響應(yīng)面分析法優(yōu)化山楂多糖的提取工藝

李丹丹，周杰，牟德華，李艷，曹燦，王巍

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018；2.河北冠卓檢測(cè)科技有限公司，河北石家莊050000）

響應(yīng)面分析法優(yōu)化山楂多糖的提取工藝

李丹丹1，周杰2，牟德華1，李艷1，曹燦1，王巍1

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018；2.河北冠卓檢測(cè)科技有限公司，河北石家莊050000）

以山楂為原料，對(duì)山楂多糖的影響因素及工藝進(jìn)行優(yōu)化研究。采用熱水浸提方法，分析提取時(shí)間、溫度、液料比對(duì)提取山楂多糖的影響。采用硫酸-苯酚法測(cè)定山楂多糖，根據(jù)響應(yīng)面進(jìn)行優(yōu)化分析，確定山楂多糖的最優(yōu)提取條件為：液料比25∶1（mL/g）、提取溫度90℃、提取時(shí)間93 min。該條件下山楂多糖的得率為53.77%。該提取工藝操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

山楂；多糖；提取工藝；響應(yīng)面分析法

Abstract：The extraction process for polysaccharide in hawthorn was optimized.With water as extraction solvent，the effect of extraction time，extraction temperature and liquid-solid ratio on the yield of polysaccharide were optimized with single factor test followed by response surface methodology.The results of optimal extraction conditions for polysaccharide was given.The solid-liquid ratio was 25∶1（mL/g），temperature was 90℃，the extraction time was 93 min.Under this condition，the extraction yield of hawthorn polysaccharide was 53.77%.The extraction process was simple and reasonable，suitable for industrial production.

Key words：hawthorn；polysaccharides；extraction process；the response surface methodology

山楂為薔薇科蘋(píng)果亞科落葉灌木山里紅和北山楂的干燥成熟果實(shí)。山楂果實(shí)中含有糖類、氨基酸類、黃酮類化合物、黃烷及其聚合物類、三萜類化合物和有機(jī)酸類等多種化學(xué)成分[1-3]，具有抗氧化、降壓、降血脂、防癌、抗菌消炎等方面功效，是一種藥食兼用的水果[4-5]。

多糖作為生命有機(jī)體的重要組成部分，對(duì)維持生命所需的多種生理功能有很重要的意義。目前對(duì)多糖的研究可知，多糖具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、降血糖、降血脂等一系列的生物活性[6-10]，這對(duì)于藥物的研發(fā)和食品的加工很有幫助，所以近年來(lái)，功能性多糖的研究越來(lái)越受到受關(guān)注。本研究以山楂為研究對(duì)象，以水溶性多糖得率為指標(biāo)，對(duì)山楂多糖的提取工藝進(jìn)行了單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化，探討其多糖提取最佳工藝條件，為深入開(kāi)發(fā)山楂資源提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

鮮山楂：河北省興隆縣大果山楂。

1.1.2 試劑

葡萄糖（AR）：天津市百世化工有限公司；濃硫酸（AR）：新光化工試劑廠；苯酚（AR）：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.1.3 儀器

KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器：中國(guó)江蘇昆山市超聲儀器有限公司；JJ1000型精密電子天平：美國(guó)雙杰兄弟集團(tuán)有限公司；101-OAB型電熱鼓風(fēng)干燥箱：中國(guó)天津市泰斯特儀器有限公司；V-5000可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海市元析儀器有限公司；QL-901型渦旋振蕩器：海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料預(yù)處理

將鮮山楂果洗凈，去核、切成薄片后在50℃下干燥至恒重，研磨過(guò)120目篩子，稱重備用。

1.2.2 多糖提取工藝路線

準(zhǔn)確稱取4.00 g山楂粉，按一定的液料比加蒸餾水，恒溫水浴浸提，抽濾取濾液，用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量。

1.2.3 多糖的測(cè)定

分別移取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，分別置于6支潔凈的試管中，加入蒸餾水補(bǔ)充至2 mL，按順序依次加入1 mL 5%的苯酚溶液，搖勻，分別迅速加入濃硫酸5 mL，用渦旋振蕩器搖勻，室溫靜置10 min，然后20℃水浴20 min。以不加葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的試管作為對(duì)照，在波長(zhǎng)為490 nm處測(cè)定其它試管的吸光度。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為X軸，測(cè)得的吸光度為Y軸，繪制葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線。直線方程為y=0.013 3x+0.066 8（R2=0.999）。

