密蒙花顆粒的急性毒性實驗研究

彭曉芳，王 英，覃艮艷，張又瑋，彭 俊，彭清華

（湖南中醫藥大學中醫眼科學重點學科，湖南 長沙 410208）

·方藥研究·

密蒙花顆粒的急性毒性實驗研究

彭曉芳，王 英，覃艮艷，張又瑋，彭 俊，彭清華*

（湖南中醫藥大學中醫眼科學重點學科，湖南 長沙 410208）

目的 觀察密蒙花顆粒對小鼠的急性毒性反應及死亡情況，為臨床應用安全性提供依據。方法 將30只小鼠分別用不同濃度及最大濃度密蒙花顆粒混懸液灌胃進行預實驗，觀察7 d未見小鼠死亡，無法測出LD50，故進行最大耐受量（MTD）的測定。將40只小鼠隨機分為給藥組和空白對照組，根據小鼠可承受的最大體積分別用最大混懸濃度的密蒙花顆粒和蒸餾水1 d內灌胃2次，連續觀察14 d，每天記錄小鼠的一般狀況、體質量，14 d后處死動物，測定小鼠的血常規指標，肝、脾、腎等主要臟器指數，觀察解剖學及病理組織學改變情況。結果 給藥組小鼠無死亡，與空白對照組比較，給藥組小鼠的體質量變化無顯著差異（P＞0.05），血常規指標與空白對照組亦無顯著差異（P＞0.05），小鼠密蒙花顆粒日最大耐受量為114 g/kg。結論 急性毒性結果表明，密蒙花顆粒臨床常用量是安全的。

密蒙花顆粒；急性毒性試驗；半數致死量；最大耐受量

隨著現代生活習慣及自然環境的改變，干眼癥的發病率越來越高，湖南中醫藥大學第一附屬醫院眼科專家彭清華教授經過長期的臨床實踐，組方密蒙花顆粒，該藥由密蒙花、枸杞子等六味藥組成，對于干眼癥有良好的臨床療效，為進一步開發該特色制劑，評價其安全性，我們對密蒙花顆粒進行急性毒性實驗研究，以期為臨床安全應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 實驗材料

1.1.1 受試藥物 密蒙花顆粒，主要成分為密蒙花、枸杞子等，購于湖南中醫藥大學第一附屬醫院門診部藥房，將單味中藥免煎顆粒組配。密蒙花顆粒每日臨床推薦用量為18 g，實驗前將本品配制成可供小鼠灌胃的最大濃度混懸液，每毫升相當于0.95 g生藥。

1.1.2 試驗動物 昆明種小鼠，70只，清潔級，18～24 g，雌雄各半，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供， 許可證號：SYXK （湘）2011-0003，SYXK （湘）2013-0004，小鼠用塑料盒群養，雌雄分籠，每箱≤11只，每天喂飼鼠用配合飼料，自由飲水，視情況更換籠具和墊料。飼料來源于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

1.2 主要儀器

C0006型電子分析天平 （日本AND公司），XN9000型希森美康XN全自動血液分析流水線(日本Sysmex公司)，4062型石蠟切片機（德國SLEE），CM1850型恒冷箱切片機（德國LEICA）水合氯醛（上海國藥集團生產），羅氏Cobas8000 CCM全自動生化免疫流水線（瑞士羅氏公司），真空采血管、一次性采血針，止血鉗、組織剪、有齒鑷等。

2 實驗方法

參照文獻[1-4]及《中藥藥理實驗方法學》的急性毒性實驗方法[5]。

2.1 預實驗

按照半數急性毒性實驗要求先進行毒性實驗預實驗預測本品的致死量 (LD50)[6]，取體質量18～24 g小鼠30只，隨機分3個組，每組10只，雌、雄各半，動物適應飼養3 d后，禁食不禁水12 h后，分別灌胃給予濃度 0.950 g/mL、0.475 g/mL、0.238 g/mL的密蒙花顆粒，小鼠灌胃可承受的最大體積(40 mL/kg)，1 d給藥3次，相當于三組小鼠日給藥劑量分別為 114 g/kg、57 g/kg、28.5 g/kg。 給藥后自由進食和飲水，連續觀察7 d，記錄小鼠死亡數。計算出零致死量(Dn)和全致死量(Dm)，進而計算出半數致死量[7-9]。

