近紅外量子點表皮生長因子單克隆抗體熒光探針對金黃地鼠頰黏膜癌變過程的動態可視化熒光成像研究

張國棟，王海琴，呂 潔，陳 健，金邵華，胡 軍，張德保

（1.南華大學第一附屬醫院口腔科，湖南 衡陽 421001；2.衡陽市中心醫院藥劑科，湖南 衡陽 421001）

·基礎研究·

近紅外量子點表皮生長因子單克隆抗體熒光探針對金黃地鼠頰黏膜癌變過程的動態可視化熒光成像研究

張國棟1，王海琴2，呂 潔1，陳 健1，金邵華1，胡 軍1，張德保1

（1.南華大學第一附屬醫院口腔科，湖南 衡陽 421001；2.衡陽市中心醫院藥劑科，湖南 衡陽 421001）

目的 利用近紅外量子點表皮生長因子單克隆抗體熒光探針對由9,10-二甲基1,2苯并蒽 （9,10-dimethylen-1，2-benzanthracene，DMBA）誘導建立的金黃地鼠頰黏膜癌變過程進行動態可視化熒光成像研究。方法 （1）用0.5%DMBA丙酮液誘導建立金黃地鼠頰黏膜癌變各期模型；（2）將水溶性近紅外熒光量子點（QD800）表面功能性的修飾藕連表皮生長因子受體單克隆抗體（EGFR mAb)后，形成具有靶向功能性的QD800-EGFR mAb熒光探針；（3）將QD800-EGFR mAb經金黃地鼠各期癌變模型尾靜脈注射入血液循環系統以靶向適配原理顯示其頰黏膜動態癌變過程熒光圖像。結果 （1）QD800-EGFR mAb能夠通過血液循環系統與金黃地鼠頰黏膜癌變細胞上的EGFR特異性的靶向適配并熒光顯影；（2）QD800-EGFR mAb顯示的熒光圖像隨著金黃地鼠頰黏膜癌變程度的加深而增強，且能準確地顯示癌灶的形狀及浸潤深度。結論QD800-EGFR mAb通過與口腔癌不同癌變階段癌細胞表面的EGFR靶向性適配結合來顯示個體化熒光圖像，可能對以后臨床研究口腔癌的發生發展及轉移規律發揮巨大的影響。

9,10-二甲基1,2苯并蒽；金黃地鼠；近紅外量子點；表皮生長因子；單克隆抗體；靶向適配；口腔癌

口腔癌發病率占全身惡性腫瘤的第六位，其中90%是上皮來源的鱗狀細胞癌。目前倡導口腔癌的治療以手術、放療、化療、生物治療為主的綜合序列療法，但其5年生存率仍維持在50%左右[1]。影響口腔癌的預后因素不僅與腫瘤病理類型、生長位置、侵襲深度、頸淋巴結轉移狀態等瘤體自身因素有關外，亦與腫瘤的早期診斷、手術方式、術后評估等人為外在因素有關。目前由于人類倫理道德的限制，對于口腔癌在人類的發生機制、轉移途徑、侵襲深度、個體化治療及安全手術切緣等問題尚存很大疑惑。

本研究首先采用0.5%DMBA丙酮液誘導建立處于不同時期、不同階段的金黃地鼠頰黏膜癌變模型，其次將水溶性近紅外熒光量子點（near-infrared quantum dots，QDs）表面藕連單克隆抗體（mAb）表皮生長因子受體 (EGFR)，形成具有靶向功能性的QD800-EGFR mAb熒光探針；最后將QD800-EGFR mAb經尾靜脈注射入癌變模型血液循環系統內以抗原抗體靶向適配原理首次繪制出口腔癌癌變過程的動態可視化熒光圖像，為臨床進一步動態研究口腔癌發生發展及轉移機制打下基礎。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

1.1.1 實驗動物 敘利亞金黃地鼠40只，清潔級，雌雄各半，鼠齡4～6周，體質量 25～30 g，購于衛生部成都生物制品研究所，實驗動物生產許可證號：SCXK（川）2016003。