先將山楂多糖的提取液分別吸出0.2mL于100mL的容量瓶中定容、搖勻，在從稀釋后的液體中分別取出2 mL于潔凈的試管中，按順序依次加入1 mL 5%的苯酚溶液，搖勻，分別迅速加入濃硫酸5 mL，用渦旋振蕩器搖勻，室溫靜置10 min，然后20℃水浴20 min，在波長(zhǎng)為490 nm處測(cè)定其它試管的吸光度。

1.2.4 山楂多糖得率的計(jì)算

式中：C為稀釋后溶液的濃度，μg/mL；V為提取液的體積，mL。

1.2.5 單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取4.00 g山楂粉，加入一定體積蒸餾水，水浴加熱浸提一定時(shí)間，抽濾得提取液，用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量。分別以液料比、提取溫度和提取時(shí)間3個(gè)因素為對(duì)象，考察其對(duì)山楂多糖得率的影響。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

采用Design-Expert6.0.10Trial軟件中的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。選擇提取時(shí)間A、溫度B、液料比C，3個(gè)因素作為試驗(yàn)因素，以山楂總糖得率為響應(yīng)值，從而確定最佳提取條件。

1.2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了進(jìn)一步考察優(yōu)選工藝的可靠性和穩(wěn)定性，精密稱取4.00 g山楂粉，在1.2.6確定的工藝條件下進(jìn)行3次試驗(yàn)，驗(yàn)證所提取條件優(yōu)化的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

提取時(shí)間對(duì)多糖得率影響如圖1所示。

圖1 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.1 The effect of extraction time on the yield of hawthorn polysaccharide

多糖的得率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，提取時(shí)間為2 h多糖的得率達(dá)到最大可以達(dá)到50.06%，但是120 min以后延長(zhǎng)時(shí)間對(duì)多糖的得率沒(méi)有太大的影響。

2.1.2 提取溫度對(duì)多糖得率的影響

提取溫度對(duì)多糖得率影響如圖2所示。

圖2 溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.2 The effect of extraction temperature on the yield of hawthorn polysaccharide

多糖的得率隨著溫度的升高不斷的增加，60℃～80℃，多糖的增加量顯著，80℃之后隨溫度的增加，多糖的增加量變化不明顯。主要是由于用水作為溶劑提取多糖時(shí)，隨著溫度的升高，分子的熱運(yùn)動(dòng)加劇，分子的擴(kuò)散速度增加，越來(lái)越多的多糖分子進(jìn)入到水中，所以多糖得率會(huì)不斷增加。

2.1.3 液料比對(duì)多糖得率的影響

液料比對(duì)多糖得率影響如圖3所示。

圖3 液料比對(duì)多糖得率的影響Fig.3 The effect of liquid-solid rate on the yield of hawthorn polysaccharide

隨著液料比的增加多糖的得率有一個(gè)先增加后趨于平緩的一個(gè)趨勢(shì)，10（mL/g）～30（mL/g）之間時(shí)多糖的得率是逐漸增加的，30（mL/g）之后趨于平緩。這是由于提取劑用量逐漸增大時(shí)，有效成分在提取劑中的濃度降低，物料及提取劑邊界層的有效成分濃度差變大，主動(dòng)擴(kuò)散力增大，當(dāng)多糖的溶出量幾乎接近最大時(shí)繼續(xù)增加提取劑的用量不再起明顯的作用。

2.2 山楂多糖提取響應(yīng)面法優(yōu)化分析

2.2.1 優(yōu)化處理

為了確定提取多糖試驗(yàn)的最優(yōu)條件，在響應(yīng)面分析軟件中設(shè)定液料比、提取溫度和提取時(shí)間這3個(gè)因素的取值范圍如表1，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素和水平編碼值Table 1 Coded factors and levels in quadratic regression rotational combinational design

表2 響應(yīng)面分析的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface analysis design matrix and experimental results