2.2 最大耐受量的測定

KM清潔級小鼠40只，試養1周后，按體質量隨機分為空白對照組和給藥組（每組20只），每組雌雄各半，禁食不禁水12 h后，給藥組以本品可供灌胃的最大濃度0.95 g/mL，小鼠灌胃可承受的最大體積 (40 mL/kg)，灌胃給藥1 d，24 h內給藥3次，經計算，最大耐受量倍數=(每只小鼠的耐受量/小鼠平均體質量20 g)×(成人平均體質量50 kg/成人每日用量18 g)，相當于成人臨床用量的317倍左右，給藥間隔時間4 h，間隔期間不供食，末次給藥4 h后自由進食和飲水，空白對照組給予等容積的蒸餾水，連續觀察14 d。

2.3 指標測定

觀察行為活動、肌肉運動、植物神經系統反應、呼吸及心血管、胃腸方面、皮膚顏色、眼及泌尿生殖系統等。

小鼠14 d觀察期結束后，摘除眼球取血，分別進行血常規白細胞(WBC)、紅細胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、血小板(PLT)、淋巴細胞比率(LYM%)的檢測。

取血完畢，解剖取肝、脾、腎等主要臟器精密稱質量，計算臟器指數：臟器指數(mg/g)=臟器質量/體質量；取腦、心、肝、脾、肺、腎、卵巢、睪丸、胃、小腸、視網膜等主要臟器，多聚甲醛固定，HE染色，進行組織病理學檢查。

2.4 統計學處理

3 結果

3.1 半數致死量實驗

在灌胃后7 d觀察時間內，小鼠一般狀態、行為活動、飲食情況、分泌物和排泄物等均未見明顯異常，未見小鼠死亡；7 d后，處死小鼠，肉眼觀察其腦、心、肝、脾、肺、腎、睪丸卵巢等主要臟器，均未見明顯的病理學變化。因無法測出密蒙花顆粒的半數致死量，故進行其最大耐受量實驗。

3.2 指標測定結果

3.2.1 小鼠一般情況觀察 小鼠一般狀況觀察實驗結果表明，實驗小鼠以密蒙花顆粒最大混懸濃度和可承受的最大體積1 d 3次灌胃給藥后，大部分小鼠出現喜靜臥，活動量減少、閉目、反應遲鈍、大便稍濕，但無豎毛、抽搐、翻倒等異常情況，對照組與給藥組情況類似，于第2天恢復正常，連續觀察14 d，小鼠無死亡情況出現。

3.2.2 對小鼠體質量的影響 小鼠體質量變化：給藥前，給藥組與對照組比較，雌、雄性小鼠體質量差異無統計學意義。給藥后，雄性小鼠，給藥組與對照組相比，體質量差異無統計學意義（P均＞0.05）；雌性小鼠，給藥組與對照組比較，體質量差異無統計學意義（P均＞0.05），說明給藥后，密蒙花顆粒對小鼠體質量無影響，詳見表1。

表1 給藥后小鼠體質量的變化 （g）

3.2.3 對小鼠血液學指標的影響 對小鼠血液學指標的影響由表2可知，給藥組小鼠血液學指標與對照組比較無顯著性差異(P＞0.05)。實驗結果表明，密蒙花顆粒以最大耐受量灌胃給藥對實驗小鼠血液學指標變化無明顯影響。

表2 兩組小鼠血常規相關指標的比較 (±s)

表2 兩組小鼠血常規相關指標的比較 (±s)

組別空白對照組給藥組n♂10♀10♂10♀10 WBC/×109·L-12.19±1.36 2.08±0.36 1.48±0.51 2.10±0.86 RBC/×1012·L-16.89±0.12 8.04±0.37 7.55±0.47 8.02±0.37 HGB/g·L-1103.33±6.89 124.00±4.44 117.00±9.45 126.00±5.96 PLT 239±159.21 330±171.86 464.33±194 260±147.29 LYM%67.7±5.93 53.88±18.21 44.33±20.54 59.88±18.21

3.2.4 對小鼠重要臟器系數的影響 給藥組肝體比值、脾體比值、腎體比值與對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），見表 3，表明密蒙花顆粒對大鼠的臟器重量及臟器/體質量比值無明顯影響。

表3 兩組小鼠給藥后肝臟、腎臟和脾臟與體質量的比值 (±s)

表3 兩組小鼠給藥后肝臟、腎臟和脾臟與體質量的比值 (±s)

組別n空白對照組給藥組♂10♀10♂10♀10肝體比0.057 9±0.005 1 0.060 6±0.004 5 0.056 7±0.003 1 0.065 2±0.003 7脾體比0.007 2±0.001 9 0.003 9±0.000 6 0.003 9±0.000 4 0.004 5±0.000 9腎體比0.019 0±0.001 5 0.014 8±0.000 7 0.019 3±0.002 3 0.016 4±0.001 1