1.1.2 主要試劑 DMBA（Sigma公司，美國）；Qtrack erTM800 Cell Labeling Kit（Invitrogen公司，美國）；EGFR單克隆抗體（Abcam公司，英國）。

1.1.3 主要儀器 熒光分光光度計（RF-540，Shimadzu公司，美國）；冷凍低速離心機(Z233MK-2,HERMLE公司，德國)；激光共聚焦顯微鏡(TCS-SP5,Leica公司，德國)；In-Vivo FX Imaging System （Kodak 公司，美國）；倒置相差熒光顯微鏡(NIKON公司，TE2004-U,日本)。

1.2 造模方法及檢測

1.2.1 金黃地鼠頰黏膜癌變動態模型的建立[2]將40只金黃地鼠隨機分成實驗組（A）、對照組（B）兩組，每組20只。將A、B組金黃地鼠分別固定于自制鼠架上，拉開頰囊，用1號油畫筆在A組金黃地鼠雙側頰囊涂0.5%DMBA丙酮液，B組涂擦丙酮液，每周一、三、五涂擦，共計12周，所有動物涂擦后禁食、禁飲2 h。在實驗開始前及開始后每周日各挑選A、B組實驗動物各1只，取實驗頰囊組織行HE切片病檢確認癌變各階段。

1.2.2 近紅外量子點EGFR單克隆抗體熒光探針（QD800-EGFR mAb）的制備和純化 根據QtrackerTM800 Cell Labeling Kit提供的實驗步驟進行，簡述如下：（1）QD800的活化和洗脫：取37℃下預熱15 min 的雙功能 SMCC 溶液 14 μL，10 mmol/L 放入1.5 mL EP管中，加入混勻4 μmol/L的QD800 125 μL并在20℃下反應1 h，NAP-5柱洗脫反應液，收集有色洗脫液 500 μL。（2）EGFR還原和分離：在20℃下將1 mol/L DDT 6.1 μL與1 mg/mL EGFR單抗PBS液300 μL混勻反應30 min，然后加入20 μL雙蒸水稀釋好的CF750標記液。取500 μL NAP-5柱洗脫反應液。（3）偶聯和滅活：20℃下將（1）（2）洗脫液混勻反應 1 h，加入 10 mmol/L 硫代乙二醇3 μL滅活30 min。（4）濃縮和純化：將各盛有0.5 mL藕聯滅活液的2個超濾離心管以7 000 r/min離心15 min，用Pierce柱對離心膜內側溶液進行色譜分離即為純化的QD800-EGFR mAb探針。

1.2.3 金黃地鼠頰黏膜不同癌變階段的熒光可視化成像及信號強度比較 通過HE切片確認金黃地鼠正常頰黏膜、中度不典型增生、癌前病變、鱗癌等一系列癌變階段模型，2%戊巴比妥（40 mg/kg）行模型腹腔注射麻醉，將100 μL的QD800-EGFR mAb經尾靜脈依次注射入各個癌變階段模型內及相應對照組金黃地鼠體內，30 min時在In-Vivo FX Imaging System（像素設置為 1 024×1 024，曝光時間為50 ms，激發光/發射光為630/800 nm）下進行活體可視化熒光成像檢測，所獲圖像采用配套的Carestream MI軟件進行分析。本實驗將 QD800-E GFR mAb探針熒光設置為紅色，自發熒光為綠色，最后將其疊加分析。

1.2.4 QD800-EGFR mAb 熒光探針在癌變模型細胞中的分布 將實驗組中鱗癌模型成像完畢后立刻斷頸處死，解剖取其頰囊癌灶組織，盡量剔除正常黏膜、脂肪等組織，將癌灶組織迅速低溫冷凍包埋，并在-20℃下連續切割為8 μm厚的組織切片。在激光共聚焦顯微鏡下觀察量子點探針在癌灶組織中的分布情況，并與對照組比較。

1.3 統計學分析

實驗數據均采用軟件SPSS 13.0進行有效分析，結果以“±s”表示，t檢驗比較兩均數，3 個均數以上的比較采用方差分析，按P＜0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 金黃地鼠頰黏膜不同癌變階段模型的建立