利用響應(yīng)面分析法對(duì)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到一個(gè)擬合二次多項(xiàng)式方程。該二次多項(xiàng)式方程為：得率=-216.840 75+1.880 15A+0.707 83B+9.987 25C-6.068 89×10-3A2+4.605 00×10-3B2-0.169 98×C2-7.541 67×10-3AB-2.916 67×10-3AC-0.011 700×BC

2.2.2 模型方差分析

方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for fitted quadratic polynomial model

由表3可知，該方程模型是顯著的，失擬項(xiàng)比F值不顯著，方程的F值為6.45，P＜0.1，表示該因素對(duì)山楂多糖提取量影響是顯著的。由表3可知，A、B、A2、C2項(xiàng)的影響是顯著的，而C、B2、AC、AB和BC項(xiàng)山楂多糖提取量影響是不顯著的。3個(gè)試驗(yàn)條件（A：提取時(shí)間；B：溫度；C：液料比）對(duì)提取量影響的主次順序?yàn)椋築＞A＞C。

2.2.3 響應(yīng)面分析

山楂多糖提取工藝中提取時(shí)間、溫度和液料比3個(gè)因素之間交互作用對(duì)山楂多糖得率的影響見(jiàn)圖4、圖 5、圖 6。

由圖4、圖5、圖6可知，每個(gè)因素都有雙向增長(zhǎng)，即因素值增大則響應(yīng)值增大；當(dāng)因素取值增大到一定值時(shí)，響應(yīng)值達(dá)到極值，之后隨著因素的增大，響應(yīng)值逐漸減?。煌ㄟ^(guò)對(duì)3個(gè)圖形對(duì)比來(lái)看，溫度（B）對(duì)水浴法提取多糖的影響最為顯著。通過(guò)對(duì)響應(yīng)面圖的分析得出山楂多糖的最優(yōu)提取條件為：液料比25∶1（mL/g）、溫度90℃、提取時(shí)間93 min，最優(yōu)條件下多糖的得率為53.77%。

圖4 提取時(shí)間和溫度對(duì)山楂多糖得率的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plot showing the effects of extraction time and temperature on the yield of hawthorn polysaccharide

圖5 提取時(shí)間和液料比對(duì)山楂多糖得率的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plot showing the effects of extraction time and liquid-solid rate on the yield of hawthorn polysaccharide

圖6 提取溫度和液料比對(duì)山楂多糖得率的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plot showing the effects of extraction temperature and liquid-solid rate on the yield of hawthorn polysaccharide

2.2.4 響應(yīng)面分析法預(yù)測(cè)值的驗(yàn)證

按照響應(yīng)面軟件得到的最優(yōu)條件，在最優(yōu)條件下進(jìn)行3組平行試驗(yàn)驗(yàn)證其可靠性。由響應(yīng)面分析法可得到優(yōu)化的試驗(yàn)條件：液料比25∶1（mL/g）、溫度90℃、提取時(shí)間93 min，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，測(cè)提取多糖得率分別為53.76%、53.78%和53.78%，平均值為53.77%。試驗(yàn)證明，此工藝穩(wěn)定，重復(fù)性好。

3 結(jié)論

利用水提法提取多糖具有能耗低、省時(shí)、不破壞有效成分等優(yōu)點(diǎn)，該工藝合理、成熟，有較高的開(kāi)發(fā)價(jià)值。通過(guò)單因素試驗(yàn)以及響應(yīng)面優(yōu)化，試驗(yàn)提取出各因素對(duì)山楂多糖提取效果的影響程度為提取溫度＞提取時(shí)間＞液料比。確定山楂多糖水提法提取多糖最佳工藝條件為：液料比 25∶1（mL/g）、溫度 90℃、提取時(shí)間93 min。

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Optimization of Extraetion of Polysaccharides from Hawthorn Using Response Surface Methodology

LI Dan-dan1，ZHOU Jie2，MOU De-hua1，LI Yan1，CAO Can1，WANG Wei1
（1.College of Bio-engineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，Hebei，China；2.Hebei Guanzhuo Detection Co.，Ltd.，Shijiazhuang 050035，Hebei，China）

2016-03-18

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.010

河北省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（17237103D）

李丹丹（1981—），女（滿），副教授，博士，研究方向：碳水化合物與生物技術(shù)研究。