 結果與分析

2.1 間接阻抗法的臨界值的確定

儀器在測量過程中將生成兩種測量信號值：M值和E值。其中M值是指相對初始值的培養基電阻抗的相對下降百分率（%）。而E值指相對初始值的電極阻抗變化值，受培養基成份的影響不大。根據儀器操作手冊，間接阻抗法應選擇M值為檢測信號值，推薦臨界值為-25%M。將試驗菌株進行驗證試驗，得到異常漢遜酵母的測量曲線（圖1所示），多粘芽孢桿菌和腸膜明串珠菌的測量曲線與異常漢遜酵母的相似，可見菌株的M值曲線類似微生物的生長曲線，可確定以M值作為檢測信號值。

圖1 異常漢遜酵母間接阻抗法測量曲線Fig.1 Measuring curve ofHansenula anomalaby indirect impedance method

選取什錦水果罐頭、黃桃罐頭等13種酸性罐頭食品滅菌后作為陰性樣品，經檢測各陰性樣品基線最大漂移值分別為：什錦水果罐頭、梨罐頭、水黃桃罐頭、楊梅罐頭、桔子罐頭、蜜桔罐頭、杏罐頭：-25%M；草莓罐頭、黃桃罐頭：-45%M；山楂罐頭、菠蘿罐頭、柑橘罐頭：-20%M；芒果汁罐頭：-10%M。圖2為黃桃罐頭檢測曲線，可見陰性樣品的基線最大漂移值為-45%M，因此最終確定間接阻抗法的臨界值為-45%M。

圖2 陰性樣品黃桃罐頭測量基線Fig.2 Measuring baseline of negative canned yellow peach

2.2 電阻抗法的應用條件研究

2.2.1 電阻抗法的適用性試驗

將各試驗菌株同時進行電阻抗法和平板計數法檢測，分別建立了標準曲線和回歸方程，如表1所示。

表1 試驗菌株的回歸方程及參數Table 1 Regression equations and parameters of experimental strains

結果表明各試驗菌株的標準曲線均具有特異性，由此說明電阻抗法對生長特性各不相同的菌株均能靈敏、準確地檢測出來，具有廣泛的適用性，適用于不同種類的、污染菌來源不明確的酸性罐頭食品商業無菌的檢測。

2.2.2 電阻抗法的靈敏度試驗

將各試驗菌株的菌懸液系列稀釋，使含菌量＜5 CFU/mL，作平行重復測試，靈敏度試驗結果見表2。

表2 靈敏度試驗結果Table 2 Experimental results of sensitivity

結果如表2所示，可見試驗菌株的5個平行值間無顯著差異（P＞0.05），將IDT值分別代入回歸方程，所得到的菌落數也相符，表明在菌落數很少的情況下，電阻抗法均能很靈敏地檢測出來。

2.2.3 測量持續時間的確定

含菌量1 CFU/mL的試驗菌株的檢測時間見表3。

表3 含菌量1 CFU/mL的試驗菌株的檢測時間Table 3 Detection time of the experimental strains containing1 CFU/mL

由表3可見各試驗菌株為1 CFU/mL時的最大IDT值均未超過72 h，參考儀器操作手冊推薦的測量持續時間48 h～72 h，最終將測量持續時間確定為72 h。

2.2.4 罐頭食品取樣量的確定

由于罐頭食品含菌量低，盡可能地加大取樣量可增加試樣的含菌量，提高檢測的靈敏度，縮短檢測時間。標準用于間接法的體積是：5 mL培養基和1 mL樣品溶液（樣品均質后），如果要擴大樣品量，則要加大培養基的濃度，根據儀器操作手冊，可將間接阻抗法的樣品加樣量確定為3 mL樣品溶液（樣品均質后）和3 mL雙料培養基。

2.3 間接阻抗法與常規方法檢測酸性罐頭食品的比對試驗

對同一生產批次的3罐酸性罐頭食品，取1罐用間接阻抗法進行檢測，另1罐按GB 4789.26-2013《食品安全國家標準食品微生物學檢驗商業無菌檢驗》保溫檢測，第3罐置2℃～5℃冰箱保存作為對照，結果如表4所示。

表4 間接阻抗法與常規方法檢測酸性罐頭食品的比對試驗結果Table 4 Comparison test results of acid canned food by indirect impedance method and conventional method

間接阻抗法的檢驗結果均為未檢出，按GB4789.26-2013《食品安全國家標準食品微生物學檢驗商業無菌檢驗》進行保溫觀察，也未見胖聽、泄漏、pH值和感官異常，涂片鏡檢確證也無微生物增殖現象，因此可判定15個樣品均為商業無菌。可見，間接阻抗法與常規檢測方法的結果完全一致，但比傳統方法縮短了7 d時間，且更為簡單、便捷。

3 結論

建立應用間接阻抗法快速檢測酸性罐頭食品商業無菌的方法，與傳統方法相比，不需要大容量的保溫設備，節省了實驗室的空間，且免去了繁瑣的操作步驟，3 d內即可完成全部檢測過程，比該方法縮短了7 d的時間，提高了檢測的效率。所采用的間接阻抗法與直接阻抗法相比，電極不接觸酸性罐頭樣品，不會被樣品腐蝕，減少了設備更換的速率；被測樣品不干擾阻抗測量，提高了檢測的準確度；且可采用傳統培養基，無需購買儀器原廠的培養基，大大節約了成本。方法還具有廣泛的適用性，適用于不同種類的、污染菌來源不明確的酸性罐頭食品商業無菌的檢測。本方法與低酸性罐藏食品商業無菌快速檢測方法相結合[20]，形成了系統的電阻抗法快速檢測罐藏食品商業無菌的方法體系。體系的建立將減少罐藏食品安全衛生檢驗檢疫的時間，加快罐頭進出口檢驗檢疫速度，對提升檢驗檢疫機構此項的檢驗能力，有很高的實用價值，有利于罐頭食品行業的發展。

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Study on Detection of Commercial Sterility in Acid Canned Food by Indirect Impedance Method

DU Han-chun1，YE Kai-fu1，LIU Shao-gang2，XU Chan1，SU Mei-qing1，TAN Xue-cai2，*
（1.Guangxi Center for Analysis and Test Research，Nanning 530022，Guangxi，China；2.School of Chemistry and Chemical Engineering of Guangxi University for Nationalities，Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Food Safety and Pharmaceutical Analytical Chemistry，Nanning 530008，Guangxi，China）

2017-02-07

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.022

廣西自然科學基金項目（2013GXNSFBA019048）；廣西科學研究與技術開發計劃項目（桂科能14123006-24）；國家自然科學基金項目（21367004、21667005）

杜寒春（1980—），女（漢），高級工程師，碩士，研究方向：食品質量安全與檢測。

*通信作者