3.2.5 病理組織學檢查 各組動物的腦、心、肝[10]、脾、肺、腎、卵巢、睪丸、胃、小腸、視網膜等臟器，肉眼觀察均未見明顯異常。部分臟器病理組織學切片鏡下檢查結果表明，給藥組與對照組上述臟器均未見明顯病變，詳見圖1-8。

圖1 小鼠急性毒性腦皮質組織病理變化（HE×400）

圖2 小鼠急性毒性心組織病理變化（HE×400）

圖3 小鼠急性毒性肝組織病理變化（HE×400）

4 討論

圖4 小鼠急性毒性脾組織病理變化（HE×400）

圖5 小鼠急性毒性肺組織病理變化（HE×400）

圖6 小鼠急性毒性腎組織病理變化（HE×400）

圖7 小鼠急性毒性胃組織病理變化（HE×400）

圖8 小鼠急性毒性視網膜組織病理變化（HE×400）

一般情況下，傳統中藥毒性很低，無法按常規方法測定LD50，故以最大給藥量進行急毒實驗。我們對密蒙花顆粒進行急性毒性試驗，觀察其對小鼠體質量的影響以及其對小鼠神經、胃腸、泌尿生殖、皮膚、毛及眼等的影響，給藥后連續觀察14 d，小鼠血液學指標及主要臟器指數與對照組比較無顯著差異，主要臟器的病理組織學亦未見明顯毒副反應。一般認為，按體質量計算，小鼠1日最大給藥量相當于臨床日用量的100倍以上則較為安全，可以提供臨床研究試用[11]。本實驗設計的小鼠日最大給藥量為114 g/kg，相當于臨床成人劑量的約317倍，本研究結果表明密蒙花顆粒毒性較小，在常規劑量下服用時安全可靠的。

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[11]謝秀瓊.中藥新制劑開發與應用[M].2版.北京:人民衛生出版社,2000:540.

（本文編輯 楊 瑛）

Acute Toxicity Test of Flos Buddlejae Granules

PENG Xiaofang,WANG Ying,QIN Genyan,ZHANG Youwei,PENG Jun,PENG Qinghua*
(Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To observe the acute toxic reaction of Flos Buddlejae granules and the situation of mice's death,to provide basis for the clinical safety of medication.Methods Having preliminary experiment on thirty mice with different concentrationsofsuspension liquid.Therewasnomice'sdeath in 7 days,LD50could notbeen detcted.Therefore,the maximum tolerance (MTD)was measured.Forty mice were randomly divided into the medicated group and the control group.In line with the maximum volume of the mice,the maximal suspension concentration of the Flos Buddlejae granules and the distilled water were separately given twice daily.Keeping the observation for 14 days,and recording the general condition and body mass in mice every day.After 14 days,the mice were killed.The blood routine indexes,and the major organs indexes of liver,spleen,kidneys and so on,the change of anatomy and pathological histology were observed.ResultsTherewasnomicedeath in medicated group.Compared with thecontrolgroup,thebodyweightofmice in medicated group had no significant changes (P＞0.05).The routine blood indexes in the medicated group were not significantly different (P＞0.05).The maximum tolerance dose of Flos Buddlejae granules in mice was 114 g/kg daily.Conclusion The acute toxicity result shows that the clinical dose of Flos Buddlejae granules is safe.

Flos Buddlejae granules;acute toxicity test;median lethal dose;maximum of tolerance dose

R285.5；R965.3

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.09.003

本文引用：彭曉芳，王 英，覃艮艷，張又瑋，彭 俊，彭清華.密蒙花顆粒的急性毒性實驗研究[J].湖南中醫藥大學學報，2017，37（9）：931-934.

2017-04-01

國家自然科學基金面上資助項目（30772824，81574031）；湖南省高層次衛生人才“225”工程培養項目資助；湖南省科技廳科研基金資助項目（2015SF2016-6）；湖南省發展改革委科研基金資助項目（湘發改投資[2014]658號）；長沙市科技計劃重大專項（K1501014-31）；湖南中醫藥大學研究生創新課題項目(2016CX19)。

彭曉芳,女，在讀碩士研究生,研究方向：眼表疾病。

* 彭清華,男，二級教授，主任醫師，博士研究生導師，E-mail：pqh410007@126.com。