常規HE染色病理檢查顯示，實驗組：為正常黏膜（0天）；出現中度不典型增生（2周）；出現癌前病變（6周）；有鱗癌（12周）。對照組：均為正常黏膜。詳見圖1-7。

圖1 肉眼觀察2周時金黃地鼠頰囊黏膜中度不典型增生

圖2 肉眼觀察6周時金黃地鼠頰囊黏膜癌前病變

圖3 肉眼觀察12周時金黃地鼠頰囊黏膜鱗狀細胞癌

圖4 正常金黃地鼠頰囊黏膜光鏡圖（HE×200）

圖5 2周時金黃地鼠頰囊黏膜中度不典型增生光鏡圖（HE×200）

圖6 6周時金黃地鼠頰囊黏膜癌前病變光鏡圖（HE×200）

2.2 金黃地鼠頰黏膜不同癌變階段的活體可視化熒光成像及信號強度比較

圖7 12周金黃地鼠頰囊黏膜鱗狀細胞癌光鏡圖（HE×200）

分別將100 μL QD800-EGFR mAb熒光探針經金黃地鼠尾靜脈注入正常、中度不典型增生、癌前病變、鱗癌等癌變模型內，每組模型5只，30 min時采集到的熒光信號清晰連續完整，且與肉眼下腫瘤的大小、形狀及浸潤深度對應吻合。對照組始終未出現明顯的熒光信號。將各組熒光信號強度值進行比較分析，發現QD800-EGFR mAb熒光探針在實驗組頰黏膜中的分布明顯大于對照組(P＜0.05)；癌前病變組及鱗癌組明顯大于中度不典型增生組（P＜0.05）；鱗癌組明顯大于癌前病變組（P＜0.05）。見圖 8-9。

圖8 金黃地鼠頰黏膜癌變不同階段的熒光可視化活體成像

圖9 30 min時所監測到的各組熒光信號強度值

2.3 QD800-EGFR mAb熒光探針在癌變模型細胞中的分布

實驗組鱗癌癌灶細胞中冰凍切片激光共聚焦顯微鏡可見有明顯的熒光探針殘留，對照組未見明顯熒光探針殘留。見圖10。

圖10 QD800-EGFR mAb熒光探針在癌變模型細胞中的分布激光共聚焦顯微圖

3 討論

目前研究證明，將近紅外QDS表面與腫瘤細胞表面靶向性配體偶聯后進行腫瘤細胞定位追蹤診斷技術是目前監測腫瘤早期發生、發展及轉移的最有效技術[3-5]。同時發現近紅外QDS表面功能化修飾后不僅沒有改變其獨特穩定的光學特性，還能極大降低其細胞生物毒性，增強其化學結構穩定性、生物機體相容性和靶向特異性，在體內外腫瘤細胞成像方面顯示出了極大的發展前景[6-10]。目前現有檢測癌癥敏感性較好的方法，如CT和MRI等，只有當癌細胞的數目達到數百萬個才能檢測出來[11]，而Cao等[12]用QD800標記BcaCD885癌細胞后，可在裸鼠的口腔頰黏膜下、皮下、肌肉內檢測到1×104個癌細胞，這證明用QD800成像較目前的CT和MRI對癌癥檢測的敏感性提高了100倍以上。據Gao等[13]預測，隨著具有更強組織穿透的近紅外量子點的發展，近紅外量子點標記的細胞將把敏感性提高到能檢測到體內10～100個細胞，同時該方法更加簡單易行，經濟方便，而且還適合在手術中對安全切緣的正確判斷及對殘留癌細胞的直接可視化判斷。

本研究首先采用0.5%DMBA丙酮液誘導建立起了一套完整的金黃地鼠頰部 “正常黏膜-中度不典型增生-癌前病變-鱗癌”癌變模型；然后將制備好的近紅外量子點EGFR單克隆抗體熒光探針（QD800-EGFR mAb）經過癌變模型尾靜脈注射入血液循環系統，根據QD800-EGFR mAb與癌細胞表面的EGFR主動靶向性適配結合，首次得出來了一套完整的活體生物體內癌變過程熒光圖像。同時實驗結果首次證實：（1）QDS進入血液循環系統后易被作為異物識別而被體內單核吞噬系統細胞所吞噬，從而大量聚集于富含單核吞噬系統細胞的肝脾等器官，這對軀體部位的腫瘤成像產生很大的干擾，但對缺乏單核吞噬系統細胞的口腔-頭頸部的成像無干擾，因此口腔-頭頸部是QDS的理想可視化成像部位；（2）口腔-頭頸部惡性腫瘤大多為鱗癌，而90%以上的口腔-頭頸部鱗癌細胞表面高表達EGFR[14]，因此以EGFR為靶點用QDS進行活體可視化成像對頭頸部鱗癌具有廣泛適用性；（3）QDS顯影隨著金黃地鼠頰黏膜癌變程度的加劇而擴大，并且形狀與肉眼下癌變相吻合，故可用于腫瘤的個體化成像研究及治療。綜上所述，QD800-EGFR mAb將在分子影像水平上對頭頸-口腔腫瘤的發生發展及轉移規律、侵襲深度、個體化治療、術后監測等方面開啟新的治療模式。

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（本文編輯 楊 瑛）

Visual Fluorescence Imaging of Golden Hamster Buccal Mucosa Cancerization Process Dynamic by Near Infrared Quantum Dot Epidermal Growth Factor Monoclonal Antibody Fluorescent Probe

ZHANG Guodong1,WANG Haiqin2,LV Jie1,CHEN Jian1,JIN Shaohua1,HU Jun1,ZHANG Debao1
(1.Department of Stomatology,the First Affiliated Hospital of University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China;2.Department of Pharmacy,Hengyang Central Hospital,Hengyang,Hunan 421001,China.)

Objective The dynamic visualization of fluorescence imaging of hamster buccal mucosa carcinogenesis process of induced by 9,10-bis(1,2 benzo anthracene(9,10-dimethylen-1,2-benzanthracene DMBA)were studied by using near infrared quantum dot epidermal growth factor monoclonal antibody fluorescent probe.Methods(1)The buccal mucosa carcinogenesis hamster models were induced with 0.5%DMBA acetone solution.(2)After forming the water soluble near-infrared fluorescent quantum dots (QD800)surface functional modification of the epidermal growth factor receptor monoclonal antibody(EGFR mAb),the targeted functional QD800-EGFR mAb fluorescent probe was formed.(3)The buccal mucosa dynamic carcinogenesis fluorescence images were formed through injection of QD800-EGFR mAb into the golden hamster carcinogenesis model tail vein.Results (1)QD800-EGFR mAb in blood circulatory system could combine with the EGFR specific target in golden hamster buccal mucosa cancer cells,and the fluorescence imaging lens was visual. (1)The fluorescence images showed by QD800-EGFR mAb were more clear with the deepening of the golden hamster buccal mucosa cancerization degree,and QD800-EGFR mAb fluorescent probe could accurately display the shape of the tumor and the depth of invasion.ConclusionThe individual fluorescence images are displayed by QD800-EGFR mAb combined with EGFR target in cancer cell surface atdifferentstagesofcanceration,which may play an effecton the clinicalfurtherresearch oforalcanceroccurrence development and transfer rules.

9,10-dimethylen-1,2-benzanthracene;golden hamster;near-infrared quantum dot;epidermal growth factor;monoclonal antibody;targeting adaptation;oral cancer

R781.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.09.007

本文引用：張國棟，王海琴，呂 潔，陳 健，金邵華，胡 軍，張德保.近紅外量子點表皮生長因子單克隆抗體熒光探針對金黃地鼠頰黏膜癌變過程的動態可視化熒光成像研究[J].湖南中醫藥大學學報，2017，37（9）：947-951.

2016-12-21

張國棟，男，碩士，主治醫師，主要從事口腔頜面部腫瘤的預防與治療，E-mail:457485360@qq.com。